Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 81870432 и 81570567 X.L.Z.), (No 81571994 P.N.S.); Фонд естественных наук провинции Гуандун, Китай (No 2020A1515010054 для P.N.S.), Фонд Университета Ли Ка Шин Шаньтоу (No. L1111 2008 в P.N.S.). Мы хотели бы поблагодарить профессора Стэнли Лина из Медицинского колледжа Университета Шаньтоу за полезные советы.

1. Поддержание стволовых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол поддержания клеток, описанный ниже, применяется к клеточной линии hES03, поддерживаемой в адгезивном монослое. Для всех следующих протоколов в этой рукописи клетки должны обрабатываться под шкафом биологической безопасн...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

Здесь мы представляем пошаговый метод, который индуцирует HLC из hESCs в три этапа. На первом этапе Activin A и CHIR99021 использовались для дифференциации hESCs в DE. На втором этапе KO-DMEM и DMSO использовали для дифференцировки DE в печеночные клетки-прогениторы. На третьем этапе HZM плюс HGF, OSM и гидрокортиз?...

Печень является высоко метаболическим органом, который играет несколько ролей, включая раскисление, хранение гликогена, а также секрецию и синтез белков1. Различные возбудители, лекарственные препараты и наследственность могут вызывать патологические изменения в печени и влиять на ее функции2,3. Гепатоциты, как основная функциональная единица печени, играют важную роль в искусственных системах поддержки печени и устранении лекарственной токсичности. Однако ресурс первичных гепатоцитов человека ограничен в клеточной терапии, а также в исследованиях заболеваний печени. Поэтому разработка новых источников функциональных гепатоцитов человека является важным направлением исследований в области регенеративной медицины. С 1998 года, когда были установлены4hESCs, hESCs широко рассматривались исследователями из-за их превосходного дифференцировального потенциала (они могут дифференцироваться в различные ткани в подходящей среде) и высокой степени самовозобновляемости, и, таким образом, обеспечивают идеальные исходные клетки для биоискусственной печени, трансплантации гепатоцитов и даже тканевой инженерии печени5.
В настоящее время эффективность дифференцировки печенки может быть значительно увеличена за счет обогащения энтодермы6. При линейной дифференцировке стволовых клеток в эндодерму ключевыми факторами в узле стадии формирования эндодермы являются уровни трансформировки фактора роста β (TGF-β) и сигнальных путей WNT. Активация высокого уровня TGF-β и сигнализации WNT может способствовать развитию эндодермы7,8. Активин А является цитокином, принадлежащим к надсемейству TGF-β. Поэтому Активин А широко используется в индукции эндодермы индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и hESCs9,10. GSK3 представляет собой серин-треонин протеинкиназу. Исследователи обнаружили, что CHIR99021, специфический ингибитор GSK3β, может стимулировать типичные сигналы WNT и может способствовать дифференцировке стволовых клеток при определенных условиях, предполагая, что CHIR99021 имеет потенциал для индуцирования дифференцировки стволовых клеток в эндодерму 11,12,13.
Здесь мы сообщаем об эффективном и воспроизводимом методе эффективного индуцирования дифференциации hESCs в функциональные HLC. Последовательное добавление активина А и CHIR99021 произвело около 89,7±0,8% SOX17 (DE маркер)-положительных клеток. После дальнейшего созревания in vitroэти клетки экспрессировали печеночные специфические маркеры и проявляли гепатоцитарно-подобную морфологию (основанную на окрашивание гематоксилин-эозином (H & E)) и функции, такие как поглощение индоцианинового зеленого (ICG), хранение гликогена и активность CYP3. Результаты показывают, что hESCs могут быть успешно дифференцированы в зрелые функциональные HLC с помощью этого метода и могут обеспечить основу для исследований, связанных с заболеваниями печени, и скрининга лекарств in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

Потенциальные функции гепатоцитоподобных клеток (ГЛК), полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs), имеют большие перспективы для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь приведен эффективный и воспроизводимый метод дифференциации гЭСК на функциональные КВУ. Создание линии эндодермы является ключевым шагом в дифференциации к КВУ. С помощью нашего метода мы регулировали ключевые сигнальные пути, непрерывно дополняя активин А и CHIR99021 во время дифференцировки hESC в окончательную эндодерму (DE), за которой следует генерация печеночных клеток-прогениторов и, наконец, HLC с типичной морфологией гепатоцитов поэтапным методом с полностью определенными реагентами. Полученные из hESC HLC, полученные этим методом, экспрессируют специфические для стадии маркеры (включая альбумин, ядерный рецептор HNF4α и котранспортный полипептид таурохолата натрия (NTCP)) и демонстрируют особые характеристики, связанные со зрелыми и функциональными гепатоцитами (включая зеленое окрашивание индоцианином, хранение гликогена, окрашивание гематоксилин-эозина и активность CYP3), и могут обеспечить платформу для разработки приложений на основе HLC в изучении заболеваний печени.

Принципиальная схема индукции ГЛК от гЭСК и репрезентативные изображения яркого поля каждой ступени дифференциации показаны на рисунке 1. На стадии I активин А и CHIR99021 добавляли в течение 3 дней, чтобы индуцировать стволовые клетки к образованию клеток эндодермы. На стад...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

В этой рукописи описывается подробный протокол дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) в функциональные гепатоцитоподобные клетки (HLC) путем непрерывного дополнения Activin A и CHIR99021 во время дифференцировки hESC в окончательную эндодерму (DE).

Эффективный метод направленной индукции гепатоцитоподобных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Гепатоцитоподобные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, полезны при моделировании заболеваний и скрининге лекарств. Это эффективный и воспроизводимый метод эффективного индуцирования дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в функциональные гепатоцитоподобные клетки. Недифференцированный статус и соответствующее слияние эмбриональных стволовых клеток человека имеют решающее значение для успешной дифференцировки с гепатоцитоподобными клетками.Для поддержания стволовых клеток покрывать стерильные шестилубчатые пластины, обработанные культурой тканей, одним миллилитром 1X человеческим эмбриональным стволовым клеткам, квалифицированным Matrigel на лунку, и хранить их при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Оставьте пластины при комнатной температуре на 30 минут перед использованием. Разморозьте крио-сохраненные HESEs на водяной бане с 37 градусами Цельсия в течение трех минут без встряхивания, а затем немедленно перенесите стволовые клетки, пипетировку их в 15-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую четыре миллилитра предварительно нагретой среды mTESR 37 градусов цельсия.Центрифугируйте ГЭС и аспирируйте супернатант, затем осторожно повторно суспендируйте клетки в одном миллилитрах среды mTESR. Аспирировать среду DMEM F-12 с пластины. Засейте клетки в шестискважную пластину с плотностью от 1 х 10 до 5-й клетки в двух миллилитрах мТЭЭ И инкубируют в инкубаторе диоксида углерода 5%.Поддерживайте клетки, заменяя среду на предварительно нагретую среду mTESR ежедневно. Прохождение клеток примерно при слиянии от 70 до 80% или когда колонии клеток начинают контактировать. Для прохождения клеток аспирируют среду и инкубируют клетки с одним миллилитром на лунку раствора фермента в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.Перенесите ячейки, пипетировку их в 15-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую четыре миллилитра DMEM F-12, предварительно нагретых до 37 градусов Цельсия. Подготовьте плиты из 24 скважин, покрыв их 250 микролитрами среды Matrigel, сертифицированной 1X hESC. Посевные гЭСК при плотности от 1 до 1,5 раз 10 до 5-й ячейки на лунку в 500 микролитрах среды мТЭЭШ.Добавьте оба активина А к конечной концентрации 100 нанограмм на миллилитр и CHIR99021 к конечной концентрации трех микромоляров в соответствующем объеме предварительно нагретой основной среды дифференцировки первой стадии. После трех дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать маркеры окончательных клеток эндодермы, таких как FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 и FOXA1. На третий день дифференцировки аспирируют среду, заменяют ее средой второй стадии и инкубируют в течение 24 часов.Меняйте среду через день в дни с четвертого по восьмой. После восьми дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать соответствующие маркеры печеночных клеток-прогениторов, таких как HNF4 альфа, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. На восьмой день аспирируют среду второй стадии из клеток и заменяют ее средой третьей стадии.Позвольте клеткам инкубироваться в течение 10 дней при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа и менять жиму через день со свежесыпустимыми факторами дифференцировки. После 18 дней дифференцировки дифференцированные клетки должны экспрессировать характерные маркеры гепатоцитов, такие как AAT, ALB, TTR, HNF4 альфа, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Показана принципиальная схема гепатоцитоподобных клеток из гЭСК и яркие полевые изображения каждой стадии дифференцировки.На первой стадии активин А и CHIR99021 добавляли в течение трех дней, чтобы индуцировать стволовые клетки к образованию клеток эндодермы. На второй стадии клетки эндодермы дифференцировались в печеночные клетки-прогениторы после обработки дифференцировочной средой в течение пяти дней. На третьей стадии, через 10 дней, ранние гепатоциты созревали и дифференцировались в гепатоцитоподобные клетки в факторе роста гепатоцитов и онкостатине.На заключительной стадии дифференцировки клетки показали типичный фенотип гепатоцитов. ОТ-ПЦР, иммунофлуоресцентное окрашивание и западное блоттинг использовались для обнаружения маркеров клеток эндодермы, клеток-предшественников печенки и зрелых гепатоцитов. Дифференцированные клетки показали высокие уровни экспрессии генов и белков, связанных с дифференцировкой, на каждой стадии, таких как маркеры эндодермы SOX17 на третий день, печеночно-предшественник-маркер HNF4 альфа на восьмой день, АФП на 14-й день и зрелый маркер гепатоцитов ALB на 18-й день.В CLC демонстрировали зеленое окрашивание и обширное окрашивание сдвигом цитоплазмоновой кислоты. Гепатоциты показали типичную двуядерную морфологию. Ферментативная активность CYP3A4, основного метаболического CYP в печени в ГЛК, была подтверждена с помощью ферментного анализа.Размещение эмбриональных стволовых клеток человека в соответствующей плотности и начало дифференцировки в следующую дату имеют решающее значение. На первой стадии осторожно прикасайтесь к среде, потому что клетки склонны всплывать вверх. Комбинация активина А и других малых молекул может еще больше повысить эффективность дифференцировки и произвести более зрелые гепатоцитоподобные клетки в этой процедуре.Этот метод может обеспечить платформу для изучения трансплантации гепатоцитов, инженерии тканей печени, биоискусственной печени и моделирования заболеваний.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Простой и эффективный способ изолировать Макрофаги из смешанного первичных культурах клеток взрослого организма Печень

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig основе искусственного антиген представляющих клеток для эффективного Исключая виво Расширение прав CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного<em&gt; In Vitro</em&gt; Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Вывод Т-клеток<em&gt; In Vitro</em&gt; От эмбриональных стволовых клеток мыши

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Модель олигодендроцит-направленного Т-клеток Атака в острых мозга Ломтики

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Оптимизированная метод выделения и расширение Инвариантные естественных киллеров Т-клеток из селезенки мыши

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Органоиды как модель для инфекционных болезней: Культура человека и мыши желудка органоидов и Микроинъекция Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Эффективное протокол Изоляция для B и Т-лимфоциты из небных миндалин человека

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...