Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Forfatterne takker Libby Perry (Augusta University) for hendes hjælp med SEM-prøveforberedelsen. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) og K99HL146954 (BS)] og American Heart Association [17POST33661254 (BS)].

BEMÆRK: Følgende er en generel protokol, der bruges til at kvantificere membranflæsedannelse i RAW 264.7 makrofager ved hjælp af SEM-mikroskopi. Optimering kan være påkrævet for forskellige celletyper.
1. Cellelinje og cellekultur
<ol><li>Dyrk RAW 264,7 makrofager i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% (vol/vol) varmeinaktiveret føtal bovin serum (FBS), 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Udskif...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

Den nuværende SEM-billeddannelsesprotokol giver et værktøj til at visualisere og kvantificere membranflæsedannelse, cirkulære fremspring og makropinocytiske kopper på celleoverfladen in vitro. Selvom den nuværende protokol fokuserer på makrofager, har undersøgelser vist, at membranflæsedannelse også forekommer på forskellige andre celletyper, herunder dendritiske celler, fibroblaster, neuroner og kræftceller 11,12,14,21,30.<sup cl...

Makropinocytose er en endocytisk proces, der er ansvarlig for internalisering af en stor mængde ekstracellulær væske og dens indhold via dannelsen af dynamiske og aktindrevne plasmamembranfremspring kaldet membranflæser1. Mange af disse membranflæser danner kopper, der lukker og smelter tilbage på cellen og adskilles fra plasmamembranen som store, heterogene intracellulære endosomer, også kendt som makropinosomer1. Selvom makropinocytose induceres af vækstfaktorer som makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og epidermal vækstfaktor (EGF) i en lang række celletyper, er der også observeret en yderligere unik, calciumafhængig proces kendt som konstitutiv makropinocytose i medfødte immunceller 2,3,4,5,6,7,8.
Cellernes evne til at internalisere ekstracellulært materiale via makropinocytose har vist sig at spille en vigtig rolle i en række fysiologiske processer, der spænder fra næringsoptagelse til patogenfangst og antigenpræsentation 9,10,11. Men fordi denne proces er ikke-selektiv og inducerbar, har den også været impliceret i en række patologiske tilstande. Faktisk foreslog tidligere undersøgelser, at makropinocytose spiller en vigtig rolle i Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, kræft, nefrolitose og aterosklerose 12,13,14,15,16. Desuden har visse bakterier og vira vist sig at udnytte makropinocytose til at få adgang til værtsceller og fremkalde infektion 17,18. Interessant nok kan stimulering af makropinocytose også udnyttes til målrettet levering af terapeutiske midler under forskellige sygdomstilstande 19,20.
Tidligere undersøgelser har undersøgt makropinocytose ved at kvantificere internaliserede fluorescerende mærkede væskefasemarkører i fravær og tilstedeværelse af farmakologiske midler, der hæmmer makropinocytose ved hjælp af flowcytometri og konfokal billeddannelse21,22. Aktuelt tilgængelige farmakologiske værktøjer, der hæmmer makropinocytose, er begrænset til og består af 1) actinpolymerisationshæmmere (cytochalasin D og latrunculiner), 2) PI3K-blokkere (LY-290042 og wortmannin) og 3) hæmmere af natriumhydrogenbyttere (NHE) (amilocid og EIPA)5,14,15,23,24,25 . Men fordi disse hæmmere har endocytose uafhængige virkninger, er det vanskeligt selektivt at bestemme makropinocytose bidrag til opløst optagelse og sygdomspatogenese, især in vivo21.
Scanning elektronmikroskopi (SEM) er en type elektronmikroskop, der producerer ultrahøjopløselige billeder af celler ved hjælp af en fokuseret stråle af elektroner26. I makropinocytoseforskning betragtes SEM-billeddannelse som guldstandardteknikken til at visualisere topografiske og morfologiske egenskaber ved plasmamembranen, kvantificere membranflæsedannelse og undersøge deres progression mod makropinosominternalisering. Desuden giver scanningselektronmikroskopi kombineret med kvantificering af opløst stofoptagelse i nærvær og fravær af makropinocytoseblokkere en pålidelig strategi til undersøgelse af makropinocytotisk solintualisering in vitro. Dette papir giver en detaljeret protokol om, hvordan man forbereder celler til SEM, visualiserer celleoverfladen, kvantificerer flæsedannelse og undersøger deres fremskridt mod koplukning og makropinosominternalisering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

Membranruffling er dannelsen af bevægelige plasmamembranfremspring indeholdende et meshwork af nyligt polymeriserede actinfilamenter. Membranflæser kan dannes spontant eller som reaktion på vækstfaktorer, inflammatoriske cytokiner og phorbolestere. Nogle af membranfremspringene kan omorganisere sig i cirkulære membranflæser, der smelter sammen ved deres distale margener og danner kopper, der lukker og adskiller sig i cytoplasmaet som store, heterogene vakuoler kaldet makropinosomer. Under processen fælder flæser ekstracellulær væske og opløste stoffer, der internaliserer i makropinosomer. Højopløselig scanningselektronmikroskopi (SEM) er en almindeligt anvendt billeddannelsesteknik til at visualisere og kvantificere membranflæsedannelse, cirkulære fremspring og lukkede makropinocytiske kopper på celleoverfladen. Følgende protokol beskriver cellekulturbetingelserne, stimulering af membranflæsedannelsen in vitro, og hvordan man fikserer, dehydrerer og forbereder celler til billeddannelse ved hjælp af SEM. Kvantificering af membranruffling, datanormalisering og stimulatorer og hæmmere af membranflæsedannelse er også beskrevet. Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om makropinocytoseens rolle i fysiologiske og patologiske processer, undersøge nye mål, der regulerer dannelsen af membranflæser, og identificere endnu ukarakteriserede fysiologiske stimulatorer samt nye farmakologiske hæmmere af makropinocytose.

Her beskriver vi resultaterne fra den præsenterede teknik. Repræsentative SEM-billeder vist i figur 1 viser dannelse af membranflæser i RAW 264.7 makrofager efter behandling med PMA og M-CSF. Billeder blev først taget ved en forstørrelse på 3.500x til kvantificeringsformål og derefter ved højere forstørrelsesniveauer (8.500x til 16.000x) for at vise plasmamembranen ved større detaljer. Forbehandling af makrofager med makropinocytosehæmmeren EIPA-svækket membranflæsedannelse (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Makropinocytose er en stærkt bevaret endocytisk proces initieret ved dannelsen af F-actinrige arklignende membranfremspring, også kendt som membranflæser. Øget hastighed af makropinocytotisk solind internalisering har været impliceret i forskellige patologiske tilstande. Denne protokol præsenterer en metode til at kvantificere membranflæsedannelse in vitro ved hjælp af scanningselektronmikroskopi.

Visualisering af membranflæsedannelse ved hjælp af scanningselektronmikroskopi

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Den nuværende SEM-billeddannelsesprotokol giver et værktøj til at visualisere og kvantificere membranflæsedannelse, cirkulære fremspring og makropinocytiske kopper på celleoverfladen in vitro. SEM giver billeder i høj opløsning af celleoverfladen, der kan bruges til at visualisere makropinocytiske membranaktiviteter. Denne teknik kan bruges til at opdage nye signalveje, der regulerer makropinocytose, og identificere nye stimulatorer og hæmmere af mikropinocytose.Begynd med at placere sterile glasdækselsedler i brønde på en 24-brønds plade ved hjælp af autoklavede tang. Derefter glider frø rå 264,7 makrofager på dækslet med en tæthed på 10 til de sjette celler pr. Milliliter og inkuberer pladen natten over i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Den følgende dag skal du udskifte mediet i hver brønd med 500 mikroliter friske komplette medier og derefter forbehandle makrofagerne i 30 minutter med en køretøjskontrol som DMSO eller en makropinocytosehæmmer såsom EIPA.For at fremme membranruffling skal du behandle cellerne i 30 minutter med makropinocytosestimulatorer, såsom en en-mikromolær PMA-opløsning eller 100 nanogram pr. Milliliter makrofagkolonistimulerende faktor. For at fastgøre cellerne til scanning af elektronmikroskopi skal du aspirere medierne fra brøndene og vaske dækslet glider to gange med iskold PBS og derefter inkubere dækslet glider i et fikseringsmiddel i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af inkubation natten over ved fire grader Celsius. Den følgende dag, uden at forstyrre cellemonolaget, vaskes forsigtigt og derefter inkuberes dækslipsene i 500 mikroliter 0,1-motor natriumkacodylat i 15 minutter.Efter to vaske med 500 mikroliter destilleret vand vaskes dækslet to gange i 500 mikroliter af en gradueret ethanolserie med en 10-minutters inkubation i hver vask. For at udføre kritisk punkttørring skal du placere dækslet i en kritisk punkttørrer og dække dem med 100% ethanol. Tryk derefter på tænd / sluk-knappen, og åbn kuldioxidtanken.Tryk på cool-knappen i ca. 30 sekunder, indtil temperaturen falder til nul grader Celsius. Tryk derefter på udfyldningsknappen, indtil der vises en boble i kammervinduet. Tryk derefter på udrensningsknappen, indtil lugten af ethanol fra udrensningsudstødningen forsvinder.Tryk derefter på den kølige knap igen, indtil temperaturen falder til nul grader Celsius. Tryk på knapperne fuld og rens igen for at slukke for dem. Luk derefter kuldioxidtanken.Tryk på den kølige bund igen for at slukke for den, og tryk derefter på varmeknappen. Indstil temperaturen til 42 grader Celsius og tryk til 1.200 pund pr. Kvadrattomme. Når trykket og temperaturen er stabiliseret, skal du trykke på udluftningsknappen for at lade trykket falde langsomt.Når kammertrykket når 150 pund pr. Kvadrattomme, skal du trykke på udluftningsbunden og vente, indtil trykket falder til nul pund pr. Kvadrattomme. Sluk for tørretumbleren med kritisk punkt, og fjern dækslet. Ved hjælp af kulklæbende vandhaner skal du derefter montere dækslipsene på aluminiumsprøvebeslagene til scanning af elektronmikroskopi og derefter fortsætte med at sputterbelægning ved hjælp af guld eller palladium i en sputtercoater.Tænd for tænd / sluk-knappen på sputtercoateren. Når vakuumet når 30 millitorr, skylles kammeret for at fjerne fugt og luft ved at slukke for gasafbryderen og dreje den fine gasventil mod uret. Når vakuumet stiger til 200 millitorr, skal du slukke for gasafbryderen og vente, indtil vakuumet når 30 millitorr.Skyl derefter kammeret igen for at fjerne fugt og luft som vist. Når du har skyllet kammeret tre gange, skal du trykke på timerbunden og justere spændingsknappen, indtil måleren læser 10 milliampere. Fjern derefter de belagte dæksedler fra kammeret.For at visualisere og kvantificere membranflæserne skal du indsætte prøvedækslet i kammeret i et scanningselektronmikroskop, lukke døren og trykke på evac-knappen. Åbn mikroskopets driftssoftware, og indstil den accelererende spænding til 15 kilovolt og arbejdsafstanden til 10 millimeter. Tryk på knappen Koordinater, og flyt rundt på controlleren, indtil cellerne vises i midten af observationsskærmen.Indstil forstørrelsen til 3.500 X, og aftryk eksemplet ved at klikke på knappen Foto. Her ses repræsentative scanningselektronmikroskopibilleder, der viser membranflæsedannelse i rå 264,7 makrofager efter behandling med PMA og makrofagkolonistimulerende faktor. Forbehandling af makrofager med makropinocytosehæmmeren EIPA dæmper dannelsen af membranflæser.Under flæsedannelse gennemgår plasmamembranen forskellige morfologiske stadier, herunder et arklignende membranfremspring, en C-formet membranflæser og en makropinocytisk kop. Membranflæsedannelse efter PMA- og makrofagkolonistimulerende faktorbehandlinger kan kvantificeres ved hjælp af scanningselektronmikroskopi, mens makropinosomdannelse kan bekræftes ved alternative billeddannelsesteknikker, såsom konfokal mikroskopi ved hjælp af Texas red dextran og FM4-64. De blå pile indikerer membranruffling, mens de gule og grønne pile peger på mikropinosomerne.Endelig kan makropinocytose bekræftes og kvantificeres gennem flowcytometri ved hjælp af en fluorescerende væskefasemarkør såsom FITC eller Texas red dextran. Ud over SEM kan levende cellebilleddannelse og flowcytometrianalyse af fluorescerende mærket dextran-internalisering også udføres for at undersøge og kvantificere makropinocytose.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantificering Glomerular fyldbarhed Fluorescent Macromolecules Brug 2-Photon mikroskopi i München Wistarrotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Dannelse af humane prostata Epitel Brug Tissue rekombination af Rodent Urogenital Sinus mesenkymet og menneskelige stamceller

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Ved hjælp af en Laminering teknik til at udføre Konfokal mikroskopi af det menneskelige Sclera


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering af leukocytinfiltrat i en murin model af Fulminant Myocarditis ved lysarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

fremstilling og<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering af Magnetized miR-modificerede endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Undersøge von Willebrands faktor Patofysiologi bruger en Flow kammer Model af von Willebrand faktor-trombocyttal streng dannelse

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

Scanning skeletrester for knoglemineraltætheden i retsmedicinske sammenhænge

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Mikro-dissektion af emalje orgel fra Mandibular chopper rotter udsat for miljømæssige giftige stoffer

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Noninvasiv bestemmelse af Vortex dannelsen tid ved hjælp af Transesophageal ekkokardiografi under hjertekirurgi

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...