Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

De auteurs bedanken Libby Perry (Augusta University) voor haar hulp bij de SEM-monstervoorbereiding. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) en K99HL146954 (B.S.)] en American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].

OPMERKING: Het volgende is een algemeen protocol dat wordt gebruikt om de vorming van membraanrommels in RAW 264.7-macrofagen te kwantificeren met behulp van SEM-microscopie. Optimalisatie kan nodig zijn voor verschillende celtypen.
1. Cellijn en celkweek
<ol><li>Kweek RAW 264,7 macrofagen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% (vol/vol) warmte-geïnactiveerd Foetaal Runderserum (FBS), 100 IE/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een bevochtigde incubator bij 37...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

Het huidige SEM-beeldvormingsprotocol biedt een hulpmiddel om membraanrommelvorming, cirkelvormige uitsteeksels en macropinocytische cups op het celoppervlak in vitro te visualiseren en te kwantificeren. Hoewel het huidige protocol zich richt op macrofagen, hebben studies aangetoond dat membraanrommelvorming ook voorkomt op verschillende andere celtypen, waaronder dendritische cellen, fibroblasten, neuronen en kankercellen 11,12,14,21,30.<sup ...

Macropinocytose is een endocytisch proces dat verantwoordelijk is voor het internaliseren van een grote hoeveelheid extracellulaire vloeistof en de inhoud ervan via de vorming van dynamische en actine-aangedreven plasmamembraanuitsteeksels die membraanruches worden genoemd1. Veel van deze membraanruches vormen cups die sluiten en terugsmelten naar de cel en scheiden van het plasmamembraan als grote, heterogene intracellulaire endosomen, ook bekend als macropinosomen1. Hoewel macropinocytose wordt geïnduceerd door groeifactoren zoals macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) en epidermale groeifactor (EGF) in een breed scala van celtypen, is een extra uniek, calciumafhankelijk proces dat bekend staat als constitutieve macropinocytose ook waargenomen in aangeboren immuuncellen 2,3,4,5,6,7,8.
Het is aangetoond dat het vermogen van cellen om extracellulair materiaal te internaliseren via macropinocytose een belangrijke rol speelt in een verscheidenheid aan fysiologische processen, variërend van opname van voedingsstoffen tot het vangen van pathogenen en de presentatie van antigeen 9,10,11. Omdat dit proces echter niet-selectief en induceerbaar is, is het ook betrokken bij een aantal pathologische aandoeningen. Inderdaad, eerdere studies suggereerden dat macropinocytose een belangrijke rol speelt bij de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, kanker, nefrolithiasis en atherosclerose 12,13,14,15,16. Bovendien hebben bepaalde bacteriën en virussen aangetoond macropinocytose te gebruiken om toegang te krijgen tot gastheercellen en infectie te induceren17,18. Interessant is dat stimulatie van macropinocytose ook kan worden gebruikt voor gerichte toediening van therapeutische middelen in verschillende ziekteomstandigheden 19,20.
Eerdere studies hebben macropinocytose onderzocht door geïnternaliseerde fluorescerend gelabelde vloeistoffasemarkers te kwantificeren in afwezigheid en aanwezigheid van farmacologische middelen die macropinocytose remmen met behulp van flowcytometrie en confocale beeldvorming21,22. Momenteel beschikbare farmacologische hulpmiddelen die macropinocytose remmen, zijn beperkt tot en bestaan uit 1) actinepolymerisatieremmers (cytochalasine D en latrunculinen), 2) PI3K-blokkers (LY-290042 en wortmannine) en 3) remmers van natriumwaterstofwisselaars (NHE) (amiloride en EIPA)5,14,15,23,24,25 . Omdat deze remmers echter endocytose-onafhankelijke effecten hebben, is het moeilijk om selectief de bijdrage van macropinocytose aan de opname van opgeloste stoffen en de pathogenese van ziekten te bepalen, vooral in vivo21.
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een type elektronenmicroscoop dat beelden met ultrahoge resolutie van cellen produceert met behulp van een gerichte bundel elektronen26. In macropinocytose-onderzoek wordt SEM-beeldvorming beschouwd als de gouden standaardtechniek om topografische en morfologische kenmerken van het plasmamembraan te visualiseren, membraanrommelvorming te kwantificeren en hun progressie naar macropinosoominternalisatie te onderzoeken. Bovendien biedt scanning elektronenmicroscopie in combinatie met de kwantificering van de opname van opgeloste stoffen, in de aan- en afwezigheid van macropinocytoseblokkers, een betrouwbare strategie om de internalisatie van macropinocytotische opgeloste stoffen in vitro te onderzoeken. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol over hoe cellen voor te bereiden op SEM, het celoppervlak te visualiseren, ruchesvorming te kwantificeren en hun voortgang naar bekersluiting en macropinosoominternalisatie te onderzoeken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

Membraanrommel is de vorming van beweeglijke plasmamembraanuitsteeksels die een maaswerk van nieuw gepolymeriseerde actinefilamenten bevatten. Membraanrusels kunnen zich spontaan vormen of als reactie op groeifactoren, inflammatoire cytokines en phorbolesters. Sommige van de membraanuitsteeksels kunnen reorganiseren in cirkelvormige membraanrukels die aan hun distale randen samensmelten en kopjes vormen die sluiten en scheiden in het cytoplasma als grote, heterogene vacuolen die macropinosomen worden genoemd. Tijdens het proces vangen ruches extracellulaire vloeistof en opgeloste stoffen op die zich internaliseren binnen macropinosomen. Hoge resolutie scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een veelgebruikte beeldvormingstechniek om de vorming van membraanrommels, cirkelvormige uitsteeksels en gesloten macropinocytische cups op het celoppervlak te visualiseren en te kwantificeren. Het volgende protocol beschrijft de celkweekomstandigheden, stimulatie van de membraanrommelvorming in vitro en hoe cellen te fixeren, uitdrogen en voorbereiden voor beeldvorming met behulp van SEM. Kwantificering van membraanruling, gegevensnormalisatie en stimulatoren en remmers van membraanrommelvorming worden ook beschreven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de rol van macropinocytose in fysiologische en pathologische processen, het onderzoeken van nieuwe doelen die de vorming van membraanrommel reguleren en het identificeren van nog niet-gekarakteriseerde fysiologische stimulatoren en nieuwe farmacologische remmers van macropinocytose.

Hier beschrijven we de resultaten van de gepresenteerde techniek. Representatieve SEM-beelden in figuur 1 tonen de vorming van membraanrommels in RAW 264.7 macrofagen na behandeling met PMA en M-CSF. Beelden werden eerst vastgelegd met een vergroting van 3.500x voor kwantificeringsdoeleinden en vervolgens met hogere vergrotingsniveaus (8.500x tot 16.000x) om het plasmamembraan op grotere details te laten zien. Voorbehandeling van macrofagen met de macropinocytoseremmer EIPA verzwakte membraa...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Macropinocytose is een sterk geconserveerd endocytisch proces geïnitieerd door de vorming van F-actine-rijke plaatachtige membraanprojecties, ook bekend als membraanrulingen. Verhoogde snelheid van macropinocytotische opgeloste stof internalisatie is betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen. Dit protocol presenteert een methode om de vorming van membraanrommels in vitro te kwantificeren met behulp van scanning elektronenmicroscopie.

Visualisatie van membraanrommelvorming met behulp van Scanning Electron Microscopie

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Het huidige SEM-beeldvormingsprotocol biedt een hulpmiddel om membraanrommelvorming, cirkelvormige uitsteeksels en macropinocytische cups op het celoppervlak in vitro te visualiseren en te kwantificeren. SEM biedt beelden met een hoge resolutie van het celoppervlak die kunnen worden gebruikt om macropinocytische membraanactiviteiten te visualiseren. Deze techniek kan worden gebruikt om nieuwe signaalroutes te ontdekken die macropinocytose reguleren en nieuwe stimulatoren en remmers van micropinocytose te identificeren.Begin met het plaatsen van steriele glazen afdeksels in putten van een 24-putplaat met behulp van een geautoclaveerde tang. Zaai vervolgens ruwe 264,7 macrofagen op de afdekslips met een dichtheid van 10 tot de zesde cellen per milliliter en incubeer de plaat een nacht in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervang de volgende dag de media in elke put door 500 microliter verse complete media en behandel de macrofagen vervolgens gedurende 30 minuten voor met een voertuigcontrole zoals DMSO of een macropinocytoseremmer zoals EIPA.Om vervolgens membraanrommel te bevorderen, behandelt u de cellen gedurende 30 minuten met macropinocytosestimulatoren, zoals een één-micromolaire PMA-oplossing of 100 nanogram per milliliter macrofaagkoloniestimulerende factor. Om de cellen te fixeren voor scanning elektronenmicroscopie, zuigt u de media uit de putten en wast u de afdekzeilslips twee keer met ijskoude PBS en incubeert u vervolgens de afdekslips in een fixatief gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende dag, zonder de celmonolaag te verstoren, was en incubeer vervolgens de afdeksels in 500 microliter 0,1-motor natriumcacodylaat gedurende 15 minuten.Na twee wasbeurten met 500 microliter gedestilleerd water, wast u de afdekking twee keer in 500 microliter van een gesorteerde ethanolserie met een incubatie van 10 minuten in elke wasbeurt. Om het drogen van kritieke punten uit te voeren, plaatst u de afdekzeilslips in een droger met kritieke punten en bedekt u ze met 100% ethanol. Druk vervolgens op de aan / uit-knop en open de kooldioxidetank.Druk ongeveer 30 seconden op de koelknop totdat de temperatuur daalt tot nul graden Celsius. Druk vervolgens op de vulknop totdat er een bel in het kamervenster verschijnt. Druk vervolgens op de spoelknop totdat de geur van ethanol uit de spoeluitlaat verdwijnt.Druk vervolgens nogmaals op de koelknop totdat de temperatuur daalt tot nul graden Celsius. Druk opnieuw op de knoppen Vol en verwijder ze om ze uit te schakelen. Sluit vervolgens de kooldioxidetank.Druk opnieuw op de koele bodem om deze uit te schakelen en druk vervolgens op de warmteknop. Stel de temperatuur in op 42 graden Celsius en de druk op 1.200 pond per vierkante inch. Zodra de druk en temperatuur stabiliseren, drukt u op de ontluchtingsknop om de druk langzaam te laten afnemen.Zodra de kamerdruk 150 pond per vierkante inch bereikt, drukt u op de ontluchtingsbodem en wacht u tot de druk afneemt tot nul pond per vierkante inch. Schakel de kritische puntdroger uit en verwijder de afdekslipjes. Monteer vervolgens met behulp van koolstofklevende kranen de afdekslips op de aluminium monsterbevestigingen voor scanningelektronenmicroscopie en ga vervolgens verder met sputtercoating met goud of palladium in een sputtercoater.Schakel de aan/uit-knop van de sputtercoater in. Nadat het vacuüm 30 millitorrs heeft bereikt, spoelt u de kamer om vocht en lucht te verwijderen door de gasschakelaar uit te schakelen en de fijne gasklep tegen de klok in te draaien. Zodra het vacuüm toeneemt tot 200 millitorrs, schakelt u de gasschakelaar uit en wacht u tot het vacuüm 30 millitorrs bereikt.Spoel vervolgens de kamer opnieuw om vocht en lucht te verwijderen zoals aangetoond. Nadat u de kamer drie keer hebt gespoeld, drukt u op de onderkant van de timer en past u de spanningsknop aan totdat de meter 10 milliamperes aangeeft. Verwijder vervolgens de gecoate afdekslipjes uit de kamer.Om de membraanruches te visualiseren en te kwantificeren, plaatst u de monsterafdekking in de kamer van een scanning-elektronenmicroscoop, sluit u de deur en drukt u op de evac-knop. Open de microscoopbedieningssoftware en stel de versnellingsspanning in op 15 kilovolt en de werkafstand op 10 millimeter. Druk op de knop Coördinaten en beweeg rond de controller totdat de cellen in het midden van het observatiescherm verschijnen.Stel de vergroting in op 3, 500 X en maak een afbeelding van het voorbeeld door op de knop Foto te klikken. Hier zijn representatieve scanning elektronenmicroscopie beelden, die membraan ruches vorming in ruwe 264.7 macrofagen aantonen na behandeling met PMA en macrofaag kolonie stimulerende factor. Voorbehandeling van macrofagen met de macropinocytoseremmer EIPA verzwakt de vorming van membraanrommels.Tijdens de vorming van ruches ondergaat het plasmamembraan verschillende morfologische stadia, waaronder een plaatachtig membraanuitsteeksel, een C-vormige membraanruche en een macropinocytische beker. Membraanroesvorming na PMA- en macrofaagkoloniestimulerende factorbehandelingen kan worden gekwantificeerd met behulp van scanningelektronenmicroscopie, terwijl macropnersoomvorming kan worden bevestigd door alternatieve beeldvormingstechnieken, zoals confocale microscopie met behulp van Texas red dextran en FM4-64. De blauwe pijlen geven membraanrommel aan, terwijl de gele en groene pijlen naar de micropinosomen wijzen.Ten slotte kan macropinocytose worden bevestigd en gekwantificeerd door middel van flowcytometrie met behulp van een fluorescerende vloeistoffasemarker zoals FITC of Texas red dextran. Naast SEM kan ook live cell imaging en flowcytometrie-analyse van fluorescerend gelabelde dextran internalisatie worden uitgevoerd om macropinocytose te onderzoeken en te kwantificeren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Met behulp van een lamineren techniek om te presteren confocale microscopie van de Human Sclera


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Onderzoeken van von Willebrand Factor pathofysiologie met behulp van een Flow kamer Model van von Willebrand Factor-bloedplaatjes String vorming

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

Scannen skelet blijft voor bot mineraal dichtheid in een forensische context

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Micro-dissectie van glazuur orgel van snijtand van ratten blootgesteld aan toxische stoffen in het milieu

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Noninvasive bepaling van Vortex vorming tijd met behulp van Transesophageal echocardiografie tijdens Cardiale Heelkunde

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...