Name: utilizing time-resolved protein-induced fluorescence enhancement to identify stable local conformations one &#945;-synuclein monomer at a time
Uploaded: 2021-05-30T14:00:00
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编码A56C α-Syn突变体的pT-t7质粒是作为Asaf Grupi博士，Dan Amir博士和Elisha Haas博士的礼物送给我们的。本文得到了美国国立卫生研究院（NIH，授予R01 GM130942给E.L.作为子奖），以色列科学基金会（KillCorona - 遏制冠状病毒研究计划中的3565/20赠款），米尔纳基金和耶路撒冷希伯来大学（启动基金）的支持。

1. 质粒转化
<ol><li>制备0.5 L SOC培养基<ol>
<li>称取10克色蛋白酮，2.5克酵母提取物，0.25克氯化钠（NaCl），0.1克氯化钾（KCl）。</li>
		<li>加入双蒸馏水（DDW），直至总体积为0.5升。</li>
		<li>通过加入氢氧化钠（NaOH）调节至pH 7。</li>
		<li>准备100 mL的配分试样和高压灭菌器。</li>
		<li>使用前，将0.5毫升无菌氯化镁（MgCl2）和1.8毫升无菌葡萄糖加入100毫升SOC中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在冰上解冻BL21（...

进行了广泛的生化和生物物理研究，以研究α-Syn的结构特征及其无序性质33，34，35，36，37，38。一些工作已经利用自由扩散的smFRET来研究无结合的α-Syn单体的分子内动力学。这些工作报告了α-Syn的高动态异质性，这导致在通过共聚焦点的典型扩散时...

在过去的二十年中，基于单分子荧光的方法已成为测量生物分子1，2的强大工具，探索不同的生物分子参数如何分布以及它们如何在亚毫秒分辨率3，4，5下动态地在这些参数的不同亚群之间相互转换。这些技术中的参数包括FRET测量的能量传递效率6，7，荧光各向异性8，9，荧光量子产率和寿命10，11，作为不同荧光猝灭12或增强13机制的函数。其中一种机制，更广为人知的是蛋白质诱导荧光增强（PIFE）14，引入了荧光量子产率和寿命的增强，作为激发态时荧光团自由异构化的空间位阻的函数，由染料附近的蛋白质表面引起14，15，16，17，18，19.FRET和PIFE都被认为是光谱尺或接近传感器，因为它们的测量参数与被测量的标记生物分子内的空间测量直接相关。虽然FRET效率与3-10 nm20范围内一对染料之间的距离有关，但PIFE跟踪荧光量子产量的增加或寿命与染料与附近蛋白质表面之间的距离在0-3 nm19范围内有关。
单分子FRET已被广泛用于为许多不同的蛋白质系统提供结构见解，包括内在无序蛋白质（IDPs）21，如α-突触核蛋白（α-Syn）22。α-Syn在与不同的生物分子结合后，在不同的条件下可以形成有序的结构23，24，25，26，27，28，29，30。然而，当未结合时，α-Syn单体的特征在于具有高构象异质性，具有快速相互转化的构象31，32。
α-Syn的构象以前已经使用各种不同的技术进行了研究，这些技术有助于识别这种高度异质和动态的蛋白质系统的构象动力学33，34，35，36，37，38，39。有趣的是，缓冲液中α-Syn的单分子FRET（smFRET）测量报告了单个FRET群体39，40，这是构象的时间平均动态相互转换的结果，其时间比α-Syn通过共聚焦点的典型扩散时间快得多（相对于典型的毫秒扩散时间，时间快到几微秒，甚至比这更快）40， 41.然而，使用具有3-10nm距离灵敏度的FRET光谱标尺有时只能报告小蛋白质（如α-Syn）的整体结构变化。利用具有较短距离灵敏度的光谱接近传感器进行单分子测量有可能报告局部结构的动力学。在这里，我们对α-Syn进行单分子PIFE测量，并确定荧光寿命的不同亚群映射到不同的局部结构，它们之间的过渡速度慢至100 ms。这项工作总结了自由扩散的α-Syn分子的时间分辨smPIFE测量值，一次一个，在缓冲液中，以及当与基于SDS的膜结合时作为短程单分子光谱接近传感器。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merc</td>
			<td>C7715</td>
			<td>cutoff: 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube</td>
			<td>Gene Bio-Application</td>
			<td>MEGA320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast SeeBand staining solution</td>
			<td>Gene Bio-Application</td>
			<td>SB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Desalting 5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ column</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein LoBind tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108094</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse a &#181;-slide 18</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas</td>
			<td>mini-plast</td>
			<td>815-004-05-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-Cy3&#160;maleimide</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab146493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing time-resolved protein-induced fluorescence enhancement to identify stable local conformations one &#945;-synuclein monomer at a time

使用光谱标尺来跟踪单个生物分子及其动力学的多种构象，彻底改变了对结构动力学及其对生物学的贡献的理解。虽然基于FRET的标尺报告了3-10nm范围内的染料间距离，但其他光谱技术，如蛋白质诱导荧光增强（PIFE），报告了染料与蛋白质表面在较短的0-3nm范围内的接近度。无论选择哪种方法，它在测量自由扩散的生物分子时的使用一次一个检索实验参数的直方图，产生单独的中心分布的生物分子亚群，其中每个亚群代表在毫秒内保持不变的单个构象，或者相互转换速度远快于毫秒的多个构象，因此平均输出子群。在单分子FRET中，直方图中报告的参数是染料间FRET效率，一种内在无序的蛋白质，例如缓冲液中的α-突触核蛋白单体，先前被报道为表现出多个构象的单个平均亚群快速相互转化。虽然这些过去的发现取决于基于FRET的标尺的3-10nm范围，但我们试图使用单分子PIFE对这种蛋白质进行测试，在那里我们跟踪位点特异性sCy3标记的α突触核蛋白的荧光寿命一次一个。有趣的是，使用这种较短距离的光谱接近传感器，sCy3标记的α-突触核蛋白表现出几个具有明显不同平均寿命的寿命亚群，在10-100 ms内相互转换。这些结果表明，虽然α-突触核蛋白可能在全球范围内紊乱，但它仍然获得了稳定的局部结构。总之，在这项工作中，我们强调了使用不同光谱接近传感器的优势，这些传感器一次跟踪一个生物分子的局部或全局结构变化。

作为IDP，当它不与另一种生物分子结合时，α-Syn表现出多种构象之间的结构动力学，在几微秒40甚至数百纳秒41下过渡 。当α-Syn穿过共聚焦点时，它可能会在构象之间经历数千次转变。事实上，当smFRET使用39，40时就是这种情况。在这里，我们进行smPIFE测量，以探测α-Syn的局部构象动力学。
测量记...

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Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

时间分辨单分子蛋白诱导的荧光增强是一种有用的荧光光谱接近传感器，对蛋白质的局部结构变化敏感。在这里，我们展示了它可用于揭示α-突触核蛋白中稳定的局部构象，当使用较长距离的FRET标尺测量时，这也称为球状非结构化和不稳定。

利用时间分辨蛋白诱导的荧光增强来鉴定稳定的局部构象，一次一α-突触核蛋白单体

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

在研究蛋白质结构亚群和构象时，单分子，蛋白质诱导的荧光增强可以补充单分子FRET测量，特别是在不同的结构亚群报告稳定的局部结构的情况下。该技术的主要优点是，它根据染料标记位点到蛋白质表面的附近捕获不同的位点特异性结构亚群。单分子，蛋白质诱导的荧光增强可以应用于任何感兴趣的生物分子系统，以探测不同的，局部的，结构的亚群。首先在低蛋白结合管的测量缓冲液中制备25皮摩尔磺酰磺酰-Cy3标记的α-突触核蛋白。将100微升每毫升1毫克BSA加入18腔显微镜盖玻片中并孵育一分钟，然后丢弃BSA。将100微升25皮摩尔磺酰基-Cy3标记的α-突触核蛋白样品加入盖玻片的腔室中。接下来，对于数据采集，在高数值孔径水浸入物镜的顶部加入一滴超纯水，将盖玻片滑轨固定在载物台腔室中，然后将组件安装在显微镜载物台的顶部。将物镜向上提起，直到物镜顶部的水滴涂抹在盖板滑移的底部，然后打开激光快门。当物镜向上移动时，检查CCD相机上通风环的图案。第一个环表示水/玻璃界面处的焦点，第二个环表示玻璃与样品溶液之间界面处的焦点。将物镜的高度增加75微米，使激光焦点深入溶液，以最大限度地减少盖子滑动玻璃表面的自发荧光。将物镜处的激光功率调谐约100微瓦。在预定义的时间内开始采集检测到的光子。打开 Jupyter 笔记本，然后打开示例笔记本。加载 FRETBursts 和 Photon-HDF5 数据文件。使用光子间时间的直方图来计算数据采集每30秒的背景速率。对于20个连续光子，一次移动一个光子的时间窗，如果瞬时光子速率F至少比数据采集期间的背景速率大11倍，则收集光子数据。计算突发中光子的大小和数量、突发持续时间、突发中最后一个光子和第一个光子检测时间之间的时间差、突发亮度、突发中瞬时光子速率的最大值、突发分离、连续突发之间的时间间隔。将突发亮度值的直方图与事件轴以对数刻度绘制。将突发亮度阈值定义为直方图显示衰减图案的最小突发亮度值，并选择亮度值大于突发亮度阈值的突发。对于突发平均荧光寿命测量，绘制所选突发中所有光子的光子纳米时间直方图，光子计数轴以对数刻度表示。将纳米时间阈值定义为光子纳米时间直方图表现出衰减模式的最小纳米时间值。仅选择纳米时间大于纳米时间阈值的光子。计算所有选定光子纳时的代数平均值。从光子纳米时间代数平均值中减去纳米时间阈值。得到的值是脉冲串的平均光子纳米时间，与平均荧光寿命成正比。绘制所有突发平均荧光寿命的直方图。可能出现荧光寿命的中心分布亚群。具有较低值平均值的亚群代表Sulfo-Cy3未被空间阻滞的分子物种，而具有较高值平均值的亚群代表具有S-Cy3的分子物种，这些分子物种受到空间阻滞更多。对于慢速、突发间动力学评估，使用对数刻度的分离时间轴绘制突发分离时间的直方图。选择此选项可保存所有连续爆发对，这些脉冲串的间隔时间小于定义相同分子亚群的最大分离时间。绘制低于特定分离时间阈值的所有突发对的第一和第二脉冲的平均荧光寿命的直方图或散点图。单个S-Cy3标记的α-突触核蛋白-56分子的平均荧光寿命的直方图显示，第一亚群具有1.6纳秒的特征荧光寿命，并且代表α-突触核蛋白构象状态，残基56附近几乎没有蛋白质表面。第二亚群具有3.5纳秒的特征荧光寿命，代表α-突触核蛋白构象状态，在残基56附近具有更多的蛋白质表面。已知α-突触核蛋白分子的非淀粉样蛋白β组分片段在与SDS囊泡结合时采用螺旋，发夹结构，这被证实为单一荧光寿命群体，其特征寿命约为3纳秒，并且没有具有1.6纳秒特征寿命的亚群。连续的单分子爆发之间的分离时间直方图报告了分离时间快于100毫秒的重复分子，其中第一次和第二次爆发来自同一分子。所有单分子突增的平均荧光寿命直方图显示亚群具有较短的特征寿命，以及具有较长的特征寿命，这表明单个分子可以在不同平均寿命值之间经历比爆发持续时间更慢的转变。在最多100毫秒的突发分离时间内，有一小部分分子从短寿命亚群中的第一次爆发开始，并在长寿命亚群中作为第二次爆发重复出现。虽然分子的比例从长寿命亚群中的第一次爆发开始，并在短寿命种群中作为第二次爆发重复出现，但表明两个亚群之间的转变在10到100毫秒内。分析实验结果时要记住的最重要的事情是从背景中正确分离单分子荧光信号，并分析具有足够光子纳时的突发。smPIFE的发展为研究人员在单分子水平上探索核酸蛋白相互作用铺平了道路。这一进步为研究蛋白质中的局部结构动力学奠定了基础。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

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科研

生物化学

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