Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
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Die Autoren danken Libby Perry (Augusta University) für ihre Hilfe bei der SEM-Probenvorbereitung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) und K99HL146954 (B.S.)] und der American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)] unterstützt.

HINWEIS: Das Folgende ist ein allgemeines Protokoll zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in RAW 264.7-Makrophagen mittels REM-Mikroskopie. Für verschiedene Zelltypen kann eine Optimierung erforderlich sein.
1. Zelllinie und Zellkultur
<ol><li>Züchten Sie RAW 264,7 Makrophagen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% (vol/vol) hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ?...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

Das vorliegende REM-Bildgebungsprotokoll bietet ein Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche in vitro. Obwohl sich das aktuelle Protokoll auf Makrophagen konzentriert, haben Studien gezeigt, dass die Bildung von Membranrüschen auch bei verschiedenen anderen Zelltypen auftritt, darunterdendritische Zellen, Fibroblasten, Neuronen und Krebszellen 11,12,14,21,30.<su...

Macropinozytose ist ein endozytärer Prozess, der für die Internalisierung einer großen Menge extrazellulärer Flüssigkeit und ihres Gehalts durch die Bildung von dynamischen und aktingetriebenen Plasmamembranvorsprüngen, den sogenannten Membranrüschen,verantwortlich ist 1. Viele dieser Membranrüschen bilden Tassen, die sich schließen und wieder mit der Zelle verschmelzen und sich von der Plasmamembran als große, heterogene intrazelluläre Endosomen, auch Makropinosomen 1 genannt, trennen. Obwohl die Makropinozytose durch Wachstumsfaktoren wie den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) in einer Vielzahl von Zelltypen induziert wird, wurde ein weiterer einzigartiger, kalziumabhängiger Prozess, der als konstitutive Makropinozytose bekannt ist, auch in angeborenen Immunzellenbeobachtet 2,3,4,5,6,7,8.
Es hat sich gezeigt, dass die Fähigkeit von Zellen, extrazelluläres Material durch Makropinozytose zu internalisieren, eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen spielt, die von der Nährstoffaufnahme über den Erregerfang bis hin zur Antigenpräsentationreichen 9,10,11. Da dieser Prozess jedoch nicht selektiv und induzierbar ist, wurde er auch mit einer Reihe von pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Tatsächlich deuteten frühere Studien darauf hin, dass die Makropinozytose eine wichtige Rolle bei der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit, Krebs, Nephrolithiasis und Atherosklerosespielt 12,13,14,15,16. Darüber hinaus haben bestimmte Bakterien und Viren gezeigt, dass sie Makropinozytose nutzen, um in Wirtszellen einzudringen und eine Infektion zu induzieren17,18. Interessanterweise kann die Stimulation der Makropinozytose auch für die gezielte Abgabe von Therapeutika bei verschiedenen Krankheitszuständen genutzt werden19,20.
Frühere Studien haben die Makropinozytose untersucht, indem internalisierte fluoreszenzmarkierte Fluidphasenmarker in Abwesenheit und Vorhandensein von pharmakologischen Wirkstoffen, die die Makropinozytose hemmen, mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Bildgebungquantifiziert wurden 21,22. Derzeit verfügbare pharmakologische Werkzeuge, die die Makropinozytose hemmen, sind beschränkt auf und umfassen 1) Aktinpolymerisationsinhibitoren (Cytochalasin D und Latrunculine), 2) PI3K-Blocker (LY-290042 und Wortmannin) und 3) Inhibitoren von Natrium-Wasserstoff-Austauschern (NHE) (Amilorid und EIPA)5,14,15,23,24,25 . Da diese Inhibitoren jedoch endozytoseunabhängige Wirkungen haben, ist es schwierig, den Beitrag der Makropinozytose zur Aufnahme von gelösten Stoffen und zur Krankheitspathogenese selektiv zu bestimmen, insbesondere in vivo21.
Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist eine Art Elektronenmikroskop, das ultrahochauflösende Bilder von Zellen mit einem fokussierten Elektronenstrahl26 erzeugt. In der Makropinozytoseforschung gilt die REM-Bildgebung als die Goldstandardtechnik, um topographische und morphologische Eigenschaften der Plasmamembran zu visualisieren, die Bildung von Membranrüschen zu quantifizieren und ihr Fortschreiten zur Makropinosomenverinnerlichung zu untersuchen. Darüber hinaus bietet die Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der Quantifizierung der Aufnahme gelöster Stoffe in Gegenwart und Abwesenheit von Makropinozytoseblockern eine zuverlässige Strategie zur Untersuchung der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe in vitro. Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll, wie Zellen auf REM vorbereitet, die Zelloberfläche visualisiert, die Rüschenbildung quantifiziert und ihr Fortschritt in Richtung Cup-Verschluss und Makropinosom-Internalisierung untersucht werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

Membran-Ruffling ist die Bildung von beweglichen Plasmamembranvorsprüngen, die ein Geflecht aus neu polymerisierten Aktinfilamenten enthalten. Membranrüschen können sich spontan oder als Reaktion auf Wachstumsfaktoren, entzündliche Zytokine und Phorbolester bilden. Einige der Membranvorsprünge können sich zu kreisförmigen Membranrüschen reorganisieren, die an ihren distalen Rändern verschmelzen und Becher bilden, die sich als große, heterogene Vakuolen, die Makropinosomen genannt werden, schließen und in das Zytoplasma trennen. Während des Prozesses fangen Rüschen extrazelluläre Flüssigkeit und gelöste Stoffe ein, die sich in Makropinosomen verinnerlichen. Die hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist ein häufig verwendetes bildgebendes Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und geschlossenen makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche. Das folgende Protokoll beschreibt die Zellkulturbedingungen, die Stimulation der Membranrüschenbildung in vitro und die Fixierung, Dehydrierung und Vorbereitung von Zellen für die Bildgebung mit REM. Die Quantifizierung von Membranrüschen, Datennormalisierung sowie Stimulatoren und Inhibitoren der Membranrüschenbildung werden ebenfalls beschrieben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen über die Rolle der Makropinozytose in physiologischen und pathologischen Prozessen zu beantworten, neue Ziele zu untersuchen, die die Bildung von Membranrüschen regulieren, und noch nicht charakterisierte physiologische Stimulatoren sowie neuartige pharmakologische Inhibitoren der Makropinozytose zu identifizieren.

Hier beschreiben wir die Ergebnisse der vorgestellten Technik. Repräsentative REM-Bilder, die in Abbildung 1 gezeigt werden, zeigen die Bildung von Membranrüschen in RAW 264,7-Makrophagen nach der Behandlung mit PMA und M-CSF. Die Bilder wurden zuerst mit einer Vergrößerung von 3.500x zu Quantifizierungszwecken und dann mit höheren Vergrößerungsgraden (8.500x bis 16.000x) aufgenommen, um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen. Vorbehandlung von Makrophagen mit dem Makropino...

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Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Macropinozytose ist ein hochkonservierter endozytischer Prozess, der durch die Bildung von F-Aktin-reichen blattartigen Membranprojektionen, auch bekannt als Membranrüschen, ausgelöst wird. Eine erhöhte Rate der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe wurde mit verschiedenen pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in vitro mittels Rasterelektronenmikroskopie dar.

Visualisierung der Membranrüschenbildung mittels Rasterelektronenmikroskopie

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Das vorliegende REM-Bildgebungsprotokoll bietet ein Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche in vitro. SEM liefert hochauflösende Bilder der Zelloberfläche, mit denen makropinozytäre Membranaktivitäten sichtbar gemacht werden können. Diese Technik kann verwendet werden, um neue Signalwege zu entdecken, die die Makropinozytose regulieren, und um neue Stimulatoren und Inhibitoren der Mikropinozytose zu identifizieren.Beginnen Sie damit, sterile Glasabdeckscheine in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit autoklavierten Pinzetten zu platzieren. Dann säen rohe 264,7 Makrophagen auf die Deckgläser mit einer Dichte von 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter und inkubieren die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie am folgenden Tag die Medien in jedem Vertiefungsraum durch 500 Mikroliter frisches komplettes Medium und behandeln Sie die Makrophagen dann 30 Minuten lang mit einer Fahrzeugsteuerung wie DMSO oder einem Makropinozytosehemmer wie EIPA.Als nächstes, um das Membran-Ruffling zu fördern, behandeln Sie die Zellen für 30 Minuten mit Makropinozytose-Stimulatoren, wie einer einmikromolaren PMA-Lösung oder 100 Nanogramm pro Milliliter Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor. Um die Zellen für die Rasterelektronenmikroskopie zu fixieren, saugen Sie die Medien aus den Vertiefungen ab und waschen Sie die Deckblätter zweimal mit eiskaltem PBS, dann inkubieren Sie die Deckscheine in einem Fixiermittel für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius. Am folgenden Tag, ohne die Zell-Monoschicht zu stören, waschen und anschließend die Deckgläser in 500 Mikrolitern 0,1-motorischem Natriumcacodylat für 15 Minuten bebrüten.Nach zwei Wäschen mit 500 Mikrolitern destilliertem Wasser waschen Sie die Deckblätter zweimal in 500 Mikrolitern einer abgestuften Ethanolserie mit einer 10-minütigen Inkubation in jeder Wäsche. Um eine kritische Punkttrocknung durchzuführen, legen Sie die Deckscheine in einen kritischen Punkttrockner und bedecken Sie sie mit 100% Ethanol. Drücken Sie dann den Netzschalter und öffnen Sie den Kohlendioxidtank.Drücken Sie die Kühltaste etwa 30 Sekunden lang, bis die Temperatur auf null Grad Celsius sinkt. Drücken Sie dann die Fülltaste, bis eine Blase im Kammerfenster erscheint. Als nächstes drücken Sie die Spültaste, bis der Geruch von Ethanol aus dem Spülabgas verschwindet.Drücken Sie dann erneut die Kühltaste, bis die Temperatur auf null Grad Celsius sinkt. Drücken Sie erneut die Voll- und Löschtasten, um sie auszuschalten. Schließen Sie dann den Kohlendioxidtank.Drücken Sie erneut auf den kühlen Boden, um ihn auszuschalten, und drücken Sie dann die Heiztaste. Stellen Sie die Temperatur auf 42 Grad Celsius und den Druck auf 1.200 Pfund pro Quadratzoll ein. Sobald sich der Druck und die Temperatur stabilisiert haben, drücken Sie die Entlüftungstaste, damit der Druck langsam abnimmt.Sobald der Kammerdruck 150 Pfund pro Quadratzoll erreicht hat, drücken Sie den Entlüftungsboden und warten Sie, bis der Druck auf null Pfund pro Quadratzoll sinkt. Schalten Sie den kritischen Punkttrockner aus und entfernen Sie die Deckgläser. Als nächstes montieren Sie mit Kohleklebehähnen die Deckgläser auf den Aluminiumprobenhalterungen für die Rasterelektronenmikroskopie und fahren dann mit der Sputterbeschichtung mit Gold oder Palladium in einem Sputtercoater fort.Schalten Sie den Netzschalter des Sputtercoaters ein. Nachdem das Vakuum 30 Millitorr erreicht hat, spülen Sie die Kammer, um Feuchtigkeit und Luft zu entfernen, indem Sie den Gasschalter ausschalten und das Feingasventil gegen den Uhrzeigersinn drehen. Sobald das Vakuum auf 200 Millitorr ansteigt, schalten Sie den Gasschalter aus und warten Sie, bis das Vakuum 30 Millitorr erreicht.Spülen Sie dann die Kammer erneut, um Feuchtigkeit und Luft wie gezeigt zu entfernen. Nachdem Sie die Kammer dreimal gespült haben, drücken Sie den Timerboden und stellen Sie den Spannungsregler ein, bis das Messgerät 10 Milliampere anzeigt. Entfernen Sie dann die beschichteten Deckgläser aus der Kammer.Um die Membranrüschen zu visualisieren und zu quantifizieren, führen Sie die Probendeckel in die Kammer eines Rasterelektronenmikroskops ein, schließen Sie die Tür und drücken Sie die Evac-Taste. Öffnen Sie die Bediensoftware des Mikroskops und stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 15 Kilovolt und den Arbeitsabstand auf 10 Millimeter ein. Drücken Sie die Taste Koordinaten und bewegen Sie sich um den Controller herum, bis die Zellen in der Mitte des Beobachtungsbildschirms angezeigt werden.Stellen Sie die Vergrößerung auf 3, 500 X ein und stellen Sie die Probe ab, indem Sie auf die Schaltfläche Foto klicken. Hier sind repräsentative Rasterelektronenmikroskopie-Bilder zu sehen, die die Bildung von Membranrüschen in rohen 264,7-Makrophagen nach Behandlung mit PMA und Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor zeigen. Die Vorbehandlung von Makrophagen mit dem Makropinozytose-Inhibitor EIPA dämpft die Bildung von Membranrüschen.Während der Rüschenbildung durchläuft die Plasmamembran verschiedene morphologische Stadien, darunter einen blattartigen Membranvorsprung, eine C-förmige Membranrüsche und eine makropinozytäre Becher. Die Membranrüschenbildung nach PMA- und Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktorbehandlungen kann mittels Rasterelektronenmikroskopie quantifiziert werden, während die Makropinosomenbildung durch alternative bildgebende Verfahren wie konfokale Mikroskopie mit Texas Red Dextran und FM4-64 bestätigt werden kann. Die blauen Pfeile zeigen das Rüschen der Membran an, während die gelben und grünen Pfeile auf die Mikropinosomen zeigen.Schließlich kann die Makropinozytose durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines fluoreszierenden Flüssigkeitsphasenmarkers wie FITC oder Texas Red Destran bestätigt und quantifiziert werden. Neben REM können auch Lebendzellbildgebung und Durchflusszytometrie-Analysen der fluoreszenzmarkierten Dextran-Internalisierung durchgeführt werden, um die Makropinozytose zu untersuchen und zu quantifizieren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Oral Biofilm Analyse Palatal Expander durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und konfokale Laser Scanning Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Forschung

Medizin

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Mit Hilfe einer Laminiertechnik konfokale Mikroskopie der menschlichen Sclera to Perform


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Untersuchung von Willebrand Faktor Pathophysiologie mit einem Flow-Kammer-Modell des von Willebrand-Faktor-Thrombozyten String Bildung

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

Scan Skelettreste für Bone Mineral Density in forensischen Kontexten

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Mikro-Dissektion der Emaille-Orgel von Unterkiefer Schneidezahn von Ratten, Umweltgifte ausgesetzt

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Nicht-invasive Zeitbestimmung Vortex Formation mit transösophagealen Echokardiographie bei Herzchirurgie

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...