Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

המחברים מודים לליבי פרי (אוניברסיטת אוגוסטה) על עזרתה בהכנת הדגימה של SEM. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R01HL139562 (G.C.) ו- K99HL146954 (B.S.)] ואיגוד הלב האמריקאי [17POST33661254 (B.S.)].

הערה: להלן פרוטוקול כללי המשמש לכימות היווצרות קפלים בממברנה במקרופאגים RAW 264.7 באמצעות מיקרוסקופיית SEM. אופטימיזציה עשויה להידרש עבור סוגי תאים שונים.
1. קו תאים ותרבית תאים
<ol><li>הגדל RAW 264.7 מקרופאגים במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% (vol/vol) סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), ...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

פרוטוקול ההדמיה הנוכחי של SEM מספק כלי להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים בממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות על פני התא במבחנה. אף על פי שהפרוטוקול הנוכחי מתמקד במקרופאג'ים, מחקרים הראו כי היווצרות קפלים בממברנה מתרחשת גם בסוגי תאים שונים אחרים, כולל תאים דנדריטיים, פיברובלס?...

מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי האחראי על הפנמת כמות גדולה של נוזל חוץ-תאי ותכולתו באמצעות היווצרות של בליטות ממברנת פלזמה דינמיות ומונעות אקטין הנקראות קפלים ממברנה1. רבים מקפלי הממברנה האלה יוצרים כוסות שנסגרות ומתמזגות בחזרה אל התא ונפרדות מקרום הפלזמה כאנדוזומים תוך-תאיים גדולים והטרוגניים הידועים גם בשם מקרופינוזומים1. למרות שמקרופינוציטוזה מושרית על ידי גורמי גדילה כגון גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) וגורם גדילה אפידרמלי (EGF) במגוון רחב של סוגי תאים, תהליך ייחודי נוסף, תלוי סידן, המכונה מקרופינוציטוזה מכוננת נצפה גם בתאי חיסון מולדים 2,3,4,5,6,7,8.
הודגם כי יכולתם של תאים להפנים חומר חוץ-תאי באמצעות מקרופינוציטוזה ממלאת תפקיד חשוב במגוון תהליכים פיזיולוגיים, החל מספיגת חומרים מזינים וכלה בלכידת פתוגנים והצגת אנטיגן 9,10,11. עם זאת, מכיוון שתהליך זה אינו סלקטיבי ובלתי ניתן להשראה, הוא גם היה מעורב במספר מצבים פתולוגיים. ואכן, מחקרים קודמים הציעו כי מקרופינוציטוזה ממלאת תפקיד חשוב במחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סרטן, נפרוליתיאזיס וטרשת עורקים 12,13,14,15,16. יתר על כן, חיידקים ווירוסים מסוימים הראו שהם משתמשים במקרופינוציטוזה כדי להיכנס לתאים המארחים ולגרום לזיהום17,18. מעניין, גירוי של macropinocytosis יכול להיות מנוצל גם עבור משלוח ממוקד של סוכנים טיפוליים במצבי מחלה שונים19,20.
מחקרים קודמים בחנו מקרופינוציטוזה על ידי כימות סמני פאזה נוזלית מופנמים המתויגים באופן פלואורסצנטי בהיעדר ונוכחות של חומרים פרמקולוגיים המעכבים מקרופינוציטוזה באמצעות ציטומטריה של זרימה והדמיה קונפוקלית21,22. כלים פרמקולוגיים זמינים כיום המעכבים מקרופינוציטוזה מוגבלים ומורכבים מ-1) מעכבי פילמור אקטין (ציטוכלאסין D ולטרונקולין), 2) חוסמי PI3K (LY-290042 ו-wortmannin) ו-3) מעכבי מעכבי נתרן ממחליפי מימן (NHE) (אמילוריד ו-EIPA)5,14,15,23,24,25 . עם זאת, מכיוון שלעכבים אלה יש השפעות עצמאיות של אנדוציטוזה, קשה לקבוע באופן סלקטיבי את תרומתה של מקרופינוציטוזה להמסת ספיגה ופתוגנזה של מחלה במיוחד in vivo21.
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הוא סוג של מיקרוסקופ אלקטרונים המפיק תמונות ברזולוציה גבוהה במיוחד של תאים באמצעות קרן ממוקדת של אלקטרונים26. במחקר מקרופינוציטוזה, הדמיית SEM נחשבת לטכניקת תקן הזהב כדי להמחיש מאפיינים טופוגרפיים ומורפולוגיים של קרום הפלזמה, לכמת את היווצרות הקפלים של הממברנה ולחקור את התקדמותם לקראת הפנמה של מקרופינוזום. יתר על כן, סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים בשילוב עם כימות ספיגת המומס, בנוכחותם ובהיעדר חוסמי מקרופינוציטוזה, מספקת אסטרטגיה אמינה לבחינת הפנמה מקרופינוציטוטית במבחנה. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט כיצד להכין תאים ל-SEM, לדמיין את פני התא, לכמת את היווצרות הקפלים ולבחון את התקדמותם לקראת סגירת כוסות והפנמה של מקרופינוזום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

תפיחת ממברנה היא היווצרות של בליטות קרום פלזמה תנועתיות המכילות רשת של חוטי אקטין פולימריים חדשים. קפלים ממברנה עשויים להיווצר באופן ספונטני או בתגובה לגורמי גדילה, ציטוקינים דלקתיים ואסטרי פורבול. חלק מבליטות הממברנה עשויות להתארגן מחדש לקפלי ממברנה עגולים המתמזגים בשוליים הדיסטליים שלהם ויוצרים כוסות שנסגרות ונפרדות לתוך הציטופלסמה כשקעים גדולים והטרוגניים הנקראים מקרופינוזומים. במהלך התהליך, קפלים לוכדים נוזל חוץ-תאי ומומסים שמפנימים בתוך מקרופינוזומים. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה (SEM) היא טכניקת הדמיה נפוצה להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים של ממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות סגורות על פני התא. הפרוטוקול הבא מתאר את תנאי תרבית התאים, את הגירוי של היווצרות קפל הממברנה במבחנה, וכיצד לתקן, לייבש ולהכין תאים להדמיה באמצעות SEM. מתוארים גם כימות של רפרוף ממברנה, נורמליזציה של נתונים, וממריצים ומעכבים של היווצרות קפלים בממברנה. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידה של מקרופינוציטוזה בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, לחקור מטרות חדשות המווסתות את היווצרותם של ממברנות, ולזהות מגרים פיזיולוגיים שעדיין אינם אופייניים, כמו גם מעכבים פרמקולוגיים חדשניים של מקרופינוציטוזה.

כאן נתאר את התוצאות מהטכניקה המוצגת. תמונות SEM מייצגות המוצגות באיור 1 מדגימות היווצרות קפלים בקרום במקרופאגים RAW 264.7 לאחר טיפול ב-PMA וב-M-CSF. התמונות צולמו תחילה בהגדלה של פי 3,500 למטרות כימות ולאחר מכן ברמות גבוהות יותר של הגדלה (פי 8,500 עד פי 16,000) כדי להראות את קרום הפלזמה בפרטי?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי שמור מאוד שהחל על ידי היווצרות של הקרנות ממברנה דמויות יריעות F-אקטין, הידועות גם בשם קפלים ממברנה. שיעור מוגבר של הפנמה מקרופינוציטוטית של מומסים היה מעורב במצבים פתולוגיים שונים. פרוטוקול זה מציג שיטה לכימות היווצרות קפלים בקרום במבחנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הדמיה של היווצרות קפלים בממברנה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

פרוטוקול ההדמיה הנוכחי של SEM מספק כלי להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים בממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות על פני התא במבחנה. SEM מספק תמונות ברזולוציה גבוהה של פני השטח של התא שניתן להשתמש בהן כדי להמחיש את פעילויות הממברנה המקרופינוציטית. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לגלות מסלולי איתות חדשים המווסתים את המקרופינוציטוזה, ולזהות ממריצים ומעכבים חדשים של מיקרופינוציטוזה.התחילו בהנחת מחליקים מזכוכית סטרילית בבארות של לוחית בעלת 24 בארות באמצעות מלקחיים אוטוקלאבים. לאחר מכן זרעים גולמיים של 264.7 מקרופאגים על הכיסוי מחליקים בצפיפות של 10 עד השישית לכל מיליליטר ומדגירים את הצלחת למשך הלילה באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. ביום שלמחרת, החליפו את המדיה בכל באר ב-500 מיקרוליטרים של מדיה מלאה ורעננה, ואז הקדים את המקרופאגים למשך 30 דקות עם בקרת רכב כגון DMSO או מעכב מקרופינוציטוזה כגון EIPA.לאחר מכן, כדי לקדם את התפשטות הממברנה, טפלו בתאים במשך 30 דקות עם ממריצים למקרופינוציטוזה, כגון תמיסת PMA של מיקרומולר אחד או 100 ננוגרם למיליליטר של גורם מגרה מושבת מקרופאגים. כדי לתקן את התאים לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, שאפו את המדיה מהבארות ושטפו את החלקות הכיסוי פעמיים עם PBS קר כקרח, ואז דגרו את החלקות הכיסוי בקיבוע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן דגירה לילית בארבע מעלות צלזיוס. ביום המחרת, מבלי להפריע למונו-שכבת התא, לשטוף בעדינות ולאחר מכן לדוגר את החלקות הכיסוי ב 500 מיקרוליטרים של 0.1-מנוע נתרן cacodylate במשך 15 דקות.לאחר שתי שטיפות עם 500 מיקרוליטרים של מים מזוקקים, שטפו את החלקות הכיסוי פעמיים ב-500 מיקרוליטרים מסדרת אתנול מדורגת עם דגירה של 10 דקות בכל שטיפה. כדי לבצע ייבוש נקודתי קריטי, הניחו את החלקות הכיסוי במייבש נקודה קריטית וכסו אותן ב-100% אתנול. לאחר מכן, לחץ על לחצן ההפעלה ופתח את מיכל הפחמן הדו חמצני.לחץ על הכפתור הקריר למשך כ-30 שניות עד שהטמפרטורה יורדת לאפס מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחץ על לחצן המילוי עד שתופיע בועה בחלון החדר. לאחר מכן, לחץ על כפתור הטיהור עד שריח האתנול מפליטת הטיהור ייעלם.לאחר מכן, לחץ שוב על הכפתור הקריר עד שהטמפרטורה יורדת לאפס מעלות צלזיוס. לחץ מחדש על הלחצנים המלאים ונקה אותם כדי לכבות אותם. לאחר מכן, סגור את מיכל הפחמן הדו חמצני.לחץ/י מחדש/י על החלק התחתון הקריר כדי לכבות אותו ולאחר מכן לחץ/י על הכפתור ״חום״. הגדר את הטמפרטורה ל -42 מעלות צלזיוס והלחץ ל -1, 200 פאונד לאינץ 'מרובע. לאחר שהלחץ והטמפרטורה מתייצבים, לחץ על כפתור הדימום כדי לאפשר ללחץ לרדת לאט.ברגע שלחץ התא מגיע ל-150 פאונד לאינץ' מרובע, לחצו על קרקעית האוורור והמתינו עד שהלחץ יירד לאפס פאונד לאינץ' מרובע. כבו את מייבש הנקודה הקריטית והסירו את תלושי הכיסוי. לאחר מכן, באמצעות ברזים דבק פחמן, להרכיב את החלקות הכיסוי על תושבות דגימת האלומיניום לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, ולאחר מכן להמשיך לפזר ציפוי באמצעות זהב או פלדיום במעיל Sputter.הפעל את לחצן ההפעלה של מעיל הספליטר. לאחר שהוואקום מגיע ל -30 מיליטרים, שטפו את התא כדי להסיר לחות ואוויר על ידי כיבוי מתג הגז והפעלת שסתום הגז העדין נגד כיוון השעון. ברגע שהוואקום גדל ל-200 מיליטורים, כבו את מתג הגז והמתינו עד שהוואקום יגיע ל-30 מיליטורים.לאחר מכן, שטפו שוב את החדר כדי להסיר לחות ואוויר כפי שהודגם. לאחר שטיפת התא שלוש פעמים, דחפו את תחתית הטיימר והתאימו את ידית המתח עד שהמד יקרא 10 מיליאמפרים. לאחר מכן, הסר את החלקות הכיסוי המצופה מהתא.כדי לדמיין ולכמת את קפלי הממברנה, הכנס את כיסוי הדגימה מחליק לתוך החדר של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, סגור את הדלת ולחץ על כפתור evac. פתח את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ והגדר את המתח המואץ ל-15 קילובולטים ואת מרחק העבודה ל-10 מילימטרים. לחץ על הלחצן קואורדינטות והתקדם סביב הבקר עד שהתאים יופיעו במרכז מסך התצפית.הגדר את ההגדלה ל- 3, 500 X ודמיין את הדגימה על ידי לחיצה על לחצן תמונה. מוצגות כאן תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקות מייצגות, המדגימות היווצרות קפלי ממברנה במקרופאגים גולמיים של 264.7 לאחר טיפול ב-PMA ובגורם מגרה מושבת מקרופאגים. טיפול מקדים של מקרופאגים עם מעכב המקרופינוציטוזה EIPA מחליש את היווצרות הקפלים של הממברנה.במהלך היווצרות הקפלים, קרום הפלזמה עובר שלבים מורפולוגיים שונים, כולל בליטה דמוית ממברנה דמוית יריעה, קפל קרום בצורת C וכוס מקרופינוציטית. ניתן לכמת את היווצרות קפל הממברנה בעקבות טיפולים בגורמים מגרים של PMA ומקרופאגים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת, בעוד שניתן לאשר היווצרות מקרופינוזומים על ידי טכניקות הדמיה חלופיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות דקסטרן אדום טקסס ו- FM4-64. החצים הכחולים מצביעים על ריפוד ממברנה, בעוד שהחצים הצהובים והירוקים מצביעים על המיקרופינוזומים.לבסוף, ניתן לאשר ולכמת את המקרופינוציטוזה באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות סמן פאזה של נוזל פלואורסצנטי כגון FITC או טקסס רד דקסטרן. בנוסף ל-SEM, ניתן לבצע גם הדמיית תאים חיים וניתוח ציטומטריה של זרימה של הפנמה פלואורסצנטית של דקסטרן כדי לחקור ולכמת מקרופינוציטוזה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Biofilm ניתוח שבעל פה של Palatal expanders על ידי הכלאה ב-situ פלואורסצנטי מיקרוסקופיה Confocal סריקת לייזר

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

חוקרים פון Willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון Willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

סריקה השלד נשאר עבור צפיפות בהקשרים משפטית

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

ניתוח מיקרו של איבר אמייל השן החותכת הלסת של חולדות נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

נחישותם לא פולשנית של מערבולת זמן היווצרות באמצעות הושט אקוקרדיוגרפיה במהלך ניתוח לב

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...