Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

يشكر المؤلفون ليبي بيري (جامعة أوغوستا) على مساعدتها في إعداد عينة SEM. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [R01HL139562 (G.C.) و K99HL146954 (B.S.)] وجمعية القلب الأمريكية [17POST33661254 (B.S.)].

ملاحظة: فيما يلي بروتوكول عام يستخدم لقياس تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم RAW 264.7 باستخدام الفحص المجهري SEM. قد يكون التحسين مطلوبا لأنواع الخلايا المختلفة.
1. خط الخلية وزراعة الخلايا
<ol><li>تنمو البلاعم RAW 264.7 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ (vol / vol) مصل البقر الجنيني المعطل ?...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

يوفر بروتوكول التصوير SEM الحالي أداة لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، والأكواب ذات الخلايا الكبيرة على سطح الخلية في المختبر. على الرغم من أن البروتوكول الحالي يركز على البلاعم ، فقد أظهرت الدراسات أن تكوين كشكشة الغشاء يحدث أيضا على أنواع مختلفة من الخلايا الأخ?...

Macropinocytosis هي عملية endocytic مسؤولة عن استيعاب كمية كبيرة من السائل خارج الخلية ومحتواه عن طريق تشكيل نتوءات غشاء البلازما الديناميكية والمدفوعة بالأكتين والتي تسمى كشكشة الغشاء1. تشكل العديد من هذه الكشكشة الغشائية أكوابا تغلق وتندمج مرة أخرى على الخلية وتنفصل عن غشاء البلازما كإيدوسومات كبيرة غير متجانسة داخل الخلايا تعرف أيضا باسم macropinosomes1. على الرغم من أن ندرة الخلايا الكبيرة تسببها عوامل النمو مثل عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) وعامل نمو البشرة (EGF) في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، فقد لوحظت أيضا عملية إضافية فريدة تعتمد على الكالسيوم تعرف باسم macropinocytosis التأسيسي في الخلايا المناعية الفطرية2،3،4،5،6،7،8.
وقد ثبت أن قدرة الخلايا على استيعاب المواد خارج الخلية عن طريق زيادة عدد الخلايا الكبيرة تلعب دورا مهما في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية التي تتراوح من امتصاص المغذيات إلى التقاط مسببات الأمراض وتقديم المستضد9،10،11. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه العملية غير انتقائية وقابلة للحث ، فقد تورطت أيضا في عدد من الحالات المرضية. في الواقع ، أشارت الدراسات السابقة إلى أن ندرة الخلايا الكبيرة تلعب دورا مهما في مرض الزهايمر ومرض باركنسون والسرطان وتحصي الكلية وتصلب الشرايين12،13،14،15،16. علاوة على ذلك ، أظهرت بعض البكتيريا والفيروسات أنها تستخدم ندرة الخلايا الكبيرة للدخول إلى الخلايا المضيفة والحث على العدوى17,18. ومن المثير للاهتمام ، يمكن أيضا استغلال تحفيز ندرة الخلايا الكبيرة للتسليم المستهدف للعوامل العلاجية في مختلف الظروف المرضية19,20.
وقد استكشفت الدراسات السابقة ندرة الخلايا الكبيرة عن طريق تحديد علامات الطور السائل الداخلية الموسومة بالفلورسنت في غياب ووجود عوامل دوائية تمنع ندرة الخلايا الكبيرة باستخدام قياس التدفق الخلوي والتصوير البؤري21,22. تقتصر الأدوات الدوائية المتاحة حاليا التي تمنع ندرة الخلايا الكبيرة على 1) مثبطات بلمرة الأكتين (cytochalasin D و latrunculins) ، 2) حاصرات PI3K (LY-290042 و wortmannin) و 3) مثبطات مبادلات هيدروجين الصوديوم (NHE) (أميلوريد و EIPA) 5،14،15،23،24،25 . ومع ذلك ، نظرا لأن هذه المثبطات لها تأثيرات مستقلة على كثرة الخلايا الداخلية ، فمن الصعب تحديد مساهمة زيادة عدد الخلايا الكبيرة بشكل انتقائي في امتصاص المذاب والتسبب في المرض خاصة في الجسم الحي21.
المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) هو نوع من المجهر الإلكتروني الذي ينتج صورا فائقة الدقة للخلايا باستخدام حزمة مركزة من الإلكترونات26. في أبحاث زيادة الوجهين ، يعتبر تصوير SEM تقنية قياسية ذهبية لتصور الخصائص الطبوغرافية والمورفولوجية لغشاء البلازما ، وتحديد تكوين كشكشة الغشاء ، والتحقيق في تقدمها نحو استيعاب macropinosome. وعلاوة على ذلك، فإن المجهر الإلكتروني الماسح جنبا إلى جنب مع التحديد الكمي لامتصاص المذاب، في وجود وغياب حاصرات كثرة الخلايا الكبيرة، يوفر استراتيجية موثوقة لفحص الاستيعاب المذاب في المختبر. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا حول كيفية تحضير الخلايا ل SEM ، وتصور سطح الخلية ، وتحديد تكوين الكشكشة ، وفحص تقدمها نحو إغلاق الكوب واستيعاب macropinosome.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

كشكشة الغشاء هي تكوين نتوءات غشاء البلازما المتحركة التي تحتوي على شبكة من خيوط الأكتين المبلمرة حديثا. قد تتشكل الكشكشة الغشائية تلقائيا أو استجابة لعوامل النمو والسيتوكينات الالتهابية واسترات الفوربول. قد يعاد تنظيم بعض نتوءات الغشاء في كشكشة غشائية دائرية تندمج في هوامشها البعيدة وتشكل أكوابا تغلق وتنفصل في السيتوبلازم على شكل فجوات كبيرة غير متجانسة تسمى macropinosomes. أثناء هذه العملية ، تحبس الكشكشة السائل خارج الخلية والمذابات التي تستوعب داخل macropinosomes. المجهر الإلكتروني الماسح عالي الدقة (SEM) هو تقنية تصوير شائعة الاستخدام لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، وأكواب المحببات الكبيرة المغلقة على سطح الخلية. يصف البروتوكول التالي ظروف زراعة الخلايا ، وتحفيز تكوين كشكشة الغشاء في المختبر ، وكيفية إصلاح الخلايا وتجفيفها وإعدادها للتصوير باستخدام SEM. كما يتم وصف القياس الكمي لكشكش الغشاء ، وتطبيع البيانات ، والمحفزات والمثبطات لتشكيل كشكشة الغشاء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دور ندرة الخلايا الكبيرة في العمليات الفسيولوجية والمرضية ، والتحقيق في الأهداف الجديدة التي تنظم تكوين كشكشة الغشاء ، وتحديد المحفزات الفسيولوجية غير المميزة حتى الآن بالإضافة إلى مثبطات دوائية جديدة ل macropinocytosis.

هنا ، نصف النتائج من التقنية المقدمة. توضح صور SEM التمثيلية الموضحة في الشكل 1 تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم RAW 264.7 بعد العلاج باستخدام PMA و M-CSF. تم التقاط الصور لأول مرة بتكبير 3,500x لأغراض القياس الكمي ثم عند مستويات أعلى من التكبير (8,500x إلى 16,000x) لإظهار غشاء البلازما بمزيد من ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Macropinocytosis هي عملية داخل الخلايا محفوظة للغاية تبدأ من خلال تشكيل إسقاطات غشائية غنية بالصفائح F-actin ، والمعروفة أيضا باسم كشكشة الغشاء. وقد تورط معدل زيادة الاستيعاب المذاب macropinocytotic في مختلف الظروف المرضية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لقياس تكوين كشكشة الغشاء في المختبر باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.

تصور تشكيل غشاء الكشكشة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

يوفر بروتوكول التصوير SEM الحالي أداة لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، والأكواب ذات الخلايا الكبيرة على سطح الخلية في المختبر. يوفر SEM صورا عالية الدقة لسطح الخلية يمكن استخدامها لتصور أنشطة غشاء الخلايا الكبيرة. يمكن استخدام هذه التقنية لاكتشاف مسارات إشارات جديدة تنظم ندرة الخلايا الكبيرة ، وتحديد محفزات ومثبطات جديدة لندرة الخلايا الدقيقة.ابدأ بوضع أغطية زجاجية معقمة في آبار صفيحة مكونة من 24 بئرا باستخدام ملقط معقم. ثم تنزلق 264.7 بلاعم خام على الغطاء بكثافة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر وتحتضن الصفيحة بين عشية وضحاها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، استبدل الوسائط في كل بئر ب 500 ميكرولتر من الوسائط الكاملة الجديدة ، ثم عالج البلاعم مسبقا لمدة 30 دقيقة باستخدام عنصر تحكم في السيارة مثل DMSO أو مثبط كثرة الخلايا الكبيرة مثل EIPA.بعد ذلك ، لتعزيز كشكش الغشاء ، عالج الخلايا لمدة 30 دقيقة باستخدام محفزات زيادة العظم ، مثل محلول PMA ميكرومولاري واحد أو 100 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم. لإصلاح الخلايا للفحص المجهري الإلكتروني الماسح ، قم بشفط الوسائط من الآبار واغسل الغطاء مرتين باستخدام PBS البارد ، ثم احتضن انزلاقات الغطاء في مثبت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تليها حضانة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية ، اغسل بلطف ثم احتضن الغطاء في 500 ميكرولتر من كاكوديلات الصوديوم بمحرك 0.1 لمدة 15 دقيقة.بعد غسلتين مع 500 ميكرولتر من الماء المقطر ، اغسل الغطاء مرتين في 500 ميكرولتر من سلسلة الإيثانول المتدرجة مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة. لإجراء تجفيف النقاط الحرجة ، ضع انزلاقات الغطاء في مجفف نقطة حرجة وقم بتغطيتها بالإيثانول بنسبة 100٪. ثم اضغط على زر الطاقة وافتح خزان ثاني أكسيد الكربون.اضغط على زر التبريد لمدة 30 ثانية تقريبا حتى تنخفض درجة الحرارة إلى الصفر درجة مئوية. ثم اضغط على زر التعبئة حتى تظهر فقاعة في نافذة الغرفة. بعد ذلك ، اضغط على زر التطهير حتى تختفي رائحة الإيثانول من عادم التطهير.ثم اضغط على زر التبريد مرة أخرى حتى تنخفض درجة الحرارة إلى الصفر درجة مئوية. أعد الضغط على الأزرار الكاملة والتطهير لإيقاف تشغيلها. ثم أغلق خزان ثاني أكسيد الكربون.أعد الضغط على الجزء السفلي البارد لإيقاف تشغيله، ثم اضغط على زر الحرارة. اضبط درجة الحرارة على 42 درجة مئوية والضغط على 1،200 رطل لكل بوصة مربعة. بمجرد استقرار الضغط ودرجة الحرارة، اضغط على زر التسييل للسماح للضغط بالانخفاض ببطء.بمجرد أن يصل ضغط الغرفة إلى 150 رطلا لكل بوصة مربعة ، اضغط على قاع فتحة التهوية وانتظر حتى ينخفض الضغط إلى صفر رطل لكل بوصة مربعة. أوقف تشغيل مجفف النقاط الحرجة وأزل انزلاقات الغطاء. بعد ذلك ، باستخدام صنابير لاصقة كربونية ، قم بتركيب زلات الغطاء على حوامل عينات الألومنيوم للمسح المجهري الإلكتروني ، ثم انتقل إلى طلاء الرذاذ باستخدام الذهب أو البلاديوم في معطف التناثر.قم بتشغيل زر الطاقة الخاص بطبقة المعطف اللسف. بعد أن يصل الفراغ إلى 30 ملليتور، اغسل الغرفة لإزالة الرطوبة والهواء عن طريق إيقاف تشغيل مفتاح الغاز وتحويل صمام الغاز الدقيق عكس اتجاه عقارب الساعة. بمجرد زيادة الفراغ إلى 200 مللي تورس ، قم بإيقاف تشغيل مفتاح الغاز وانتظر حتى يصل الفراغ إلى 30 مللي تور.ثم اغسل الغرفة مرة أخرى لإزالة الرطوبة والهواء كما هو موضح. بعد تنظيف الغرفة ثلاث مرات ، ادفع الجزء السفلي من المؤقت واضبط مقبض الجهد حتى يقرأ المقياس 10 مللي أمبير. ثم ، قم بإزالة زلات الغطاء المطلي من الغرفة.لتصور الكشكشة الغشائية وقياسها كميا، أدخل انزلاقات غطاء العينة في حجرة المجهر الإلكتروني الماسح، وأغلق الباب، واضغط على زر الإخلاء. افتح برنامج تشغيل المجهر واضبط الجهد المتسارع على 15 كيلوفولت ومسافة العمل على 10 ملم. اضغط على زر الإحداثيات وتحرك حول وحدة التحكم حتى تظهر الخلايا في وسط شاشة الملاحظة.اضبط التكبير على 3،500 X وصور العينة بالنقر فوق الزر صورة. تظهر هنا صور تمثيلية للمجهر الإلكتروني الماسح الضوئي ، توضح تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم الخام 264.7 بعد العلاج باستخدام PMA وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم. المعالجة المسبقة للبلاعم مع مثبط كثرة العظم EIPA تخفف من تكوين كشكشة الغشاء.أثناء تكوين الكشكشة ، يمر غشاء البلازما بمراحل مورفولوجية متميزة ، بما في ذلك نتوء غشاء يشبه الورقة ، وكشكشة غشاء على شكل حرف C ، وكوب كبير. يمكن تحديد تكوين كشكشة الغشاء بعد PMA ومعالجات العوامل المحفزة لمستعمرة البلاعم باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، في حين يمكن تأكيد تكوين macropinosome بواسطة تقنيات التصوير البديلة ، مثل المجهر البؤري باستخدام تكساس ريد ديكستران و FM4-64. تشير الأسهم الزرقاء إلى كشكش الغشاء ، بينما تشير الأسهم الصفراء والخضراء إلى micropinosomes.وأخيرا، يمكن تأكيد ندرة الخلايا الكبيرة وقياسها كميا من خلال قياس التدفق الخلوي باستخدام علامة طور سائل الفلورسنت مثل FITC أو تكساس ريد ديكستان. بالإضافة إلى SEM ، يمكن أيضا إجراء تصوير الخلايا الحية وتحليل قياس التدفق الخلوي لاستيعاب الدكستران المسمى بالفلورسنت للتحقيق في ندرة الخلايا الكبيرة وقياسها كميا.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

عن طريق الفم من تحليل بيوفيلم المتوسعون حلقي بواسطة التهجين في الموضع الإسفار ومتحد البؤر المسح الضوئي ليزر مجهرية

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

قياس نفاذية كبيبي الجزيئات نيون باستخدام المجهر 2 فوتون في ميونيخ فئران ويستار

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

تشكيل الظهارة البروستاتا الذي يصيب الانسان عن طريق إعادة التركيب الأنسجة من القوارض البولي التناسلي اللحمة المتوسطة الجيوب الأنفية والخلايا الجذعية البشرية

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

باستخدام تقنية الترقق لتنفيذ متحد البؤر المجهري للالصلبة الإنسان


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

التحقيق فون "ويليبراند عامل الفيزيولوجيا المرضية باستخدام" نموذج دائرة تدفق فون ويليبراند عامل-الصفائح الدموية "تشكيل سلسلة"

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

مسح بقايا عظام لكثافة العظام المعدنية في سياقات الطب الشرعي

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

الصغير-تشريح الجهاز المينا من الفك السفلي القاطعة للفئران المعرضة إلى سميات البيئية

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

تحديد موسع من دوامة تشكيل الوقت باستخدام تخطيط صدى القلب المريء أثناء جراحة القلب

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...