Name: an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81870432 Ve X.L.Z.'ye 81570567), (P.N.S.'e 81571994) tarafından desteklendi; Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (No. 2020A1515010054 ila P.N.S.), Li Ka Shing Shantou Üniversitesi Vakfı (No. L1111 2008'den P.N.S.'ye). Shantou Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Prof. Stanley Lin'e faydalı tavsiyeler için teşekkür ederiz.

1. Kök hücre bakımı
NOT: Aşağıda açıklanan hücre bakım protokolü, bir yapışan monolayerde tutulan hES03 hücre hattı için geçerlidir. Bu yazıda yer alan aşağıdaki tüm protokoller için hücreler biyolojik bir güvenlik kabini altında ele alınmalıdır.
<ol><li>5x ek ortamı mTesR temel ortamına seyrelterek 1x mTesR kök hücre kültürü ortamı hazırlayın.</li>
	<li>5 mL hESC nitelikli Matrigel'i buz üzerinde 5 mL DMEM/F12 ile seyrelterek 30x hESC nitelikli Matri...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

Burada, HESC'lerden HLC'leri üç aşamada indükleyen adım adım bir yöntem sunuyoruz. İlk aşamada, Activin A ve CHIR99021 HESC'leri DE'ye ayırt etmek için kullanıldı. İkinci aşamada KO-DMEM ve DMSO, DE'yi hepatik progenitör hücrelere ayırt etmek için kullanıldı. Üçüncü aşamada, hepatik progenitör hücreleri HLC'lere ayırmaya devam etmek için HZM artı HGF, OSM ve hidrokortizon 21-hemisuccinate sodyum tuzu kullanıldı.
Protokol kullanırken aşağıdaki kritik adımla...

Karaciğer, deoksidasyon, glikojen depolama ve proteinlerin salgılanması ve sentezi dahil olmak üzere çeşitli roller oynayan son derece metabolik bir organdır1. Çeşitli patojenler, ilaçlar ve heredite karaciğerde patolojik değişikliklere neden olabilir ve işlevlerini etkileyebilir2,3. Karaciğerin ana fonksiyonel birimi olarak hepatositler, yapay karaciğer destek sistemlerinde ve ilaç toksisitesinin ortadan kaldırılmasında önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, primer insan hepatatositlerinin kaynağı hücre bazlı tedavide ve karaciğer hastalığı araştırmalarında sınırlıdır. Bu nedenle, fonksiyonel insan hepatatlarının yeni kaynaklarının geliştirilmesi, rejeneratif tıp alanında önemli bir araştırma yönüdür. HESC'lerin kurulduğu 1998 yılından bu yana4, hESC'ler üstün farklılaşma potansiyelleri (uygun bir ortamda çeşitli dokulara farklılaşabilirler) ve yüksek derecede kendini yenileyebilmeleri nedeniyle araştırmacılar tarafından yaygın olarak kabul edilmiştir ve böylece biyoartificial karaciğerler, hepatosit transplantasyonu ve hatta karaciğer doku mühendisliği için ideal kaynak hücreler sağlar5.
Şu anda, hepatik farklılaşma verimliliği büyük ölçüde artırılabilir endoderm6. Kök hücrelerin endoderm haline gelen soy farklılaşmasında, dönüşen büyüme faktörü β (TGF-β) sinyalizasyon seviyeleri ve WNT sinyal yolları endoderm oluşum aşamasının düğümündeki temel faktörlerdir. TGF-β ve WNT sinyalizasyonunun üst düzey aktivasyonu endoderm7,8gelişimini teşvik edebilir. Activin A, TGF-β'a ait bir sitokindir. Bu nedenle, Activin A yaygın insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin endoderm indüksiyonunda kullanılır (hiPSC' ler) ve hESC9,10. GSK3 serine-threonine protein kinazdır. Araştırmacılar, GSK3β'nin belirli bir inhibitörü olan CHIR99021'in tipik WNT sinyallerini uyarabileceğini ve belirli koşullar altında kök hücre farklılaşmasını teşvik edebildiğine ulaşarak, CHIR99021'in kök hücre farklılaşmasına endoderm 11 , 12,13'e indükleme potansiyeline sahip olduğunu öne sürmektedir.
Burada, HESC'lerin fonksiyonel HLC'lere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem rapor ediyoruz. Activin A ve CHIR99021'in sıralı ilavesi yaklaşık% 89.7±0.8 SOX17 (DE belirteci) pozitif hücreler üretti. Daha fazla olgunlaştıktan sonra in vitro, bu hücreler hepatik spesifik belirteçleri ifade etti ve hepatosit benzeri morfoloji (hematoksilin-eozin boyama (H & E) ve indocyanine yeşili (ICG), glikojen depolama ve CYP3 aktivitesi gibi işlevler uyguladı. Sonuçlar, hESK'lerin bu yöntemle olgun fonksiyonel HLC'lere başarılı bir şekilde farklılaştırılabileceğini ve karaciğer hastalığına bağlı araştırmalara ve in vitro ilaç taramasına zemin hazırladığını göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

İnsan embriyonik kök hücrelerinden (HESC) elde edilen hepatotit benzeri hücrelerin (LC' ler) potansiyel işlevleri hastalık modelleme ve ilaç tarama uygulamaları için büyük umut vaat ediyor. Burada, hESC'lerin fonksiyonel HLC'lere farklılaştırılması için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlanmaktadır. Endoderm soyunun kurulması, HLC'lere farklılaşmada önemli bir adımdır. Yöntemimizle, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021'i sürekli olarak kesin endoderm (DE) olarak destekleyerek, ardından hepatik progenitör hücrelerin üretilmesini ve son olarak tipik hepatosit morfolojisine sahip HLC'leri tamamen tanımlanmış reaktiflerle evre yönünde bir yöntemle düzenleyerek anahtar sinyal yollarını düzenliyoruz. Bu yöntemle üretilen hESC türevi HBC'ler sahne alanına özgü belirteçleri (albümin dahil, HNF4α nükleer reseptör ve sodyum taurokolat kotransporting polipeptid (NTCP)) ve olgun ve fonksiyonel hepatositlerle ilgili özel özellikler gösterir (indocyanine yeşil lekelenme, glikojen depolama, hematoksilin-eozin boyama ve CYP3 aktivitesi dahil) ve karaciğer hastalıkları çalışmasında HLC tabanlı uygulamaların geliştirilmesi için bir platform sağlayabilir.

HESC'lerden HLC indüksiyonunun şematik diyagramı ve her farklılaşma aşamasının temsili parlak alan görüntüleri Şekil 1'degösterilmiştir. Aşama I'de, kök hücreleri endoderm hücreleri oluşturmaya teşvik etmek için 3 gün boyunca Activin A ve CHIR99021 eklendi. Evre II'de endoderm hücreleri 5 gün boyunca farklılaşma ortamı ile tedavi edildikten sonra hepatik progenitör hücrelere farklılaştı. Evre III'te erken hepatositler HGF ve OSM'de 10 gün sonra olgunlaşmış...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

Bu makalede, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021'in kesin endoderm (DE) olarak sürekli olarak takviye edilmesiyle insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC' ler) fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere (HLC) farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Hepatosit Benzeri Hücre İndüksiyonu İçin Etkili Bir Yöntem

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

İnsan embriyonik kök hücre türevi hepatosit benzeri hücreler hastalık modelleme ve ilaç taramasında faydalıdır. Bu, insan embriyonik kök hücrelerinin fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Farklılaşmamış bir durum ve insan embriyonik kök hücrelerinin uygun bir şekilde birleşmesi, hepatosit benzeri hücrelere başarılı bir farklılaşma için kritik öneme sahiptir.Kök hücre bakımı için, steril altı kuyu doku kültürü ile işlenmiş plakaları kuyu başına bir mililitre 1X insan embriyonik kök hücre nitelikli Matrigel ile kaplayın ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Plakaları kullanmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Kriyo ile korunmuş HES'leri 37 santigrat derecelik su banyosunda üç dakika boyunca titremeden çözün, ardından kök hücreleri hemen dört mililitre önceden ısıtılmış, 37 santigrat santigrat derece mTESR ortamı içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleterek aktarın.HESE'leri santrifüj edin ve süpernatantı epire edin, ardından hücreleri bir mililitre mTESR ortamında hafifçe yeniden askıya alın. DMEM F-12 ortamını plakadan aspire edin. Hücreleri iki mililitre mTESR'de 1 x 10'dan 5.hücrelere kadar olan yoğunlukta altı kuyulu bir tabağa tohumlayın ve% 5 karbondioksit inkübatöründe kuluçkaya yatırın.Ortamı her gün önceden ısıtılmış mTESR ortamıyla değiştirerek hücreleri koruyun. Hücreleri kabaca% 70 ila 80 birleştiğinde veya hücre kolonileri temas etmeye başladığında geçiş yapın. Geçen hücreler için, ortamı epire edin ve hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca enzim çözeltisi başına bir mililitre ile kuluçkaya yatırın.Hücreleri, önceden 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış dört mililitre DMEM F-12 içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetle aktarın. 24 kuyu plakalarını 250 mikrolitre 1X hESC nitelikli Matrigel ortamı ile kaplayarak hazırlayın. 500 mikrolitre mTESR ortamında kuyu başına 1 ila 1,5 kat 10 ila 5.Her iki aktivin A'yı mililitre başına 100 nanogramlık son konsantrasyona ve CHIR99021'i önceden ısıtılmış birinci aşama ayırt etme temel ortamının uygun hacminde üç mikromolar son konsantrasyona ekleyin. Üç günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış hücreler FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 ve FOXA1 gibi kesin endoderm hücrelerinin işaretlerini ifade etmelidir. Farklılaşmanın üçüncü gününde, ortamı aspire edin, ikinci aşama ortamla değiştirin ve 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.Ortamı dört ila sekiz gün arasında iki günde bir değiştirin. Sekiz günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış hücreler HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA gibi hepatik progenitör hücrelerin uygun belirteçlerini ifade etmelidir. Sekizinci günde, ikinci aşamayı hücrelerden epire edin ve üçüncü aşama ortamla değiştirin.Hücrelerin karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede 10 gün kuluçkaya yatmasına izin verin ve her gün medyayı yeni eklenen farklılaşma faktörleriyle değiştirin. 18 günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış hücreler AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4 gibi hepatositlerin karakteristik belirteçlerini ifade etmelidir. HESC'lerden hepatatosit benzeri hücrelerin şematik diyagramı ve her farklılaşma aşamasının parlak alan görüntüleri gösterilir.Birinci aşamada, kök hücreleri endoderm hücreleri oluşturmaya teşvik etmek için üç gün boyunca activin A ve CHIR99021 eklendi. İkinci evrede endoderm hücreleri beş gün boyunca bir farklılaşma ortamı ile tedavi edildikten sonra hepatik progenitör hücrelere farklılaştı. Üçüncü evrede, 10 gün sonra, erken hepatositler hepatosit büyüme faktöründe ve onkostatinde hepatosit benzeri hücrelere olgunlaşmış ve farklılaşmıştır.Farklılaşmanın son aşamasında, hücreler tipik bir hepatosit fenotipi gösterdi. Endoderm hücrelerinin, hepatik öncül hücrelerin ve olgun hepatositlerin belirteçlerini tespit etmek için RT-PCR, immünoresans lekeleme ve batı şişkinliği kullanıldı. Farklılaştırılmış hücreler, üçüncü günde endoderm belirteçleri SOX17, sekizinci günde hepatik öncü işaretleyici HNF4 alfa, 14. günde AFP ve 18. günde olgun hepatosit belirteci ALB gibi her aşamada farklılaşmaya bağlı gen ve proteinlerin yüksek ekspresyon seviyelerini gösterdi.HLC'lerde yeşil lekeleme ve geniş sitoplazmik asit kayması lekesi sergilendi. Hepatositler tipik çift çekirdekli morfoloji gösterdi. HLC'lerde karaciğerdeki temel metabolik CYP olan CYP3A4'ün enzimatik aktivitesi bir enzim tahlili ile doğrulandı.İnsan embriyonik kök hücrelerinin uygun yoğunlukta oturması ve aşağıdaki tarihte farklılaşmaya başlaması kritik öneme sahiptir. Birinci aşamada, hücreler yukarı doğru yüzmeye eğilimli olduğundan medyaya hafifçe dokunun. Aktiv A ve diğer küçük moleküllerin kombinasyonu, farklılaşma verimliliklerini daha da artırabilir ve bu prosedürde daha olgun hepatosit benzeri hücreler üretebilir.Bu teknik hepatosit nakli, karaciğer doku mühendisliği, biyoartificial karaciğerler ve hastalık modellemesini keşfetmek için bir platform sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

T hücrelerinin türetilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Fare Embriyonik Kök Hücreleri

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Enfeksiyon Hastalıkları Modeli Olarak Organoids: Helicobacter Pylori ve İnsan Kültür ve kemirgen Mide Organoids ve Mikroenjeksiyon

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...