Name: utilizing time-resolved protein-induced fluorescence enhancement to identify stable local conformations one &#945;-synuclein monomer at a time
Uploaded: 2021-05-30T14:00:00
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O pT-t7 codificando o mutante A56C α-Syn foi dado a nós como presente do Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir e Dr. Elisha Haas. Este artigo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH, conceder R01 GM130942 à E.L. como subaward), pela Israel Science Foundation (conceder 3565/20 dentro do KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), o Milner Fund e a Universidade Hebraica de Jerusalém (fundos de startup).

1. Transformação plasmida
<ol><li>Preparação de 0,5 L de meio SOC<ol>
<li>Pesar 10 g de triptona, 2,5 g de extrato de levedura, 0,25 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,1 g de cloreto de potássio (CTI).</li>
		<li>Adicione água duplamente destilada (DDW) até o volume total de 0,5 L.</li>
		<li>Ajuste ao pH 7 adicionando hidróxido de sódio (NaOH).</li>
		<li>Prepare alíquotas de estoque de 100 mL e autoclave.</li>
		<li>Antes de usar, adicione 0,5 mL de cloreto de magnésio estéril (TM2) e 1,8 mL de g...

Foram realizados extensos estudos bioquímicos e biofísicos para o estudo das características estruturais de α-Syn e sua natureza desordenada33,34,35,36,37,38. Vários trabalhos já utilizaram o smFRET de difusão livre para investigar a dinâmica intra-molecular do monômero α-Syn livre de vinculação. Esses trabalhos r...

Nas últimas duas décadas, os métodos baseados em fluorescência de moléculas únicas tornaram-se uma poderosa ferramenta para medir biomoléculas1,2, sondando como diferentes parâmetros biomoleculares se distribuem, bem como como eles interconvertem dinamicamente entre diferentes subpopulgências desses parâmetros na resolução sub-milissegundo3,4,5. Os parâmetros nestas técnicas incluem a eficiência da transferência de energia nas medições de FRET 6,7, anisotropia de fluorescência8,9, rendimentos quânticos de fluorescência e vidas10,11, em função de diferentes mecanismos de fluorescência que saciem12 ou aprimoramento13 mecanismos. Um desses mecanismos, mais conhecido como aumento da fluorescência induzida por proteínas (PIFE)14 introduz o aprimoramento do rendimento quântico da fluorescência e da vida como uma função da obstrução estérica à isomerização livre do fluorohore quando em estado animado, causado por superfícies proteicas nas proximidades do corante14,15,16,17,18,19 . Tanto o FRET quanto o PIFE são considerados governantes espectroscópicos ou sensores de proximidade, uma vez que seu parâmetro medido está diretamente ligado a uma medida espacial dentro da biomolécula rotulada sob medição. Enquanto a eficiência do FRET está relacionada à distância entre um par de corantes dentro de uma faixa de 3-10 nm20,o PIFE rastreia aumentos nos rendimentos quânticos da fluorescência ou vidas relacionadas à distância entre o corante e uma superfície de uma proteína próxima na faixa de 0-3 nm19.
O FRET de molécula única tem sido amplamente utilizado para fornecer insights estruturais em muitos sistemas proteicos diferentes, incluindo proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs)21, como α-Synuclein (α-Syn)22. α-Syn pode formar estruturas ordenadas seguindo a ligação a diferentes biomoléculas e em diferentes condições23,24,25,26,27,28,29,30. No entanto, quando desvinculado, o monômero α-Syn é caracterizado por alta heterogeneidade conformacional com conformações rapidamente interconversas31,32.
As conformações de α-Syn têm sido estudadas anteriormente utilizando-se de diversas técnicas diferentes que ajudam na identificação da dinâmica conformacional de sistemas tão heterogêneos e dinâmicos33,34,35,36,37,38,39. Curiosamente, as medições de FRET (smFRET) de molécula única de α-Syn no buffer relataram uma única população de FRET39,40 que é um resultado da média de tempo de conformações interconvertidas dinamicamente às vezes muito mais rápido do que o tempo típico de difusão de α-Syn através do ponto confocal (vezes tão rápido quanto poucos microssegundos e ainda mais rápido do que isso, em relação aos tempos típicos de difusão de milissegundos)40, 41. No entanto, o uso de uma régua espectroscópica FRET com a sensibilidade à distância de 3-10 nm às vezes relata apenas mudanças estruturais globais em uma pequena proteína, como α-Syn. Medições de molécula única utilizando sensores de proximidade espectroscópicos com sensibilidades de distância mais curta têm o potencial de relatar a dinâmica das estruturas locais. Aqui realizamos medições pife de molécula única de α-Syn e identificamos diferentes subsu populações de vida fluorescência mapeando para diferentes estruturas locais com transições entre elas tão lentas quanto 100 ms. Este trabalho resume as medidas smPIFE resolvidas pelo tempo de moléculas α-Syn livremente difundidas uma de cada vez, em buffer e quando ligadas a membranas baseadas em SDS como um sensor de proximidade espectroscópico de molécula única de curto alcance.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merc</td>
			<td>C7715</td>
			<td>cutoff: 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube</td>
			<td>Gene Bio-Application</td>
			<td>MEGA320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast SeeBand staining solution</td>
			<td>Gene Bio-Application</td>
			<td>SB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Desalting 5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ column</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein LoBind tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108094</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse a &#181;-slide 18</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas</td>
			<td>mini-plast</td>
			<td>815-004-05-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-Cy3&#160;maleimide</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab146493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing time-resolved protein-induced fluorescence enhancement to identify stable local conformations one &#945;-synuclein monomer at a time

O uso de réguas espectroscópicas para rastrear múltiplas conformações de biomoléculas únicas e sua dinâmica revolucionou a compreensão da dinâmica estrutural e suas contribuições para a biologia. Enquanto a régua baseada em FRET relata distâncias inter-corantes na faixa de 3-10 nm, outras técnicas espectroscópicas, como o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas (PIFE), relatam a proximidade entre um corante e uma superfície proteica na faixa mais curta de 0-3 nm. Independentemente do método de escolha, seu uso na medição de biomoléculas livremente difusas uma de cada vez recupera histogramas do parâmetro experimental produzindo subpopulgãs separadas distribuídas centralmente de biomoléculas, onde cada subpopo representa uma única conformação que permaneceu inalterada dentro de milissegundos, ou múltiplas conformações que intervertem muito mais rápido do que milissegundos, e, portanto, uma subpopoização média. Em fret de molécula única, onde o parâmetro relatado em histogramas é a eficiência fret inter-tingitária, uma proteína intrinsecamente desordenada, como o monômero α-Synucleína em buffer, foi previamente relatado como exibindo uma única subpopução média de múltiplas conformações interconverting rapidamente. Embora esses achados passados dependam da faixa de 3-10 nm da régua baseada em FRET, procuramos colocar essa proteína à prova usando pife de molécula única, onde rastreamos a vida de fluorescência de proteínas de α-sinucleína rotuladas no local uma de cada vez. Curiosamente, usando este sensor de proximidade espectroscópica de curto alcance, α-Synuclein com a marca Synuclein, com uma gama de tamanhos largos, exibe várias subpoporas vitalícias com vidas médias distintas que interconvertem em 10-100 ms. Esses resultados mostram que, embora α-Sinucleína possa ser desordenada globalmente, ela atinge estruturas locais estáveis. Em resumo, neste trabalho destacamos a vantagem de usar diferentes sensores de proximidade espectroscópicas que rastreiam mudanças estruturais locais ou globais uma biomolécula de cada vez.

Como IDP, quando não está vinculado a outra biomolécula, α-Syn exibe dinâmicas estruturais entre múltiplas conformações, com transições em poucos microssegundos40 e até mesmo em centenas de nanossegundos41. Quando α-Syn cruza o ponto confocal, ele pode passar por milhares de transições entre as conformações. De fato, este foi o caso quando o smFRET foi usado39,40. Aqui realizamos medições smPIFE pa...

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Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

O aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas de molécula única é um sensor de proximidade espectroscópico de fluorescência útil sensível às mudanças estruturais locais nas proteínas. Aqui mostramos que pode ser usado para descobrir conformações locais estáveis em α-Synuclein, que também é conhecida como globularmente desestruturada e instável quando medida usando a régua FRET de longo alcance.

Utilizando o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas resolvidas pelo tempo para identificar conformações locais estáveis Um monômero α-sinucleína de cada vez

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

A fluorescência induzida por proteína única pode elogiar as medidas de FRET de molécula única ao estudar subpopulações e conformações estruturais proteicas, especialmente nos casos em que subpopulações estruturais distintas relatam estruturas estáveis. A principal vantagem desta técnica é que ela captura subsu populações estruturais específicas do local com base nas proximidades do local de rotulagem de corantes para as superfícies proteicas. O aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas únicas pode ser aplicado a qualquer sistema biomolecular de interesse para sondar subpopulações distintas, locais e estruturais.Comece preparando 25 picomolars Sulfo-Cy3-rotulado alfa-sinucleína em tampão de medição em um tubo de ligação de baixa proteína. Adicione 100 microliters de um miligrama por mililitro BSA ao slide de cobertura de microscopia de 18 câmaras e incubar por um minuto, depois, descarte o BSA. Adicione 100 microliters de 25 amostras de alfa-sinucleína com rótulos de picomolar Sulfo-Cy3 na câmara do slide de deslizamento de cobertura.Em seguida, para a aquisição de dados, adicione uma gota de água ultrauso na parte superior da lente objetiva de imersão de água de alta abertura numérica, corrija o deslizamento de deslizamento de tampa na câmara de palco e, em seguida, instale o conjunto na parte superior do estágio do microscópio. Leve a lente objetiva para cima até que a gota d'água em cima da lente objetiva esfregue na parte inferior do deslizamento de tampa e abra o obturador a laser. Quando a lente objetiva se mover para cima, inspecione o padrão dos anéis arejados em uma câmera CCD.O primeiro anel representa o foco na interface água/vidro, e o segundo anel representa o foco na interface entre o vidro e a solução de amostra. Aumente a altura da lente objetiva em 75 micrômetros para trazer o foco a laser profundamente na solução para minimizar a autofluorescência da superfície de vidro do deslizamento da tampa. Sintonize a potência laser na lente objetiva aproximadamente 100, microwatts.Inicie a aquisição dos fótons detectados por um tempo predefinido. Abra os Cadernos Jupyter e abra o caderno de amostras. Carregue o arquivo de dados FRETBursts e Photon-HDF5.Use o histograma dos tempos interfotográficos para calcular as taxas de fundo para cada 30 segundos de aquisição de dados. Mova uma janela de tempo de um fóton de cada vez para 20 fótons consecutivos, e colete os dados do fóton se a taxa de fótons instantâneo F for pelo menos 11 vezes maior do que a taxa de fundo para esse período da aquisição de dados. Calcule o tamanho da explosão e a quantidade de fótons em uma explosão, a duração da explosão, a diferença de tempo entre o último e o primeiro tempo de detecção de fótons em uma explosão, o brilho da explosão, o maior valor da taxa de fóton instantâneo em uma rajada, e a separação da explosão, o intervalo de tempo entre rajadas consecutivas.Plote o histograma dos valores de brilho estourado com o eixo de eventos em uma escala logarítmica. Defina o limiar de brilho da explosão como o valor mínimo de brilho da explosão a partir do qual o histograma exibe um padrão em decomposição, e seleciona as rajadas com valores de brilho maiores do que o limiar de brilho da explosão. Para a medição média da fluorescência, plote o histograma de nanotime de fótons para todos os fótons nas rajadas selecionadas com o eixo de contagem de fótons em uma escala logarítmica.Defina o limiar de nanotime como o valor mínimo de nanotime a partir do qual o histograma de nanovezess de fótons exibe um padrão em decomposição. Selecione apenas esses fótons com nanovezes maiores que o limiar de nanotime. Calcule a média algébrica de todos os nanovezes de fótons selecionados.Subtraia o limiar de nanotime da média algébrica de nanovezes do fóton. O valor obtido é o nanotime de fótons médio da explosão, diretamente proporcional à vida média da fluorescência. Traçar o histograma de todas as vidas de fluorescência.As subpopulações distribuídas centralmente da vida fluorescência podem aparecer. As subpopulações com médias de menor valor representam as espécies moleculares com Sulfo-Cy3 que não foram obstruídas esticamente, enquanto as subpopulações com médias de maior valor representam a espécie molécula com S-Cy3 que foram mais obstruídas esticamente. Para a lenta avaliação dinâmica entre rajadas, plote o histograma dos tempos de separação de rajadas com um eixo de tempo de separação em escala logarítmica.Selecione para salvar todos os pares das rajadas consecutivas que são separados por menos de um tempo máximo de separação que define a subpopulação da mesma molécula. Traçar um histograma ou uma dispersão das vidas médias de fluorescência da primeira e segunda rajadas para todos os pares das rajadas que se repetiram abaixo de um certo limite de tempo de separação. Os histogramas da fluorescência média de uma única molécula de fluorescência, rotulada por S-Cy3, mostraram que a primeira subpopulação teve uma vida de fluorescência característica de 1,6 nanossegundos, e representando estados conformacionais alfa-sinucleína com poucas superfícies proteicas nas proximidades do resíduo 56.A segunda subpopulação teve uma vida fluorescência característica de 3,5 nanossegundos e representando estados conformacionais alfa-sinucleína com mais superfícies proteicas nas proximidades do resíduo 56. Os segmentos de componentes beta não amiloides das moléculas de alfa-sinucleína são conhecidos por adotar uma estrutura helicoidal, de grampos de cabelo ao vincular-se às vesículas de SDS, o que foi confirmado como uma única população de floresidade ao longo da vida com uma vida útil característica de aproximadamente três nanossegundos, e ausência da subpopulação com a vida útil característica de 1,6 nanossegundos. O histograma dos tempos de separação entre rajadas consecutivas de molécula única relata moléculas recorrentes para os tempos de separação mais rápido do que 100 milissegundos, onde a primeira e segunda rajadas surgem da mesma molécula.O histograma médio de fluorescência ao longo de todas as explosões de moléculas únicas mostrou subpopulações com uma vida útil característica curta, bem como com uma longa vida característica, o que indica que moléculas individuais poderiam sofrer transições entre diferentes valores médios de vida mais lentos do que os tempos de duração da explosão. Dentro dos tempos de separação de 100 milissegundos, no máximo, houve uma fração de moléculas que começou como uma primeira explosão na subpopulação de curta duração, e se repetiu como uma segunda explosão dentro da subpopulação de longa duração. Enquanto a fração de moléculas que começou como uma primeira explosão na subpopulação de longa duração, e se repetiu como uma segunda explosão dentro da população de curta duração, indica as transições entre as duas subpopulações dentro de 10 a 100 milissegundos.A coisa mais importante a ser lembrada ao analisar os resultados experimentais é separar corretamente sinais de fluorescência de moléculas únicas do fundo, e analisar rajadas com nanovezes de fótons suficientes. O desenvolvimento do smPIFE abriu o caminho para os pesquisadores explorarem interações de proteínas nucleicas de ácido no nível de molécula única. Esse avanço estabelece o terreno para o estudo da dinâmica estrutural local dentro das proteínas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Utilizando o composto libertador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico, como uma ferramenta para estudar a resposta do etileno em bactérias

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Utilizando um sistema de enriquecimento de imunoprecipitação abrangente para identificar um perfil endógena modificação pós-traducional de proteínas alvo

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulando células vivas para construir estável montagem celular 3D sem andaime Artificial

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Uma estratégia para identificar compostos que afetam o crescimento celular e sobrevivência em células de mamíferos cultivadas em baixa a moderada taxa de transferência

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparação rápida da grade para microscopia crio-elétron resolvida pelo tempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...