Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81870432 och 81570567 till X.L.Z.), (nr 81571994 till P.N.S.); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2020A1515010054 till P.N.S.), Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 till P.N.S.). Vi vill tacka professor Stanley Lin från Shantou University Medical College för användbar rådgivning.

1. Underhåll av stamceller
OBS: Cellunderhållsprotokollet som beskrivs nedan gäller för hES03-cellinjen som upprätthålls i ett vidhäftande monoskikt. För alla följande protokoll i detta manuskript bör celler hanteras under ett biologiskt säkerhetsskåp.
<ol><li>Förbered 1x mTesR stamcellskulturmedium genom att späda ut 5x extra medium till mTesR basmedium.</li>
	<li>Förbered 30x hESC-kvalificerat Matrigel-medium genom att späda ut 5 ml hESC-kvalificerad Matrigel med 5 ml DMEM/...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

Här presenterar vi en stegvis metod som inducerar HLCs från hESCs i tre steg. I det första steget användes Activin A och CHIR99021 för att differentiera hESC till DE. I den andra etappen användes KO-DMEM och DMSO för att differentiera DE till lever stamceller. I den tredje etappen användes HZM plus HGF, OSM och hydrocortisone 21-hemisuccinate natrium salt för att fortsätta att differentiera lever stamceller i HLCs.
Följande kritiska steg måste beaktas när protokollet används. Cel...

Levern är ett mycket metaboliskt organ som spelar flera roller, inklusive deoxidation, lagring av glykogen och utsöndring och syntes avproteiner 1. Olika patogener, droger och äreditet kan orsaka patologiska förändringar i levern och påverka dess funktioner2,3. Hepatocyter, som leverns huvudsakliga funktionella enhet, spelar en viktig roll i artificiella leverstödsystem och läkemedelstoxicitet eliminering. Resursen för primära mänskliga hepatocyter är dock begränsad i cellbaserad terapi, liksom i leversjukdomsforskning. Därför är utveckling av nya källor till funktionella mänskliga hepatocyter en viktig forskningsriktning inom regenerativ medicin. Sedan 1998 när hESCs har etablerats4, hESCs har allmänt övervägts av forskare på grund av deras överlägsna differentiering potential (de kan differentiera i olika vävnader i en lämplig miljö) och hög grad av självförnyelse, och därmed ge idealiska källceller för bioartificial lever, hepatocyt transplantation och även levervävnadsteknik5.
För närvarande kan leverdifferenseffektiviteten ökas kraftigt genom att berika endodermen6. I härstamning differentiering av stamceller till endoderm, nivåer av den transformerande tillväxtfaktorn β (TGF-β) signalering och WNT signalering vägar är de viktigaste faktorerna i noden i endoderm bildandet steg. Aktivering av en hög nivå av TGF-β och WNT signalering kan främja utvecklingen av endoderm7,8. Activin A är en cytokin som tillhör TGF-β superfamilj. Därför används Activin A ofta vid induktion av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och hESCs9,10. GSK3 är ett serin-treoninproteinkinas. Forskare har funnit att CHIR99021, en specifik hämmare av GSK3β, kan stimulera typiska WNT-signaler och kan främja stamcellsdifferimering under vissa förhållanden, vilket tyder på att CHIR99021 har potential att inducera stamcells differentiering till endoderm 11,12,13.
Här rapporterar vi en effektiv och reproducerbar metod för att effektivt inducera differentiering av hESCs till funktionella HLCs. Den sekventiella tillsatsen av Activin A och CHIR99021 producerade cirka 89,7±0,8% SOX17 (DE-markör)-positiva celler. Efter att ha mognat in vitrouttryckte dessa celler leverspecifika markörer och utövade hepatocytliknande morfologi (baserat på hematoxylin-eosinfärgning (H & E)) och funktioner, såsom upptag av indocyaningrön (ICG), glykogenlagring och CYP3-aktivitet. Resultaten visar att hESCs framgångsrikt kan differentieras till mogna funktionella HLCs med denna metod och kan ge en grund för leversjukdomsrelaterad forskning och in vitro-läkemedelsscreening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

De potentiella funktionerna hos hepatocytliknande celler (HLC) som härrör från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) håller stora löften om sjukdomsmodellering och läkemedelsscreeningsapplikationer. Här tillhandahålls en effektiv och reproducerbar metod för differentiering av hESC:er till funktionella HLC:er. Upprättandet av en endoderm-härstamning är ett viktigt steg i differentieringen till HLCs. Med vår metod reglerar vi de viktigaste signalvägarna genom att kontinuerligt komplettera Activin A och CHIR99021 under hESC differentiering till slutgiltig endokderm (DE), följt av generering av lever stamceller, och slutligen HLCs med typiska hepatocyt morfologi i ett stegvis metod med helt definierade reagenser. HESC-härledda HLC som produceras med denna metod uttrycker scenspecifika markörer (inklusive albumin, HNF4α nukleär receptor och natriumtaurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), och visa särskilda egenskaper relaterade till mogna och funktionella hepatocyter (inklusive indocyanin grön färgning, glykogen lagring, hematoxylin-eosin färgning och CYP3 verksamhet), och kan ge en plattform för utveckling av HLC-baserade tillämpningar i studien av leversjukdomar.

Det schematiska diagrammet över HLC-induktion från hESCs och representativa ljusfältsbilder av varje differentieringssteg visas i figur 1. I steg I tillsattes Activin A och CHIR99021 i 3 dagar för att inducera stamceller att bilda endodermceller. I steg II differentierade endodermcellerna till lever stamceller efter att ha behandlats med differentiering medium i 5 dagar. I steg III hade tidiga hepatocyter mognat och differentierats till CHLC efter 10 dagar i HGF och OSM<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) till funktionella hepatocytliknande celler (HLCs) genom att kontinuerligt komplettera Activin A och CHIR99021 under hESC-differentiering till slutgiltig endokderm (DE).

En effektiv metod för riktad hepatocytliknande cellinduktion från mänskliga embryonala stamceller

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Mänskliga embryonala stamcellsbaserade hepatocytliknande celler är användbara vid sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening. Detta är en effektiv och reproducerbar metod för att effektivt inducera differentiering av mänskliga embryonala stamceller till funktionella hepatocytliknande celler. En odifferentierad status och lämpligt sammanflöde av mänskliga embryonala stamceller är avgörande för en framgångsrik differentiering till hepatocytliknande celler.För stamcellsunderhåll, belägga sterila sex-brunns vävnad kulturbehandlade plattor med en milliliter 1X mänskliga embryonala stamcellskvalificerade Matrigel per brunn och lagra dem vid fyra grader Celsius över natten. Lämna plattorna i rumstemperatur i 30 minuter före användning. Tina de kryobevarade HESEs i ett 37 grader Celsius vattenbad i tre minuter utan att skaka, överför sedan omedelbart stamcellerna genom att pipettera dem till ett 15-milliliter centrifugerrör som innehåller fyra milliliter förvärmt, 37 grader Celsius mTESR medium.Centrifugera HESEs och aspirera supernaten och suspendera sedan försiktigt cellerna i en milliliter mTESR-medium. Aspirera DMEM F-12 medium från plattan. Frö cellerna till en sexbrunnsplatta med en densitet av 1 x 10 till de 5: e cellerna i två milliliter mTESR och inkubera i en 5%koldioxidinkubator.Underhåll cellerna genom att ersätta mediet med förvärmt mTESR-medium dagligen. Passage cellerna vid ungefär 70 till 80% sammanflöde, eller när cellkolonierna börjar få kontakt. För celler som passaging, aspirera mediet och inkubera cellerna med en milliliter per enzymlösning i fem minuter vid 37 grader Celsius.Överför cellerna genom att pipetting dem till en 15 milliliter centrifuge rör som innehåller fyra milliliter DMEM F-12 förvärmda till 37 grader Celsius. Förbered 24-brunnsplattor genom att täcka dem med 250 mikroliter 1X hESC-kvalificerat Matrigel-medium. Frö hESCs med en densitet av 1 till 1,5 gånger 10 till 5: e cellerna per brunn i 500 mikroliter mTESR medium.Tillsätt både aktivin A till en slutlig koncentration på 100 nanogram per milliliter och CHIR99021 till en slutlig koncentration av tre mikromolar i en lämplig volym förvärmt steg ett differentieringsgrundmedium. Efter tre dagars differentiering bör differentierade celler uttrycka markörer för definitiva endodermceller, såsom FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 och FOXA1. På dag tre av differentiering, aspirera mediet, ersätt det med steg två medium och inkubera i 24 timmar.Byt medium varannan dag dag dag fyra till åtta. Efter åtta dagars differentiering bör differentierade celler uttrycka lämpliga markörer för leverprogenitorceller, såsom HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. På dag åtta, aspirera scenen två medium från cellerna och ersätt det med steg tre medium.Låt celler inkubera i 10 dagar vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator och ändra media varannan dag med nytillsatta differentieringsfaktorer. Efter 18 dagars differentiering bör differentierade celler uttrycka karakteristiska markörer för hepatocyter, såsom AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Det schematiska diagrammet över hepatocytliknande celler från hESCs och ljusa fältbilder av varje differentieringssteg visas.I steg ett tillsattes aktivin A och CHIR99021 i tre dagar för att inducera stamceller att bilda endodermceller. I steg två differentierade endodermcellerna till lever stamceller efter att ha behandlats med ett differentieringsmedium i fem dagar. I steg tre, efter 10 dagar, hade tidiga hepatocyter mognat och differentierats till hepatocytliknande celler i hepatocyt tillväxtfaktor och onkostatin.I det sista steget av differentiering visade celler en typisk hepatocyt fenotyp. RT-PCR, immunofluorescens färgning och västra blotting användes för att upptäcka markörer av endoderm celler, lever föregångare celler och mogna hepatocyter. De differentierade cellerna visade höga uttrycksnivåer av differentieringsrelaterade gener och proteiner i varje steg, såsom endoderm markörer SOX17 på dag tre, leverprekursor markör HNF4 alfa på dag åtta, AFP på dag 14 och mogen hepatocyt markör ALB dag 18.HLCs uppvisade grön färgning och omfattande cytoplasmic syra skift färgning. Hepatocyterna visade typiska bi-nucleated morfologi. Enzymatisk aktivitet av CYP3A4, den väsentliga metaboliska CYP i levern i HLCs, bekräftades med en enzym analys.Det är viktigt att sitta med mänskliga embryonala stamceller med lämplig densitet och börja differentiera följande datum. I steg ett, rör media försiktigt eftersom cellerna är benägna att flyta upp. Kombinationen av aktivin A och andra små molekyler kan ytterligare förbättra differentieringseffektiviteten och producera mer mogna hepatocytliknande celler i detta förfarande.Denna teknik kan ge en plattform för att utforska hepatocyt transplantation, levervävnadsteknik, bioartificial lever och sjukdom modellering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

En enkel och effektiv metod att isolera Makrofager från Blandad Primär Cultures of Adult leverceller

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimerade protokoll för effektiv Transfektion av dendritiska celler utan cellmognaden

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-IG Baserat Konstgjord antigenpresenterande celler för effektiv Ex vivo Utbyggnad av mänskliga CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Riktad Differentiering av inducerade pluripotenta stamceller mot T-lymfocyter

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Härledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Från Mouse embryonala stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell av en Oligodendrocyte styrt T-Cell Attack i akut hjärnan skivor

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimerad metod för att isolera och utöka Invariant Natural Killer T-celler från musmjälte

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som modell för Infektionssjukdomar: Culture of Human och Murina mage Organoids och mikroinjektion av Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effektiv Isolation Protokoll för B- och T-lymfocyter från Human Palatine tonsiller

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...