Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
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Gli autori ringraziano Libby Perry (Augusta University) per il suo aiuto nella preparazione del campione SEM. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) e K99HL146954 (BS)] e dall'American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].

NOTA: Di seguito è riportato un protocollo generale utilizzato per quantificare la formazione di increspature di membrana nei macrofagi RAW 264.7 utilizzando la microscopia SEM. L'ottimizzazione può essere necessaria per diversi tipi di celle.
1. Linea cellulare e coltura cellulare
<ol><li>Coltiva 264,7 macrofagi RAW nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% (vol/vol) di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di strept...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

L'attuale protocollo di imaging SEM fornisce uno strumento per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche sulla superficie cellulare in vitro. Sebbene l'attuale protocollo si concentri sui macrofagi, gli studi hanno dimostrato che la formazione di volant di membrana si verifica anche su vari altri tipi di cellule tra cui cellule dendritiche, fibroblasti, neuroni e cellule tumorali 11,12,14,21,30.<sup class="xref...

La macropinocitosi è un processo endocitico responsabile dell'internalizzazione di una grande quantità di fluido extracellulare e del suo contenuto attraverso la formazione di sporgenze dinamiche e guidate dall'actina della membrana plasmatica chiamate increspature di membrana1. Molti di questi volant di membrana formano coppe che si chiudono e si fondono di nuovo sulla cellula e si separano dalla membrana plasmatica come grandi ed eterogenei endosomi intracellulari noti anche come macropinosomi1. Sebbene la macropinocitosi sia indotta da fattori di crescita come il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e il fattore di crescita epidermico (EGF) in una vasta gamma di tipi di cellule, un ulteriore processo unico e dipendente dal calcio noto come macropinocitosi costitutiva è stato osservato anche nelle cellule immunitarie innate 2,3,4,5,6,7,8.
La capacità delle cellule di internalizzare il materiale extracellulare attraverso la macropinocitosi ha dimostrato di svolgere un ruolo importante in una varietà di processi fisiologici che vanno dall'assorbimento dei nutrienti alla cattura dei patogeni e alla presentazione dell'antigene 9,10,11. Tuttavia, poiché questo processo non è selettivo e inducibile, è stato anche implicato in una serie di condizioni patologiche. Infatti, studi precedenti hanno suggerito che la macropinocitosi svolge un ruolo importante nella malattia di Alzheimer, nel morbo di Parkinson, nel cancro, nella nefrolitiasi e nell'aterosclerosi 12,13,14,15,16. Inoltre, alcuni batteri e virus hanno dimostrato di utilizzare la macropinocitosi per entrare nelle cellule ospiti e indurre l'infezione17,18. È interessante notare che la stimolazione della macropinocitosi può anche essere sfruttata per la somministrazione mirata di agenti terapeutici in varie condizioni di malattia19,20.
Studi precedenti hanno esplorato la macropinocitosi quantificando marcatori in fase fluida internati con tag fluorescenti in assenza e presenza di agenti farmacologici che inibiscono la macropinocitosi utilizzando la citometria a flusso e l'imaging confocale21,22. Gli strumenti farmacologici attualmente disponibili che inibiscono la macropinocitosi sono limitati e comprendono 1) inibitori della polimerizzazione dell'actina (citocalasina D e latrunculine), 2) bloccanti PI3K (LY-290042 e wortmannin) e 3) inibitori degli scambiatori di idrogeno di sodio (NHE) (amiloride ed EIPA)5,14,15,23,24,25 . Tuttavia, poiché questi inibitori hanno effetti indipendenti dall'endocitosi, è difficile determinare selettivamente il contributo della macropinocitosi all'assorbimento del soluto e alla patogenesi della malattia, specialmente in vivo21.
La microscopia elettronica a scansione (SEM) è un tipo di microscopio elettronico che produce immagini ad altissima risoluzione di cellule utilizzando un fascio focalizzato di elettroni26. Nella ricerca sulla macropinocitosi, l'imaging SEM è considerato la tecnica gold standard per visualizzare le caratteristiche topografiche e morfologiche della membrana plasmatica, quantificare la formazione di volant di membrana e studiare la loro progressione verso l'internalizzazione dei macropinosomi. Inoltre, la microscopia elettronica a scansione combinata con la quantificazione dell'assorbimento del soluto, in presenza e assenza di bloccanti della macropinocitosi, fornisce una strategia affidabile per esaminare l'internalizzazione del soluto macropinocitotico in vitro. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato su come preparare le cellule per il SEM, visualizzare la superficie cellulare, quantificare la formazione di volant ed esaminare i loro progressi verso la chiusura della coppa e l'internalizzazione dei macropinosomi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

L'arruffamento della membrana è la formazione di sporgenze di membrana plasmatica mobile contenenti una rete di filamenti di actina appena polimerizzati. Le volant di membrana possono formarsi spontaneamente o in risposta a fattori di crescita, citochine infiammatorie e esteri di forbolo. Alcune delle sporgenze di membrana possono riorganizzarsi in volant circolari di membrana che si fondono ai loro margini distali e formano tazze che si chiudono e si separano nel citoplasma come vacuoli grandi ed eterogenei chiamati macropinosomi. Durante il processo, i volant intrappolano il fluido extracellulare e i soluti che si interiorizzano all'interno dei macropinosomi. La microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione (SEM) è una tecnica di imaging comunemente usata per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche chiuse sulla superficie cellulare. Il seguente protocollo descrive le condizioni di coltura cellulare, la stimolazione della formazione di volant di membrana in vitro e come correggere, disidratare e preparare le cellule per l'imaging utilizzando SEM. Sono inoltre descritti la quantificazione dell'increspamento della membrana, la normalizzazione dei dati e gli stimolatori e gli inibitori della formazione di volant di membrana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo della macropinocitosi nei processi fisiologici e patologici, studiare nuovi bersagli che regolano la formazione di increspature di membrana e identificare stimolatori fisiologici ancora non caratterizzati e nuovi inibitori farmacologici della macropinocitosi.

Qui, descriviamo i risultati della tecnica presentata. Le immagini SEM rappresentative mostrate nella Figura 1 mostrano la formazione di volant di membrana nei macrofagi RAW 264.7 dopo trattamento con PMA e M-CSF. Le immagini sono state prima catturate con un ingrandimento di 3.500x per scopi di quantificazione e poi a livelli più elevati di ingrandimento (da 8.500x a 16.000x) per mostrare la membrana plasmatica a maggiori dettagli. Pretrattamento dei macrofagi con l'inibitore della macropi...

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Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

La macropinocitosi è un processo endocitico altamente conservato avviato dalla formazione di proiezioni di membrana simili a fogli ricchi di F-actina, noti anche come volant di membrana. L'aumento del tasso di internalizzazione del soluto macropinocitotico è stato implicato in varie condizioni patologiche. Questo protocollo presenta un metodo per quantificare la formazione di volant di membrana in vitro utilizzando la microscopia elettronica a scansione.

Visualizzazione della formazione di increspature a membrana utilizzando la microscopia elettronica a scansione

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

L'attuale protocollo di imaging SEM fornisce uno strumento per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche sulla superficie cellulare in vitro. SEM fornisce immagini ad alta risoluzione della superficie cellulare che possono essere utilizzate per visualizzare le attività della membrana macropinocitica. Questa tecnica può essere utilizzata per scoprire nuove vie di segnalazione che regolano la macropinocitosi e identificare nuovi stimolatori e inibitori della micropinocitosi.Inizia posizionando i coperchi di vetro sterili scivolando nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti usando una pinza autoclavata. Quindi seminare 264,7 macrofagi crudi sulla copertura scivola a una densità di 10-sesta cella per millilitro e incubare la piastra durante la notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, sostituire i media in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzi freschi completi, quindi pretrattare i macrofagi per 30 minuti con un controllo del veicolo come DMSO o un inibitore della macropinocitosi come eIPA.Successivamente, per promuovere l'arruffamento della membrana, trattare le cellule per 30 minuti con stimolatori della macropinocitosi, come una soluzione di PMA monoparolare o 100 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante della colonia di macrofagi. Per fissare le celle per la microscopia elettronica a scansione, aspirare il fluido dai pozzetti e lavare due volte gli scivoli di copertura con PBS ghiacciato, quindi incubare il coperchio scivola in un fissativo per 30 minuti a temperatura ambiente seguito da incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, senza disturbare il monostrato cellulare, lavare delicatamente e quindi incubare gli scivoli di copertura in 500 microlitri di cacodilato di sodio 0,1 motori per 15 minuti.Dopo due lavaggi con 500 microlitri di acqua distillata, lavare il coperchio scivola due volte in 500 microlitri di una serie di etanolo graduato con un'incubazione di 10 minuti in ogni lavaggio. Per eseguire l'essiccazione del punto critico, posizionare gli slip del coperchio in un essiccatore a punto critico e coprirli con etanolo al 100%. Quindi, premere il pulsante di accensione e aprire il serbatoio di anidride carbonica.Premere il pulsante di raffreddamento per circa 30 secondi fino a quando la temperatura scende a zero gradi Celsius. Quindi, premere il pulsante di riempimento fino a quando non viene visualizzata una bolla nella finestra della camera. Quindi, premere il pulsante di spurgo fino a quando l'odore di etanolo dallo scarico di spurgo scompare.Quindi, premere nuovamente il pulsante di raffreddamento fino a quando la temperatura non scende a zero gradi Celsius. Premere nuovamente i pulsanti Completo ed Elimina per disattivarli. Quindi, chiudere il serbatoio di anidride carbonica.Premere nuovamente il fondo freddo per spegnerlo, quindi premere il pulsante di calore. Impostare la temperatura a 42 gradi Celsius e la pressione a 1.200 libbre per pollice quadrato. Una volta che la pressione e la temperatura si sono stabilizzate, premere il pulsante di spurgo per consentire alla pressione di diminuire lentamente.Una volta che la pressione della camera raggiunge i 150 libbre per pollice quadrato, premere il fondo di sfiato e attendere che la pressione diminuisca a zero libbre per pollice quadrato. Spegnere l'essiccatore del punto critico e rimuovere gli scivoli del coperchio. Successivamente, utilizzando rubinetti adesivi in carbonio, montare gli slip di copertura sui supporti del campione di alluminio per la microscopia elettronica a scansione, quindi procedere al rivestimento sputter utilizzando oro o palladio in un rivestimento sputter.Accendere il pulsante di accensione del coater sputter. Dopo che il vuoto raggiunge i 30 millitorrs, lavare la camera per rimuovere l'umidità e l'aria spegnendo l'interruttore del gas e ruotando la valvola del gas fine in senso antiorario. Una volta che il vuoto aumenta a 200 millitorrs, spegnere l'interruttore del gas e attendere che il vuoto raggiunga i 30 millitorrs.Quindi, lavare nuovamente la camera per rimuovere l'umidità e l'aria come dimostrato. Dopo aver lavato la camera tre volte, premere il fondo del timer e regolare la manopola di tensione fino a quando l'indicatore legge 10 milliampere. Quindi, rimuovere gli scivoli di copertura rivestiti dalla camera.Per visualizzare e quantificare le increspature della membrana, inserire il coperchio del campione scivola nella camera di un microscopio elettronico a scansione, chiudere la porta e premere il pulsante evac. Aprire il software operativo del microscopio e impostare la tensione di accelerazione a 15 kilovolt e la distanza di lavoro a 10 millimetri. Premere il pulsante Coordinate e spostarsi all'interno del controller finché le celle non vengono visualizzate al centro della schermata di osservazione.Impostare l'ingrandimento su 3.500 X e visualizzare l'immagine del campione facendo clic sul pulsante Foto. Qui sono mostrate immagini rappresentative al microscopio elettronico a scansione, che dimostrano la formazione di volant di membrana in 264,7 macrofagi grezzi dopo trattamento con PMA e fattore stimolante la colonia di macrofagi. Il pretrattamento dei macrofagi con l'inibitore della macropinocitosi EIPA attenua la formazione di increspature di membrana.Durante la formazione del volant, la membrana plasmatica subisce fasi morfologiche distinte, tra cui una protrusione di membrana simile a un foglio, un volant di membrana a forma di C e una coppa macropinocitica. La formazione di increspature di membrana dopo i trattamenti con fattori stimolanti la PMA e le colonie di macrofagi può essere quantificata utilizzando la microscopia elettronica a scansione, mentre la formazione di macropinosomi può essere confermata da tecniche di imaging alternative, come la microscopia confocale con destrano rosso del Texas e FM4-64. Le frecce blu indicano l'arruffamento della membrana, mentre le frecce gialle e verdi puntano ai micropinosomi.Infine, la macropinocitosi può essere confermata e quantificata attraverso la citometria a flusso utilizzando un marcatore di fase fluida fluorescente come FITC o Texas red dextran. Oltre alla SEM, è possibile eseguire anche l'imaging di cellule vive e l'analisi citometrica a flusso dell'internalizzazione del destrano marcata fluorescentemente per indagare e quantificare la macropinocitosi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Analisi biofilm orale di espansori palatali da Fluorescence In Situ-ibridazione e microscopia confocale a scansione laser

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Ricerca

Medicina

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Quantificare permeabilità glomerulare delle Macromolecole fluorescenti usando la microscopia a due fotoni a Monaco di Baviera ratti Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

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Utilizzando una tecnica di laminazione per l&#39;esecuzione di Microscopia confocale della sclera umana


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