Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (No. 81870432 e 81570567 a X.L.Z.), (No. 81571994 para P.N.S.); a Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (N. 2020A1515010054 para P.N.S.), Fundação Universidade Li Ka Shing Shantou (N. No. L1111 2008 para P.N.S.). Gostaríamos de agradecer ao Prof. Stanley Lin da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou por conselhos úteis.

1. Manutenção de células-tronco
NOTA: O protocolo de manutenção celular descrito abaixo se aplica à linha de células hES03 mantida em uma monocamada aderente. Para todos os protocolos a seguir neste manuscrito, as células devem ser manuseadas sob um gabinete de segurança biológica.
<ol><li>Prepare o meio de cultura de células-tronco 1x mTesR diluindo 5x meio suplementar para mTesR meio básico.</li>
	<li>Prepare o meio Matrigel qualificado em 30x hESC diluindo 5 mL de Matrigel qua...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

Aqui, apresentamos um método stepwise que induz os HLCs dos hESCs em três estágios. Na primeira etapa, Activin A e CHIR99021 foram utilizados para diferenciar os hESCs em DE. No segundo estágio, ko-DMEM e DMSO foram usados para diferenciar DE em células progenitoras hepáticas. No terceiro estágio, HZM mais HGF, OSM e hidrólio 21-hemisuccinato de sódio foram usados para continuar a diferenciar células progenitoras hepáticas em HLCs.
As seguintes etapas críticas devem ser levadas em ...

O fígado é um órgão altamente metabólico que desempenha vários papéis, incluindo desoxidação, armazenamento de glicogênio, e secreção e síntese de proteínas1. Vários patógenos, drogas e herediidade podem causar alterações patológicas no fígado e afetar suas funções2,3. Os hepatócitos, como a principal unidade funcional do fígado, desempenham um papel importante nos sistemas de apoio hepático artificial e na eliminação da toxicidade medicamentosa. No entanto, o recurso dos hepatócitos humanos primários é limitado na terapia baseada em células, bem como na pesquisa de doenças hepáticas. Portanto, desenvolver novas fontes de hepatócitos humanos funcionais é uma importante direção de pesquisa no campo da medicina regenerativa. Desde 1998, quando foram estabelecidos4,os hESCs têm sido amplamente considerados pelos pesquisadores devido ao seu potencial de diferenciação superior (eles podem se diferenciar em vários tecidos em um ambiente adequado) e alto grau de autoconexibilidade, e assim fornecer células de origem ideais para fígados bioartificial, transplante de hepatocito e até mesmo engenharia de tecido hepático5.
Atualmente, a eficiência de diferenciação hepática pode ser muito aumentada enriquecendo o endodermo6. Na diferenciação de linhagem das células-tronco em endoderme, os níveis do fator de crescimento transformador β (TGF-β) sinalização e vias de sinalização WNT são os fatores-chave no nó do estágio de formação do endoderme. A ativação de um alto nível de sinalização TGF-β e WNT pode promover o desenvolvimento do endodermo7,8. Activin A é uma citocina pertencente à superfamília TGF-β. Portanto, a Activin A é amplamente utilizada na indução de endoderme de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) e hESCs9,10. GSK3 é uma proteína de serina-threonina quinase. Pesquisadores descobriram que o CHIR99021, um inibidor específico do GSK3β, pode estimular sinais típicos de WNT, e pode promover a diferenciação de células-tronco sob certas condições, sugerindo que o CHIR99021 tem potencial para induzir a diferenciação de células-tronco no endóderme 11,12,13.
Aqui relatamos um método eficiente e reprodutível para induzir efetivamente a diferenciação dos hESCs em HLCs funcionais. A adição sequencial de Activin A e CHIR99021 produziu cerca de 89,7±0,8% de células SOX17 (marcador DE)positivos. Após serem ainda mais maturadas in vitro,essas células expressaram marcadores específicos hepáticos e exerceram morfologia semelhante a hepatocito (baseada na coloração de hematoxilina-eosina (H & E)) e funções, como absorção de verde indociina (ICG), armazenamento de glicogênio e atividade CYP3. Os resultados mostram que os hESCs podem ser diferenciados com sucesso em HLCs funcionais maduros por este método e podem fornecer uma base para pesquisas relacionadas a doenças hepáticas e triagem de medicamentos in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

As funções potenciais das células semelhantes a hepatócitos (HLCs) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm grande promessa para modelagem de doenças e aplicações de rastreamento de medicamentos. Fornecido aqui é um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hESCs em HLCs funcionais. O estabelecimento de uma linhagem de endoderm é um passo fundamental na diferenciação para os HLCs. Pelo nosso método, regulamos as principais vias de sinalização, suplementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE), seguido pela geração de células progenitoras hepáticas, e finalmente HLCs com morfologia hepatocitada típica em um método de estágio com reagentes completamente definidos. Os HLCs derivados do hESC produzidos por este método expressam marcadores específicos de palco (incluindo albumina, O receptor nuclear HNF4α e o polipeptídeo de cotransportamento de sódio (NTCP) e apresentam características especiais relacionadas a hepatócitos maduros e funcionais (incluindo coloração verde indocitana, armazenamento de glicogênio, coloração de hematoxilina-eosina e atividade CYP3), e pode fornecer uma plataforma para o desenvolvimento de aplicações baseadas em HLC no estudo de doenças hepáticas.

O diagrama esquemático da indução de HLC de hESCs e imagens representativas de campo brilhante de cada estágio de diferenciação são mostrados na Figura 1. No Estágio I, Activin A e CHIR99021 foram adicionados por 3 dias para induzir células-tronco a formar células de endoderme. No Estágio II, as células de endoderme se diferenciaram em células progenitoras hepáticas após serem tratadas com meio de diferenciação por 5 dias. Na Fase III, os hepatócitos precoces amadureceram e...

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An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).

Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Células hepatócitas derivadas de células-tronco humanas são úteis na modelagem de doenças e na triagem de medicamentos. Este é um método eficiente e reprodutível para induzir efetivamente a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células funcionais semelhantes a hepatócitos. Um status indiferenciado e a confluência apropriada das células-tronco embrionárias humanas são fundamentais para uma diferenciação bem sucedida das células semelhantes à hepatocita.Para manutenção de células-tronco, cubra placas estéreis de seis poços tratados com um mililitro de 1X matrigel embrionário humano qualificado por célula-tronco por poço, e armazene-as a quatro graus Celsius durante a noite. Deixe as placas em temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Descongele os HESEs preservados por crio-lírios em um banho de água de 37 graus Celsius por três minutos sem tremer, em seguida, transfira imediatamente as células-tronco pipetando-as em um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio mTESR pré-aquecido, 37 graus Celsius.Centrifugar os HESEs e aspirar o supernasce, em seguida, suspender suavemente as células em um mililitro de mTESR médio. Aspire o meio DMEM F-12 da placa. Semear as células em uma placa de seis poços a uma densidade de 1 x 10 para a 5ª células em dois mililitros de mTESR, e incubar em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%.Mantenha as células substituindo o meio por meio mTESR pré-aquecido diariamente. Passagem das células em cerca de 70 a 80% de confluência, ou quando as colônias celulares começam a fazer contato. Para a passagem de células, aspire o meio e incuba as células com um mililitro por poço de solução enzimápica por cinco minutos a 37 graus Celsius.Transfira as células pipetando-as para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo quatro mililitros de DMEM F-12 pré-aquecidos a 37 graus Celsius. Prepare placas de 24 poços revestindo-as com 250 microliters de 1X hESC-qualificados meio Matrigel. Seed hESCs a uma densidade de 1 a 1,5 vezes 10 para a 5ª células por poço em 500 microliters de mTESR médio.Adicione a ativação A a uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro e CHIR99021 a uma concentração final de três micromolares em um volume apropriado de meio básico de diferenciação pré-aquecido. Após três dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores de células de endoderme definitivas, como FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 e FOXA1. No terceiro dia de diferenciação, aspire o meio, substitua-o pela fase dois média, e incuba por 24 horas.Troque o meio a cada dois dias nos dias quatro a oito. Após oito dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores apropriados de células progenitoras hepáticas, como HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. No oitavo dia, aspire o estágio dois médio das células, e substitua-o por meio estágio três.Permita que as células incubam por 10 dias a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono, e mude a mídia a cada dois dias com fatores de diferenciação recém-adicionados. Após 18 dias de diferenciação, as células diferenciadas devem expressar marcadores característicos de hepatócitos, como AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4. O diagrama esquemático de células semelhantes a hepatócitos de hESCs e imagens de campo brilhantes de cada estágio de diferenciação são mostrados.Na primeira fase, a ativação A e CHIR99021 foram adicionadas por três dias para induzir células-tronco a formar células de endoderme. Na segunda fase, as células de endoderme se diferenciaram em células progenitoras hepáticas após serem tratadas com meio de diferenciação por cinco dias. Na terceira etapa, após 10 dias, os hepatócitos precoces amadureceram e se diferenciaram em células semelhantes a hepatócitos no fator de crescimento hepatocito e na oncostatina.Na fase final de diferenciação, as células apresentaram um fenótipo típico de hepatócito. RT-PCR, coloração de imunofluorescência e manchas ocidentais foram usados para detectar marcadores de células de endoderme, células precursoras hepáticas e hepatócitos maduros. As células diferenciadas apresentaram altos níveis de expressão de genes e proteínas relacionados à diferenciação em cada estágio, como marcadores de endoderme SOX17 no terceiro dia, marcador precursor hepático HNF4 alfa no oitavo dia, AFP no dia 14, e marcador hepatocito maduro ALB no dia 18.Os HLCs apresentaram coloração verde e extensa coloração de mudança de ácido citoplasmósmico. Os hepatócitos mostraram morfologia binucleada típica. A atividade enzimática do CYP3A4, o CYP metabólico essencial no fígado em HLCs, foi confirmada com um ensaio enzimático.O siting de células-tronco embrionárias humanas em uma densidade apropriada e a diferenciação inicial na data seguinte são críticos. No estágio um, toque a mídia suavemente porque as células são propensas a flutuar para cima. A combinação de ativação A e outras pequenas moléculas pode melhorar ainda mais a eficiência de diferenciação, e produzir células mais maduras semelhantes ao hepatocitado neste procedimento.Essa técnica pode fornecer uma plataforma para explorar transplante de hepatocita, engenharia de tecidos hepáticos, fígados bioartificial e modelagem de doenças.

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