Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

著者らは、SEMサンプル調製に協力してくれたLibby Perry(オーガスタ大学)に感謝している。この研究は、国立衛生研究所[R01HL139562(G.C.)およびK99HL146954(BS)]および米国心臓協会[17POST33661254(B.S.)]によって支援されました。

注:以下は、SEM顕微鏡を用いてRAW 264.7マクロファージにおける膜フリル形成を定量するために使用される一般的なプロトコルである。異なる細胞タイプに対して最適化が必要な場合があります。
1. 細胞株および細胞培養
<ol><li>37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内で、10%(vol/vol)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100IU/mLのペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを添加し...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

本SEMイメージングプロトコルは、インビトロで細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および大尖頭カップを視覚化および定量化するためのツールを提供する。現在のプロトコールはマクロファージに焦点を当てているが、研究は、膜フリル形成が樹状細胞、線維芽細胞、ニューロン、および癌細胞を含む様々な他の細胞型においても起こることを示している11、12<su...

マクロピノサイトーシスは、メンブレンフリル1と呼ばれる動的でアクチン駆動の原形質膜突起の形成を介して、大量の細胞外液およびその内容物を内在化する内分泌過程である。これらの膜フリルの多くは、細胞を閉じて融合させ、マクロピノソーム1としても知られる大きくて不均一な細胞内エンドソームとして原形質膜から分離するカップを形成する。マクロピノサイトーシスは、広範囲の細胞型においてマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)および上皮成長因子(EGF)などの成長因子によって誘導されるが、構成的マクロピノサイトーシスとして知られるさらなる独特のカルシウム依存性プロセスは、自然免疫細胞2、3、4、5、6、7、8においても観察されている。
マクロピノサイトーシスを介して細胞外物質をインターナライズする細胞の能力は、栄養素の取り込みから病原体の捕捉および抗原提示に至るまでの様々な生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている9、10、11。しかしながら、このプロセスは非選択的かつ誘導性であるため、多くの病理学的状態にも関与している。実際、以前の研究では、マクロピノサイトーシスがアルツハイマー病、パーキンソン病、癌、腎結石症およびアテローム性動脈硬化症において重要な役割を果たすことが示唆された12,13,14,15,16。さらに、特定の細菌およびウイルスは、マクロピノサイトーシスを利用して宿主細胞に侵入し、感染を誘導することが示されている17,18。興味深いことに、マクロピノサイトーシスの刺激は、様々な疾患状態における治療剤の標的送達のためにも利用され得る19、20。
これまでの研究では、フローサイトメトリーおよび共焦点イメージング21,22を用いて、マクロピノサイトーシスを阻害する薬理学的薬剤の非存在下および存在下で、内在化された蛍光タグ付き液相マーカーを定量化することによってマクロピノサイトーシスを探索してきた21,22。マクロピノサイトーシスを阻害する現在利用可能な薬理学的ツールは、1)アクチン重合阻害剤(サイトカラシンDおよびラトルンクリン)、2)PI3K遮断薬(LY-290042およびワートマニン)、および3)ナトリウム水素交換剤(NHE)の阻害剤(アミロリドおよびEIPA)に限定され、5、14、15、23、24、25.しかしながら、これらの阻害剤はエンドサイトーシスに依存しない効果を有するため、特にインビボでの溶質取り込みおよび疾患病因に対するマクロピノサイトーシスの寄与を選択的に決定することは困難である21。
走査型電子顕微鏡(SEM)は、電子26の集束ビームを用いて細胞の超高分解能画像を生成する電子顕微鏡の一種である。マクロピノサイトーシス研究において、SEMイメージングは、原形質膜の地形学的および形態学的特徴を視覚化し、膜フリル形成を定量化し、マクロピノソーム内在化への進行を調べるためのゴールドスタンダード技術と見なされています。さらに、溶質取り込みの定量化と組み合わせた走査型電子顕微鏡は、マクロピノサイトーシス遮断薬の存在下および非存在下で、イン ビトロでマクロピノサイトーシス溶質インターナリゼーションを調べるための信頼できる戦略を提供する。この論文は、SEM用の細胞を調製し、細胞表面を視覚化し、フリル形成を定量化し、カップ閉鎖およびマクロピノソーム内在化へのそれらの進歩を調べる方法に関する詳細なプロトコルを提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

メンブレンフリルは、新しく重合されたアクチンフィラメントのメッシュワークを含む運動性原形質膜凸部の形成である。膜フリルは、自発的に、または成長因子、炎症性サイトカイン、およびホルボールエステルに応答して形成され得る。膜突起の一部は、遠位縁で融合し、マクロピノソームと呼ばれる大きくて不均一な液胞として細胞質に閉じて分離するカップを形成する円形の膜フリルに再編成することができる。このプロセスの間、フリルはマクロピノソーム内に内在化する細胞外液および溶質を捕捉する。高分解能走査型電子顕微鏡(SEM)は、細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および閉じた大尖頭カップを視覚化および定量化するために一般的に使用されるイメージング技術です。以下のプロトコールは、細胞培養条件、 インビトロでの 膜ラッフル形成の刺激、およびSEMを用いたイメージングのための細胞の固定、脱水、および調製方法を記載する。この方法は、生理学的および病理学的プロセスにおけるマクロピノサイトーシスの役割に関する重要な質問に答え、膜フリル形成を調節する新しい標的を調査し、まだ特徴付けられていない生理学的刺激因子およびマクロピノサイトーシスの新規薬理学的阻害剤を同定するのに役立つ。

ここで、提示された手法の結果について説明する。図1に示す代表的なSEM画像は、PMAおよびM-CSFによる処理後のRAW 264.7マクロファージにおける膜フリル形成を実証する。画像は、最初に定量化目的で3,500倍の倍率で撮影され、次に原形質膜をより詳細に表示するためにより高いレベルの倍率(8,500倍〜16,000倍)で撮影された。マクロピノサイトーシス阻害剤EIPAによるマクロフ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

マクロピノサイトーシスは、膜フリルとしても知られるF-アクチンに富むシート状の膜突起の形成によって開始される高度に保存された内球性プロセスである。マクロピノサイトーシス溶質インターナリゼーションの速度の増加は、様々な病理学的状態に関与している。このプロトコルは、走査型電子顕微鏡を用いて インビトロで 膜ラッフル形成を定量する方法を提示する。

走査型電子顕微鏡による膜ラッフル形成の可視化

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

本SEMイメージングプロトコルは、インビトロで細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および大尖頭カップを視覚化および定量化するためのツールを提供する。SEMは、大ピノサイト膜活性を視覚化するために使用できる細胞表面の高解像度画像を提供する。この技術は、マクロピノサイトーシスを調節する新しいシグナル伝達経路を発見し、ミクロピノサイトーシスの新規刺激因子および阻害剤を同定するために使用することができる。まず、オートクレーブ処理された鉗子を使用して、滅菌ガラスカバースリップを24ウェルプレートのウェルに配置します。次いで、生の264.7マクロファージをカバー上に播種し、1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の密度でスリップし、プレートを摂氏37度および二酸化炭素5%の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。翌日、各ウェルの培地を500マイクロリットルの新鮮な完全培地と交換し、DMSOなどのビヒクルコントロールまたはEIPAなどのマクロピノサイトーシス阻害剤でマクロファージを30分間前処理します。次に、膜フリルを促進するために、1マイクロモルPMA溶液または1ミリリットル当たり100ナノグラムのマクロファージコロニー刺激因子などのマクロピノサイトーシス刺激剤で細胞を30分間処理する。走査型電子顕微鏡観察のために細胞を固定するには、ウェルから培地を吸引し、カバースリップを氷冷PBSで2回洗浄し、次いでカバースリップを固定液中で室温で30分間インキュベートした後、摂氏4度で一晩インキュベートする。翌日、細胞単層を乱すことなく、静かに洗浄し、次いでカバースリップを500マイクロリットルの0.1モーターカコジル酸ナトリウム中で15分間インキュベートする。500マイクロリットルの蒸留水で2回洗浄した後、各洗浄で10分間インキュベーションしながら、500マイクロリットルの段階的エタノールシリーズでカバースリップを2回洗浄する。臨界点乾燥を行うには、カバースリップを臨界点乾燥機に入れ、100%エタノールで覆います。次に、電源ボタンを押して二酸化炭素タンクを開きます。温度が摂氏0度まで下がるまで、冷却ボタンを約30秒間押します。次に、チャンバーウィンドウにバブルが表示されるまで塗りつぶしボタンを押します。次に、パージ排気からのエタノールの臭いが消えるまでパージボタンを押します。次に、温度が摂氏0度まで下がるまで冷却ボタンをもう一度押します。フルボタンとパージボタンをもう一度押して、電源を切ります。その後、二酸化炭素タンクを閉じます。冷却底部を押し直して電源を切り、ヒートボタンを押します。温度を摂氏 42 度に、圧力を 1,200 ポンド/平方インチに設定します。圧力と温度が安定したら、ブリードボタンを押して圧力をゆっくりと下げます。チャンバーの圧力が1平方インチあたり150ポンドに達したら、通気口の底部を押し、圧力が1平方インチあたりゼロポンドに低下するまで待ちます。臨界点乾燥機の電源を切り、カバースリップを取り外します。次に、カーボン接着剤タップを用いて、走査型電子顕微鏡観察用のアルミニウム試験片マウントにカバースリップを装着し、スパッタコーターで金またはパラジウムを用いたスパッタ塗布に進む。スパッタコーターの電源ボタンをオンにします。真空が30ミリトルに達したら、チャンバーをフラッシュしてガススイッチをオフにし、細かいガスバルブを反時計回りに回して湿度と空気を除去します。真空が200ミリトルに上昇したら、ガススイッチをオフにして、真空が30ミリトルに達するまで待ちます。その後、チャンバーを再びフラッシュして、実証したように湿度と空気を除去します。チャンバーを3回フラッシュした後、タイマーの底部を押し、ゲージが10ミリアンペアを読み取るまで電圧ノブを調整します。次に、コーティングされたカバースリップをチャンバーから取り外します。メンブレンフリルを視覚化して定量化するには、サンプルカバースリップを走査型電子顕微鏡のチャンバーに挿入し、ドアを閉じ、evacボタンを押します。顕微鏡操作ソフトウェアを開き、加速電圧を15キロボルト、作動距離を10ミリメートルに設定します。[座標] ボタンを押し、セルが観測画面の中央に表示されるまでコントローラーの周りを移動します。倍率を 3, 500 X に設定し、[写真] ボタンをクリックしてサンプルを画像化します。ここに示されているのは、PMAおよびマクロファージコロニー刺激因子による処理後の生264.7マクロファージにおける膜フリル形成を実証する代表的な走査型電子顕微鏡像である。マクロピノサイトーシス阻害剤EIPAによるマクロファージの前処理は、膜フリル形成を減弱させる。フリル形成の間、原形質膜は、シート状の膜突起、C字型膜フリル、および大ピノシティックカップを含む別個の形態学的段階を経る。PMAおよびマクロファージコロニー刺激因子処理後の膜ラッフル形成は、走査型電子顕微鏡を用いて定量化することができるが、一方、マクロピノソーム形成は、テキサスレッドデキストランおよびFM4−64を用いた共焦点顕微鏡などの代替イメージング技術によって確認することができる。青い矢印は膜のフリルを示し、黄色と緑の矢印はマイクロピノソームを指しています。最後に、マクロピノサイトーシスは、FITCまたはテキサスレッドデキストランなどの蛍光流体相マーカーを用いたフローサイトメトリーを通じて確認および定量することができる。SEMに加えて、蛍光標識デキストランインターナリゼーションの生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー分析も、マクロピノサイトーシスを調査および定量するために行うことができる。

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

蛍光in situハイブリダイゼーションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡による口蓋パンダの口腔バイオフィルムの解析

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

齧歯尿生殖洞間充織とヒト幹細胞の組織の組換えを用いたヒト前立腺上皮の形成

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

人間の強膜の共焦点顕微鏡法を実行するために積層技術を用いて、


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

法医学のコンテキストで骨密度のスキャンの遺骨

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

心臓手術中に経食道心エコーを用いた渦形成時間の非侵襲的定量

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...