Name: utilizing time-resolved protein-induced fluorescence enhancement to identify stable local conformations one &#945;-synuclein monomer at a time
Uploaded: 2021-05-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃŽÂ±-Synuclein Monomer at a Time at JoVE.com

Плазмида pT-t7, кодировавщая A56C α-Syn мутант, была подарена нам доктором Асафом Групи, доктором Дэном Амиром и доктором Элишей Хаасом. Эта статья была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH, грант R01 GM130942 для E.L. в качестве субавадры), Израильским научным фондом (грант 3565/20 в рамках программы KillCorona - Сдерживание коронавируса), Фондом Милнера и Еврейским университетом Иерусалима (стартовые фонды).

1. Плазмидная трансформация
<ol><li>Приготовление 0,5 л SOC среды<ol>
<li>Взвесьте 10 г триптона, 2,5 г дрожжевого экстракта, 0,25 г хлорида натрия (NaCl), 0,1 г хлорида калия (KCl).</li>
		<li>Добавляют двойную дистиллированную воду (DDW) до общего объема 0,5 л.</li>
		<li>Отрегулируйте до pH 7, добавив гидроксид натрия (NaOH)....

Проведены обширные биохимические и биофизические исследования для изучения структурных характеристик α-Син и его неупорядоченной природы33, 34,35,36,37,38. В нескольких работах уже ис...

За последние два десятилетия одномолекулярные флуоресцентные методы стали мощным инструментом для измерения биомолекул1,2,исследования того, как распределяются различные биомолекулярные параметры, а также как они динамически взаимоконвертируются между различными субопциплонатами этих параметров при субмиллисекундном разрешении3,4,5. Параметры в этих методах включают эффективность передачи энергии в измерениях FRET 6,7,флуоресцентную анизотропию8,9,квант флуоресценции и время жизни10,11,как функцию различных флуоресцентных гасящих12 или13 улучшений механизмов. Один из этих механизмов, более известный как белково-индуцированное флуоресцентное усиление (PIFE)14, вводит увеличение квантового выхода флуоресценции и времени жизни в функции стерической обструкции к свободной изомеризации флуорофора в возбужденном состоянии, вызванном белковыми поверхностями в непосредственной близости от красителя14,15,16,17,18,19 . Как FRET, так и PIFE считаются спектроскопическими линейками или датчиками приближения, поскольку их измеряемый параметр напрямую связан с пространственной мерой в меченой биомолекуле при измерении. В то время как эффективность FRET связана с расстоянием между парой красителей в диапазоне 3-10 нм20,треки PIFE увеличивают квантовые выходы флуоресценции или время жизни, связанное с расстоянием между красителем и поверхностью соседнего белка в диапазоне 0-3 нм19.
Одномолекулярный FRET широко используется для обеспечения структурного понимания многих различных белковых систем, включая внутренне неупорядоженные белки (IMP)21,такие как α-synuclein (α-Syn)22. α-Syn может образовывать упорядоченные структуры после связывания с различными биомолекулами и в разных условиях23,24,25, 26,27,28,29,30. Однако при несвязывке мономер α-Syn характеризуется высокой конформационной гетерогенностью с быстро взаимоконвертируемыми конформациями31,32.
Конформации α-Syn были изучены ранее с использованием различных методов, которые помогают в выявлении конформационной динамики таких высоко гетерогенных и динамических белковых систем33,34,35,36,37,38,39. Интересно, что одномолекулярные измерения FRET (smFRET) α-Syn в буфере сообщили об одной популяции FRET39,40, что является результатом усреднения по времени конформаций, динамически взаимопреобразующихся в разы намного быстрее, чем типичное время диффузии α-Syn через конфокальное пятно (в разы быстрее, чем несколько микросекунд и даже быстрее, чем это, относительно типичного миллисекундного времени диффузии)40, 41г. Однако использование спектроскопической линейки FRET с чувствительностью расстояния 3-10 нм иногда сообщает только об общих структурных изменениях в небольшом белке, таком как α-Syn. Одномолекулярные измерения с использованием спектроскопических датчиков приближения с более короткой чувствительностью расстояния могут сообщить о динамике локальных структур. При этом мы выполняем одномолекулярные измерения PIFE α-Syn и идентифицируем различные субпопущенности флуоресцентных жизней, отображающих различные локальные структуры с переходами между ними медленно до 100 мс. В этой работе обобщены измерения smPIFE со временным разрешением свободно диффундируемых молекул α-Syn по одной, в буфере и при связываниях с мембранами на основе SDS в качестве одномолекулярного спектроскопического датчика приближения малого диапазона.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merc</td>
			<td>C7715</td>
			<td>cutoff: 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube</td>
			<td>Gene Bio-Application</td>
			<td>MEGA320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast SeeBand staining solution</td>
			<td>Gene Bio-Application</td>
			<td>SB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Desalting 5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ column</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein LoBind tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108094</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse a &#181;-slide 18</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas</td>
			<td>mini-plast</td>
			<td>815-004-05-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-Cy3&#160;maleimide</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab146493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing time-resolved protein-induced fluorescence enhancement to identify stable local conformations one &#945;-synuclein monomer at a time

Использование спектроскопических линеек для отслеживания множественных конформаций отдельных биомолекул и их динамики произвело революцию в понимании структурной динамики и ее вклада в биологию. В то время как линейка на основе FRET сообщает о межкрасивых расстояниях в диапазоне 3-10 нм, другие спектроскопические методы, такие как усиление флуоресценции, индуцированное белком (PIFE), сообщают о близости между красителем и поверхностью белка в более коротком диапазоне 0-3 нм. Независимо от выбранного метода, его использование при измерении свободно-диффузных биомолекул по одной за раз извлекает гистограммы экспериментального параметра, дающие отдельные централизованно распределенные субпуляции биомолекул, где каждая субоплюдион представляет собой либо единую конформацию, которая оставалась неизменной в течение миллисекунд, либо множественные конформации, которые взаимопреобразуются намного быстрее миллисекунд, и, следовательно, усредненную субпуляцию. В одномолекулярном FRET, где сообщаемым параметром в гистограммах является эффективность FRET между красителями, внутренне неупорядоцированный белок, такой как мономер α-синуклеина в буфере, ранее сообщал как демонстрирующий одну усредненную субпопуляцию множественных конформаций, быстро взаимопреобразующихся. Хотя эти прошлые результаты зависят от диапазона 3-10 нм линейки на основе FRET, мы стремились проверить этот белок с использованием одномолекулярного PIFE, где мы отслеживаем время жизни флуоресценции сайтов-специфических α-синуклеиновых белков sCy3 по одному. Интересно, что используя этот спектроскопический датчик приближения с более коротким диапазоном, меченый sCy3 α-Synuclein демонстрирует несколько подпопущений времени жизни с совершенно разными средними сроками жизни, которые взаимоконвертируются за 10-100 мс. Эти результаты показывают, что, хотя α-синуклеин может быть неупорядочешен в глобальном масштабе, он, тем не менее, достигает стабильных местных структур. Таким образом, в этой работе мы подчеркиваем преимущество использования различных спектроскопических датчиков приближения, которые отслеживают локальные или глобальные структурные изменения по одной биомолекуле за раз.

Как IDP, когда он не связан с другой биомолекулой, α-Syn демонстрирует структурную динамику между несколькими конформациями с переходами в несколько микросекунд40 и даже в сотни наносекунд41. Когда α-Син пересекает конфокальное пятно, оно может претерпевать тысячи...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃŽÂ±-Synuclein Monomer at a Time at JoVE.com

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Усиление флуоресценции с одномолекулярным белком, индуцированным временем, является полезным флуоресцентным спектроскопическим датчиком приближения, чувствительным к локальным структурным изменениям в белках. Здесь мы показываем, что он может быть использован для выявления стабильных локальных конформаций в α-синуклеине, который иначе известен как глобулярно неструктурированный и нестабильный при измерении с использованием линейки FRET с более длинным диапазоном.

Использование флуоресценции с временным разрешением, вызванного белком, для идентификации стабильных локальных конформаций по одному мономеру синуклеина α за раз

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Одномолекулярное, вызванное белком усиление флуоресценции может дополнять одномолекулярные измерения FRET при изучении структурных субпопуляций и конформаций белка, особенно в тех случаях, когда различные структурные субпопуляции сообщают о стабильных местных структурах. Основным преимуществом этого метода является то, что он захватывает различные структурные субпунции, специфичные для сайта, основанные на близости участка маркировки красителя к поверхностям белка. Одномолекулярное, вызванное белком флуоресцентное усиление может быть применено к любой биомолекулярной системе, представляющим интерес, для исследования различных, локальных, структурных субпопуляций.Начните с получения 25 пикомоляров сульфо-Cy3-меченого альфа-синуклеина в измерительном буфере в трубке с низким содержанием белка. Добавьте 100 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр BSA к слайду крышки 18-камерной микроскопии и высиживайте в течение одной минуты, затем выбросьте BSA. Добавьте 100 микролитров 25 пикомолярных образцов альфа-синуклеина, меченых сульфо-Cy3, в камеру слайда крышки.Затем для сбора данных добавьте каплю сверхчистой воды на верхнюю часть объектива с высокой числовой диафрагмой, зафиксируйте скользящий слайд крышки в камере сцены, а затем установите узел на верхнюю часть ступени микроскопа. Поднесите объектив вверх до тех пор, пока капля воды сверху объектива не смазывается в нижней части скользящего слайда крышки, и откройте лазерный затвор. Когда объектив сместится вверх, осмотрите рисунок воздушных колец на ПЗС-камере.Первое кольцо представляет фокус на границе раздела вода/стекло, а второе кольцо представляет фокус на границе раздела между стеклом и раствором образца. Увеличьте высоту объектива на 75 микрометров, чтобы лазерный фокус был глубоко погружен в раствор для минимизации автофлуоресценции от стеклянной поверхности скольжения крышки. Настройте мощность лазера на объективе приблизительно 100 микроватт.Начните сбор обнаруженных фотонов на заранее определенное время. Откройте записные книжки Jupyter, затем откройте образец записной книжки. Загрузите файл данных FRETBursts и Photon-HDF5.Используйте гистограмму межфотонного времени для расчета фоновых частот за каждые 30 секунд сбора данных. Переместите временное окно из одного фотона за раз для 20 последовательных фотонов и соберите данные фотонов, если мгновенная частота фотонов F по крайней мере в 11 раз больше фоновой скорости за этот период сбора данных. Рассчитайте размер и количество фотонов в всплеске, продолжительность всплеска, разницу во времени между временем обнаружения последнего и первого фотона в всплеске, яркость всплеска, наибольшее значение мгновенной скорости фотона во всплеске и разделение всплесков, временной интервал между последовательными всплесками.Построение гистограммы значений яркости серийной очереди с осью событий в логарифмической шкале. Определите порог яркости серийной очереди как минимальное значение яркости всплеска, из которого гистограмма демонстрирует затухающий паттерн, и выберите всплески со значениями яркости, превышающими порог яркости серийной очереди. Для измерения времени жизни средней флуоресценции всплеска построим гистограмму фотонового нановремени для всех фотонов в выбранных всплесках с осью подсчета фотонов в логарифмической шкале.Определите порог нановрема как минимальное значение нановремени, из которого гистограмма фотоновых нановрейм демонстрирует паттерн распада. Выбирайте только те фотоны, у кого нановремя больше порога нановрем. Рассчитайте алгебраическое среднее всех выбранных фотонов нановремен.Вычтите порог нановрема из среднего алгебраического значения фотона нановремени. Полученное значение представляет собой среднее фотонное нановремя всплеска, прямо пропорциональное среднему времени жизни флуоресценции. Построй гистограмму всех средних сроков жизни флуоресценции всплеска.Могут появиться централизованно распределенные субпопуляции времени флуоресценции. Субпопуляции с более низкими средними значениями представляют собой молекулярные виды с Sulfo-Cy3, которые не были стерически затруднены, в то время как субпопуляции с более высокими средними значениями представляют собой молекулярные виды с S-Cy3, которые были более стерически затруднены. Для медленной оценки динамики между всплесками постройте гистограмму времени разделения разрывов с осью времени разделения в логарифмической шкале.Выберите, чтобы сохранить все пары последовательных всплесков, которые разделены временем, меньшим, чем максимальное время разделения, определяемое субпопуляцию одной и той же молекулы. Постройте гистограмму или диаграмму рассеяния среднего времени жизни флуоресценции первого и второго всплесков для всех пар всплесков, которые повторялись ниже определенного порога времени разделения. Гистограммы среднего времени жизни флуоресценции одной, меченной S-Cy3, молекулы альфа-синуклеина-56 показали, что первая субпопуляция имела характерное время жизни флуоресценции 1,6 наносекунды и представляла собой альфа-синуклеиновые конформационные состояния с небольшим количеством белковых поверхностей в окрестностях остатка 56.Вторая субпопуляция имела характерное время жизни флуоресценции 3,5 наносекунды и представляла собой альфа-синуклеиновые конформационные состояния с большим количеством белковых поверхностей в окрестностях остатка 56. Известно, что неамилоидные бета-компонентные сегменты молекул альфа-синуклеина принимают спиральную структуру шпильки при связывании с везикулами SDS, что было подтверждено как популяция одного срока жизни флоры с характерным сроком жизни примерно три наносекунды и отсутствием субпопуляции с характерным сроком жизни 1,6 наносекунды. Гистограмма времени разделения между последовательными одномолекулярными всплесками сообщает о повторяющихся молекулах для времени разделения быстрее 100 миллисекунд, где первый и второй всплески возникают из одной и той же молекулы.Гистограмма среднего времени жизни флуоресценции всех одиночных молекул-всплесков показала субпопуляции с коротким характерным временем жизни, а также с длительным характерным временем жизни, что указывает на то, что отдельные молекулы могут подвергаться переходам между различными средними значениями времени жизни медленнее, чем время продолжительности всплеска. В течение времени разделения всплесков не более 100 миллисекунд была доля молекул, которые начинались как первый всплеск в субпопуляции с коротким сроком службы и повторялись как второй всплеск в субпопуляции с длительным сроком службы. В то время как доля молекул, которая началась как первый всплеск в субпопуляции с длительным сроком службы и повторилась как второй всплеск в популяции с коротким сроком службы, указывает на переходы между двумя субпопуляциями в течение 10-100 миллисекунд.Самое главное, что нужно помнить при анализе результатов экспериментов, это правильно отделить одномолекулярные флуоресцентные сигналы от фона и проанализировать всплески с достаточным количеством фотон нановрем. Разработка smPIFE проложила путь для исследователей для изучения белковых взаимодействий нуклеиновых кислот на уровне одной молекулы. Это достижение закладывает основу для изучения локальной структурной динамики внутри белков.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Используя Этилен-рилизинг-соединение, 2-Chloroethylphosphonic кислота, в качестве инструмента для изучения Этилен ответа бактерий

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Используя систему обогащения всеобъемлющего иммунопреципитации для определения профиля эндогенных столб-поступательные изменения целевых белков

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Поколения родной, расставленными гентингтина Exon1 мономера и фибрилл, используя стратегию Fusion сумо

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Манипулируя живых клеток для построения стабильной 3D сотовой Ассамблеи без искусственных лесов

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Стратегия по выявлению соединений, влияющих на рост клеток и выживаемость в культурных клетках млекопитающих при низкой до умеренной пропускной связи

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Резонансные анализы переноса энергии Фёрстера с временным разрешением для измерения эндогенных фосфорилированных белков STAT в клетках человека

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...