Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Esta labor contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81870432 y 81570567 a X.L.Z.), (Nº 81571994 a P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 a P.N.S.). Nos gustaría agradecer al Prof. Stanley Lin de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shantou por sus útiles consejos.

1. Mantenimiento de células madre
NOTA: El protocolo de mantenimiento celular descrito a continuación se aplica a la línea celular hES03 mantenida en una monocapa adherente. Para todos los siguientes protocolos en este manuscrito, las células deben manejarse bajo un gabinete de seguridad biológica.
<ol><li>Prepare 1x mTesR stem cell culture medium diluyendo 5x supplementary medium to mTesR basic medium.</li>
	<li>Prepare 30x medio Matrigel calificado por hESC diluyendo 5 mL de Matrigel ...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

Aquí, presentamos un método gradual que induce HLCs de hESCs en tres etapas. En la primera etapa, Activin A y CHIR99021 se utilizaron para diferenciar hESCs en DE. En la segunda etapa, KO-DMEM y DMSO fueron utilizados para distinguir DE en las células hepáticas del progenitor. En la tercera etapa, HZM más HGF, OSM y la sal de sodio del hemisuccinate 21 de la hidrocortisona fueron utilizados para continuar diferenciando las células hepáticas del progenitor en HLCs.
Los siguientes pasos c...

El hígado es un órgano altamente metabólico que desempeña varias funciones, incluyendo la desoxidación, el almacenamiento de glucógeno, y la secreción y síntesis de proteínas1. Diversos patógenos, fármacos y herencia pueden causar cambios patológicos en el hígado y afectar sus funciones2,3. Los hepatocitos, como la unidad funcional principal del hígado, desempeñan un papel importante en sistemas artificiales de la ayuda del hígado y la eliminación de la toxicidad de la droga. Sin embargo, el recurso de hepatocitos humanos primarios es limitado en terapia basada en células, así como en la investigación de la enfermedad del higado. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas fuentes de hepatocitos humanos funcionales es una dirección de investigación importante en el campo de la medicina regenerativa. Desde 1998, cuando se han establecido las hESC4,las hESCs han sido ampliamente consideradas por los investigadores debido a su potencial de diferenciación superior (pueden diferenciarse en varios tejidos en un ambiente adecuado) y su alto grado de autorrerenovabilidad, y por lo tanto proporcionan células fuente ideales para hígados bioartificiales, trasplante de hepatocitos e incluso ingeniería de tejido hepático5.
Actualmente, la eficiencia de la diferenciación hepática puede incrementarse en gran medida enriqueciendo el endodermo6. En la diferenciación del linaje de las células madre en endodermo, los niveles del factor de crecimiento transformador β (TGF-β) señalización y WNT vías de señalización son los factores clave en el nodo de la etapa de formación de endodermo. La activación de un alto nivel de señalización de TGF-β y WNT puede promover el desarrollo de endodermo7,8. La activina A es una citoquina perteneciente a la superfamilia TGF-β. Por lo tanto, la activina A es ampliamente utilizada en la inducción de endodermo de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) y hESCs9,10. GSK3 es una proteína quinasa de serina-treonina. Los investigadores han encontrado que CHIR99021, un inhibidor específico de GSK3β, puede estimular las señales típicas de WNT, y puede promover la diferenciación de células madre bajo ciertas condiciones, lo que sugiere que CHIR99021 tiene potencial para inducir la diferenciación de células madre en endodermo 11,12,13.
Aquí divulgamos un método eficiente y reproducible para inducir con eficacia la diferenciación de hESCs en HLCs funcionales. La adición secuencial de Activin A y CHIR99021 produjo cerca de 89,7±0,8% SOX17 (marcador de DE) - células positivas. Después de ser maduradas más a fondo in vitro,estas células expresaron marcadores específicos hepáticos y ejercieron hepatocito-como la morfología (basada en la coloración de la hematoxylin-eosina (H . E)) y las funciones, tales como absorción del verde del indocyanine (ICG), almacenamiento del glicógeno y actividad CYP3. Los resultados muestran que los hESCs se pueden distinguir con éxito en HLCs funcionales maduros por este método y pueden proporcionar una base para la investigación enfermedad-relacionada del higado y la investigación in vitro de la droga.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

Las funciones potenciales de las células similares a hepatocitos (HLCs) derivadas de células madre embrionarias humanas (hESCs) son muy prometedoras para el modelado de enfermedades y las aplicaciones de detección de fármacos. Aquí se proporciona un método eficiente y reproducible para la diferenciación de hESCs en HLCs funcionales. El establecimiento de un linaje de endodermo es un paso clave en la diferenciación a hlcs. Por nuestro método, regulamos las vías de señalización clave mediante la suplementación continua de Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación de hESC en endodermo definitivo (DE), seguido de la generación de células progenitoras hepáticas, y finalmente HLCs con morfología de hepatocitos típicos en un método stagewise con reactivos completamente definidos. Los HLCs derivados de hESC producidos por este método expresan marcadores específicos de la etapa (incluyendo albúmina, receptor nuclear HNF4α y polipéptido cotransportante de taurocolato de sodio (NTCP)), y muestran características especiales relacionadas con hepatocitos maduros y funcionales (incluyendo tinción verde de indocianina, almacenamiento de glucógeno, tinción de hematoxilina-eosina y actividad cyp3), y pueden proporcionar una plataforma para el desarrollo de aplicaciones basadas en HLC en el estudio de enfermedades hepáticas.

El diagrama esquemático de la inducción de HLC a partir de hESCs y las imágenes representativas de campo brillante de cada etapa de diferenciación se muestran en la Figura 1. En la etapa I, Activin A y CHIR99021 fueron agregados por 3 días para inducir a las células madres para formar las células del endodermo. En la etapa II, las células del endodermo diferenciadas en células progenitoras hepáticas después de ser tratadas con medio de diferenciación durante 5 días. En el estadi...

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An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la diferenciación de células madres embrionarias humanas (hESCs) en hepatocito-como las células funcionales (HLCs) complementando continuamente Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación del hESC en el endodermo definitivo (DE).

Un Método Eficiente Para La Inducción De Células Dirigidas Hepatocitos-Como De Las Células Madre Embrionarias Humanas

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Las células similares a hepatocitos derivadas de células madre embrionarias humanas son útiles en el modelado de enfermedades y la detección de fármacos. Este es un método eficiente y reproducible para inducir eficazmente la diferenciación de las células madre embrionarias humanas en células funcionales similares a hepatocitos. Un estado indiferenciado y una confluencia apropiada de células madre embrionarias humanas son fundamentales para una diferenciación exitosa a células similares a hepatocitos.Para el mantenimiento de células madre, recubra placas estériles tratadas con cultivos de tejidos estériles de seis pozos con un mililitro de Matrigel calificado para células madre embrionarias humanas 1X por pozo, y guárdelas a cuatro grados Centígrados durante la noche. Deje las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso. Descongele las HESE crioconservadas en un baño de agua de 37 grados Celsius durante tres minutos sin agitar, luego transfiera inmediatamente las células madre pipeteándolas en un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio mTESR precalentado de 37 grados Celsius.Centrifugar las HESE y aspirar el sobrenadante, a continuación, volver a suspender suavemente las células en un mililitro de medio mTESR. Aspirar el medio DMEM F-12 de la placa. Sembrar las células en una placa de seis pozos a una densidad de 1 x 10 a las células 5 en dos mililitros de mTESR, e incubar en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.Mantenga las células reemplazando el medio con un medio mTESR precalentado diariamente. Pase las células en aproximadamente 70 a 80% de confluencia, o cuando las colonias celulares comienzan a hacer contacto. Para el paso de células, aspirar el medio e incubar las células con un mililitro por pozo de solución enzimática durante cinco minutos a 37 grados Centígrados.Transfiera las células pipeteándolas en un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de DMEM F-12 precalentados a 37 grados Centígrados. Prepare placas de 24 pozos recubriendolas con 250 microlitros de medio Matrigel calificado por 1X hESC. Semillas hESCs a una densidad de 1 a 1,5 veces 10 a la 5ª celda por pozo en 500 microlitros de medio mTESR.Añadir tanto la activina A a una concentración final de 100 nanogramos por mililitro como chir99021 a una concentración final de tres micromolares en un volumen adecuado de medio básico de diferenciación en fase uno precalentado. Después de tres días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores de células endodermas definitivas, como FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 y FOXA1. En el tercer día de diferenciación, aspirar el medio, reemplazarlo con el medio de etapa dos, e incubar durante 24 horas.Cambie el medio cada dos días en los días cuatro a ocho. Después de ocho días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores apropiados de células progenitoras hepáticas, como HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. En el día ocho, aspire el medio de la etapa dos de las células, y reemplácelo con el medio de la etapa tres.Permita que las células se incubarán durante 10 días a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono, y cambie el medio cada dos días con factores de diferenciación recién agregados. Después de 18 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores característicos de hepatocitos, como AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Se muestra el diagrama esquemático de células similares a hepatocitos de hESCs e imágenes de campo brillante de cada etapa de diferenciación.En la primera etapa, la activina A y CHIR99021 se agregaron durante tres días para inducir a las células madre a formar células endodermas. En la etapa dos, las células del endodermo se diferenciaron en células progenitoras hepáticas después de ser tratadas con un medio de diferenciación durante cinco días. En la etapa tres, después de 10 días, los hepatocitos tempranos habían madurado y distinguido en hepatocito-como las células en factor de crecimiento y oncostatin del hepatocito.En la etapa final de la diferenciación, las células demostraron un fenotipo típico del hepatocito. RT-PCR, la coloración de la inmunofluorescencia, y borrar occidental fueron utilizados para detectar a marcadores de las células del endodermo, de las células hepáticas del precursor, y de los hepatocitos maduros. Las células diferenciadas mostraron altos niveles de expresión de genes y proteínas relacionados con la diferenciación en cada etapa, como los marcadores de endodermo SOX17 en el día tres, la alfa hepática del marcador precursor HNF4 en el día ocho, AFP en el día 14 y el marcador de hepatocitos maduro ALB en el día 18.El HLCs exhibió la coloración verde y la coloración ácida citoplásmica extensa de la cambio. Los hepatocitos demostraron morfología bi-nucleated típica. La actividad enzimática de CYP3A4, la CYP metabólica esencial en el hígado en HLCs, fue confirmada con un análisis de la enzima.La ubicación de células madre embrionarias humanas con una densidad adecuada y el inicio de la diferenciación en la fecha siguiente son fundamentales. En la primera etapa, toque los medios suavemente porque las células son propensas a flotar hacia arriba. La combinación de activina A y otras moléculas pequeñas puede mejorar aún más las eficiencias de diferenciación y producir células más maduras similares a hepatocitos en este procedimiento.Esta técnica puede proporcionar una plataforma para explorar el trasplante de hepatocitos, la ingeniería de tejidos hepáticos, los hígados bioartificiales y el modelado de enfermedades.

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