Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Les auteurs remercient Libby Perry (Université Augusta) pour son aide dans la préparation de l’échantillon SEM. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) et K99HL146954 (B.S.)] et l’American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].

REMARQUE: Ce qui suit est un protocole général utilisé pour quantifier la formation de volants membranaires dans les macrophages RAW 264.7 à l’aide de la microscopie SEM. Une optimisation peut être nécessaire pour différents types de cellules.
1. Lignée cellulaire et culture cellulaire
<ol><li>Cultiver des macrophages RAW 264,7 dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% (vol/vol) de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 100 UI/mL de pénicilli...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

Le protocole d’imagerie SEM actuel fournit un outil pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupes macropinocytaires à la surface de la cellule in vitro. Bien que le protocole actuel se concentre sur les macrophages, des études ont montré que la formation de volants membranaires se produit également sur divers autres types de cellules, y compris les cellules dendritiques, les fibroblastes, les neurones et les cellules...

La macropinocytose est un processus endocytaire responsable de l’internalisation d’une grande quantité de liquide extracellulaire et de son contenu via la formation de protubérances membranaires dynamiques et entraînées par l’actine appelées volants membranaires1. Beaucoup de ces volants membranaires forment des coupelles qui se ferment et fusionnent sur la cellule et se séparent de la membrane plasmique sous forme de gros endosomes intracellulaires hétérogènes également connus sous le nom de macropinosomes1. Bien que la macropinocytose soit induite par des facteurs de croissance tels que le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et le facteur de croissance épidermique (EGF) dans un large éventail de types de cellules, un processus unique et dépendant du calcium connu sous le nom de macropinocytose constitutive a également été observé dans les cellules immunitaires innées 2,3,4,5,6,7,8.
Il a été démontré que la capacité des cellules à internaliser le matériel extracellulaire par macropinocytose joue un rôle important dans divers processus physiologiques allant de l’absorption des nutriments à la capture des agents pathogènes et à la présentation des antigènes 9,10,11. Cependant, parce que ce processus est non sélectif et inductible, il a également été impliqué dans un certain nombre de conditions pathologiques. En effet, des études antérieures ont suggéré que la macropinocytose joue un rôle important dans la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, le cancer, la néphrolithiase et l’athérosclérose 12,13,14,15,16. De plus, il a été démontré que certaines bactéries et certains virus utilisent la macropinocytose pour pénétrer dans les cellules hôtes et induire une infection17,18. Fait intéressant, la stimulation de la macropinocytose peut également être exploitée pour l’administration ciblée d’agents thérapeutiques dans diverses maladies19,20.
Des études antérieures ont exploré la macropinocytose en quantifiant les marqueurs de phase fluide intériorisés marqués par fluorescence en l’absence et en présence d’agents pharmacologiques qui inhibent la macropinocytose à l’aide de la cytométrie en flux et de l’imagerie confocale21,22. Les outils pharmacologiques actuellement disponibles qui inhibent la macropinocytose sont limités et comprennent 1) des inhibiteurs de polymérisation de l’actine (cytochalasine D et latrunculines), 2) des bloqueurs PI3K (LY-290042 et wortmannine) et 3) des inhibiteurs des échangeurs d’hydrogène sodique (NHE) (amiloride et EIPA)5,14,15,23,24,25 . Cependant, comme ces inhibiteurs ont des effets indépendants de l’endocytose, il est difficile de déterminer sélectivement la contribution de la macropinocytose à l’absorption du soluté et à la pathogenèse de la maladie, en particulier in vivo21.
La microscopie électronique à balayage (MEB) est un type de microscope électronique qui produit des images à ultra-haute résolution de cellules à l’aide d’un faisceau focalisé d’électrons26. Dans la recherche sur la macropinocytose, l’imagerie SEM est considérée comme la technique de référence pour visualiser les caractéristiques topographiques et morphologiques de la membrane plasmique, quantifier la formation de volants membranaires et étudier leur progression vers l’internalisation des macropinosomes. En outre, la microscopie électronique à balayage combinée à la quantification de l’absorption du soluté, en présence et en l’absence de bloqueurs de macropinocytose, fournit une stratégie fiable pour examiner l’internalisation du soluté macropinocytotique in vitro. Cet article fournit un protocole détaillé sur la façon de préparer les cellules pour le SEM, de visualiser la surface cellulaire, de quantifier la formation de volants et d’examiner leurs progrès vers la fermeture de la coupe et l’internalisation des macropinosomes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

L’ébouriffement membranaire est la formation de protubérances mobiles de membranes plasmiques contenant un maillage de filaments d’actine nouvellement polymérisés. Les volants membranaires peuvent se former spontanément ou en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines inflammatoires et des esters de phorbol. Certaines des protubérances membranaires peuvent se réorganiser en volants membranaires circulaires qui fusionnent à leurs marges distales et forment des coupelles qui se ferment et se séparent dans le cytoplasme sous forme de grandes vacuoles hétérogènes appelées macropinosomes. Au cours du processus, les volants piègent le liquide extracellulaire et les solutés qui s’internalisent dans les macropinosomes. La microscopie électronique à balayage (MEB) à haute résolution est une technique d’imagerie couramment utilisée pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupelles macropinocytaires fermées à la surface de la cellule. Le protocole suivant décrit les conditions de culture cellulaire, la stimulation de la formation de volants membranaires in vitro et la façon de fixer, de déshydrater et de préparer les cellules à l’imagerie à l’aide du MEB. La quantification des volants membranaires, la normalisation des données et les stimulateurs et inhibiteurs de la formation de volants membranaires sont également décrits. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle de la macropinocytose dans les processus physiologiques et pathologiques, à étudier de nouvelles cibles qui régulent la formation des volants membranaires et à identifier des stimulateurs physiologiques encore non caractérisés ainsi que de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques de la macropinocytose.

Ici, nous décrivons les résultats de la technique présentée. Les images SEM représentatives montrées à la figure 1 montrent la formation de volants membranaires dans les macrophages RAW 264.7 après un traitement par PMA et M-CSF. Les images ont d’abord été capturées à un grossissement de 3 500x à des fins de quantification, puis à des niveaux de grossissement plus élevés (8 500x à 16 000x) pour montrer la membrane plasmique avec plus de détails. Le prétraitement des macr...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

La macropinocytose est un processus endocytaire hautement conservé initié par la formation de projections membranaires en feuille riches en F-actine, également connues sous le nom de volants membranaires. L’augmentation du taux d’internalisation du soluté macropinocytotique a été impliquée dans diverses conditions pathologiques. Ce protocole présente une méthode pour quantifier la formation de volants membranaires in vitro à l’aide de la microscopie électronique à balayage.

Visualisation de la formation de volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Le protocole d’imagerie SEM actuel fournit un outil pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupes macropinocytaires à la surface de la cellule in vitro. SEM fournit des images haute résolution de la surface cellulaire qui peuvent être utilisées pour visualiser les activités de la membrane macropinocytaire. Cette technique peut être utilisée pour découvrir de nouvelles voies de signalisation régulant la macropinocytose et identifier de nouveaux stimulateurs et inhibiteurs de la micropinocytose.Commencez par placer des glissières de couverture en verre stérile dans les puits d’une plaque de 24 puits à l’aide de pinces autoclavées. Ensuite, ensemencez 264,7 macrophages bruts sur la couverture glisse à une densité de 10 à la sixième cellule par millilitre et incubez la plaque pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez les milieux dans chaque puits par 500 microlitres de milieux complets frais, puis prétraitez les macrophages pendant 30 minutes avec un contrôle de véhicule tel que le DMSO ou un inhibiteur de macropinocytose tel que l’EIPA.Ensuite, pour favoriser l’ébouriffement de la membrane, traitez les cellules pendant 30 minutes avec des stimulateurs de macropinocytose, tels qu’une solution de PMA à un micromolaire ou 100 nanogrammes par millilitre de facteur stimulant les colonies de macrophages. Pour fixer les cellules pour la microscopie électronique à balayage, aspirez le milieu des puits et lavez les feuillets de couverture deux fois avec du PBS glacé, puis incubez les glissements de couverture dans un fixateur pendant 30 minutes à température ambiante, suivie d’une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain, sans déranger la monocouche cellulaire, lavez doucement puis incubez les feuillets de couverture dans 500 microlitres de cacodylate de sodium à 0,1 moteur pendant 15 minutes.Après deux lavages avec 500 microlitres d’eau distillée, lavez les couvercles deux fois dans 500 microlitres d’une série d’éthanol gradué avec une incubation de 10 minutes à chaque lavage. Pour effectuer un séchage aux points critiques, placez les glissières de couverture dans un séchoir à points critiques et recouvrez-les d’éthanol à 100%. Ensuite, appuyez sur le bouton d’alimentation et ouvrez le réservoir de dioxyde de carbone.Appuyez sur le bouton de refroidissement pendant environ 30 secondes jusqu’à ce que la température diminue à zéro degré Celsius. Ensuite, appuyez sur le bouton de remplissage jusqu’à ce qu’une bulle apparaisse dans la fenêtre de la chambre. Ensuite, appuyez sur le bouton de purge jusqu’à ce que l’odeur d’éthanol de l’échappement de purge disparaisse.Ensuite, appuyez à nouveau sur le bouton de refroidissement jusqu’à ce que la température diminue à zéro degré Celsius. Appuyez à nouveau sur les boutons plein et purge pour les éteindre. Ensuite, fermez le réservoir de dioxyde de carbone.Appuyez à nouveau sur le fond froid pour l’éteindre, puis appuyez sur le bouton de chauffage. Réglez la température à 42 degrés Celsius et la pression à 1 200 livres par pouce carré. Une fois la pression et la température stabilisées, appuyez sur le bouton de purge pour permettre à la pression de diminuer lentement.Une fois que la pression de la chambre atteint 150 livres par pouce carré, appuyez sur le fond de l’évent et attendez que la pression diminue à zéro livre par pouce carré. Éteignez le séchoir à points critiques et retirez les glissières de couverture. Ensuite, à l’aide de robinets adhésifs au carbone, montez les glissières de couverture sur les supports d’échantillon en aluminium pour la microscopie électronique à balayage, puis procédez au revêtement de pulvérisation à l’aide d’or ou de palladium dans un enduit de pulvérisation.Allumez le bouton d’alimentation de l’enduit de pulvérisation. Une fois que le vide atteint 30 millitorrs, rincez la chambre pour éliminer l’humidité et l’air en éteignant l’interrupteur à gaz et en tournant la vanne de gaz fin dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Une fois que le vide augmente à 200 millitorrs, éteignez l’interrupteur à gaz et attendez que le vide atteigne 30 millitorrs.Ensuite, rincez à nouveau la chambre pour éliminer l’humidité et l’air comme démontré. Après avoir rincé la chambre trois fois, appuyez sur le fond de la minuterie et ajustez le bouton de tension jusqu’à ce que la jauge indique 10 milliampères. Ensuite, retirez les glissements de couverture enduits de la chambre.Pour visualiser et quantifier les volants de la membrane, insérez les glissements du couvercle de l’échantillon dans la chambre d’un microscope électronique à balayage, fermez la porte et appuyez sur le bouton d’évacuation. Ouvrez le logiciel d’exploitation du microscope et réglez la tension d’accélération à 15 kilovolts et la distance de travail à 10 millimètres. Appuyez sur le bouton Coordonnées et déplacez-vous autour du contrôleur jusqu’à ce que les cellules apparaissent au centre de l’écran d’observation.Réglez le grossissement sur 3 500 X et imagez l’échantillon en cliquant sur le bouton Photo. Voici des images représentatives de microscopie électronique à balayage, démontrant la formation de volants membranaires dans 264,7 macrophages bruts après traitement par PMA et facteur de stimulation des colonies de macrophages. Le prétraitement des macrophages avec l’inhibiteur de macropinocytose EIPA atténue la formation de volants membranaires.Au cours de la formation des volants, la membrane plasmique subit des étapes morphologiques distinctes, notamment une saillie membranaire en forme de feuille, un volant membranaire en forme de C et une coupe macropinocytaire. La formation de volants membranaires après des traitements de facteur de stimulation des colonies de PMA et de macrophages peut être quantifiée à l’aide de la microscopie électronique à balayage, tandis que la formation de macropinosomes peut être confirmée par d’autres techniques d’imagerie, telles que la microscopie confocale utilisant le dextran rouge du Texas et FM4-64. Les flèches bleues indiquent des volants de membrane, tandis que les flèches jaunes et vertes pointent vers les micropoinosomes.Enfin, la macropinocytose peut être confirmée et quantifiée par cytométrie en flux à l’aide d’un marqueur de phase fluide fluorescent tel que le FITC ou le dextran rouge du Texas. En plus de la MEB, l’imagerie des cellules vivantes et l’analyse par cytométrie en flux de l’internalisation de la dextran marquée par fluorescence peuvent également être effectuées pour étudier et quantifier la macropinocytose.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Analyse orale de biofilm palatine Expandeurs par fluorescence hybridation in situ et la microscopie confocale à balayage laser

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Recherche

Médecine

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Quantifier glomérulaire perméabilité des macromolécules fluorescentes en microscopie 2 photons à Munich chez le rat Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Formation de l&#39;épithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

En utilisant une technique de plastification pour effectuer la microscopie confocale de la sclérotique humaine


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Visualisation quantitative de l&#39;infiltration de leucocytes dans un modèle murin de myocardite fulminante par microscopie à feuilles lumineuses

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

préparation et<em&gt; In vitro</em&gt; Caractérisation des aimanté miR-modifié cellules endothéliales

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Enquêter sur von Willebrand facteur physiopathologie en utilisant un modèle de chambre d’écoulement de von Willebrand Factor-plaquettes String Formation

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

Analyse des ossements pour la densité minérale osseuse dans des contextes de médecine légale

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Micro-dissection de l’organe de l’émail des incisives mandibulaires de Rats exposés à des substances toxiques environnementales

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Non invasive détermination du temps de Formation de Vortex utilisant l’échocardiographie transoesophagienne au cours de la chirurgie cardiaque

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...