Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Forfatterne takker Libby Perry (Augusta University) for hennes hjelp med SEM-prøveforberedelsene. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) og K99HL146954 (B.S.)] og American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].

MERK: Følgende er en generell protokoll som brukes til å kvantifisere membran ruffle formasjon i RAW 264.7 makrofager ved hjelp av SEM mikroskopi. Optimalisering kan være nødvendig for forskjellige celletyper.
1. Cellelinje og cellekultur
<ol><li>Vokse RAW 264.7 makrofager i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% (vol /vol) varme-inaktivert Fetal Bovine Serum (FBS), 100 IE /ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 %CO2. B...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

Den nåværende SEM-bildeprotokollen gir et verktøy for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring, og makropinocytiske kopper på celleoverflaten in vitro. Selv om den nåværende protokollen fokuserer på makrofager, har studier vist at membran ruffle formasjon også forekommer på ulike andre celletyper, inkludert dendritiske celler, fibroblaster, nevroner og kreftceller 11,12,14,21,30....

Makropinocytose er en endokytisk prosess som er ansvarlig for å internalisere en stor mengde ekstracellulær væske og dets innhold via dannelsen av dynamiske og aktindrevne plasmamembranutstikk som kalles membran ruffles1. Mange av disse membran ruffles danner kopper som lukker og smelter tilbake på cellen og skiller seg fra plasmamembranen som store, heterogene intracellulære endosomer også kjent som makropinosomer1. Selv om makropinocytose er indusert av vekstfaktorer som makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og epidermal vekstfaktor (EGF) i et bredt spekter av celletyper, har en ekstra unik, kalsiumavhengig prosess kjent som konstituerende makropinocytose også blitt observert i medfødte immunceller 2,3,4,5,6,7,8.
Cellenes evne til å internalisere ekstracellulært materiale via makropinocytose har vist seg å spille en viktig rolle i en rekke fysiologiske prosesser som spenner fra næringsopptak til patogenfangst og antigenpresentasjon 9,10,11. Men fordi denne prosessen er ikke-selektiv og inducible, har den også blitt involvert i en rekke patologiske forhold. Faktisk antydet tidligere studier at makropinocytose spiller en viktig rolle i Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, kreft, nephrolithiasis og aterosklerose 12,13,14,15,16. Videre har visse bakterier og virus vist seg å bruke makropinocytose for å få inngang i vertsceller og indusere infeksjon17,18. Interessant nok kan stimulering av makropinocytose også utnyttes for målrettet levering av terapeutiske midler under ulike sykdomstilstander19,20.
Tidligere studier har utforsket makropinocytose ved å kvantifisere internaliserte fluorescerende taggede væskefasemarkører i fravær og tilstedeværelse av farmakologiske midler som hemmer makropinocytose ved hjelp av strømningscytometri og konfomisk avbildning21,22. Tilgjengelige farmakologiske verktøy som hemmer makropinocytose er begrenset til og består av 1) aktinpolymerisasjonshemmere (cytochalasin D og latrunculins), 2) PI3K-blokkere (LY-290 042 og wortmannin) og 3) hemmere av natrium hydrogenvekslere (NHE) (amilorid og EIPA)5,14,15,23,24,25 . Men fordi disse inhibitorene har endokytoseuavhengige effekter, er det vanskelig å selektivt bestemme bidraget av makropinocytose til løsning av opptak og sykdomspatogenese spesielt in vivo21.
Skanning av elektronmikroskopi (SEM) er en type elektronmikroskop som produserer bilder med ultrahøy oppløsning av celler ved hjelp av en fokusert stråle av elektroner26. I makropinocytoseforskning anses SEM-avbildning som gullstandardteknikken for å visualisere topografiske og morfologiske egenskaper ved plasmamembranen, kvantifisere membran ruffle formasjon og undersøke deres progresjon mot makropinosom internalisering. Videre gir skanning av elektronmikroskopi kombinert med kvantifisering av løsningsmiddelopptak, i nærvær og fravær av makropinocytoseblokkere, en pålitelig strategi for å undersøke makropinocytotisk solute internalisering in vitro. Dette dokumentet gir en detaljert protokoll om hvordan du forbereder celler for SEM, visualiserer celleoverflaten, kvantifiserer ruffleformasjon og undersøker deres fremgang mot kopplukking og makropinosom internalisering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

Membran ruffling er dannelsen av motile plasmamembran fremspring som inneholder et nettingverk av nylig polymeriserte aktinfilamenter. Membran ruffles kan dannes spontant eller som svar på vekstfaktorer, inflammatoriske cytokiner og phorbol estere. Noen av membranutstikkene kan omorganisere seg til sirkulære membran ruffles som smelter sammen ved deres distale marginer og danner kopper som lukker og skiller seg inn i cytoplasmaet som store, heterogene vakuoler kalt makropinosomer. Under prosessen fanger ruffles ekstracellulær væske og løsemidler som internaliserer i makropinosomer. Høyoppløselig skanning elektronmikroskopi (SEM) er en vanlig brukt bildeteknikk for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring og lukkede makropinocytiske kopper på celleoverflaten. Følgende protokoll beskriver cellekulturforholdene, stimulering av membranen ruffle formasjon in vitro, og hvordan å fikse, dehydrere og forberede celler for avbildning ved hjelp av SEM. Kvantifisering av membran ruffling, data normalisering, og stimulatorer og hemmere av membran ruffle formasjon er også beskrevet. Denne metoden kan bidra til å svare på sentrale spørsmål om makropinocytoserollen i fysiologiske og patologiske prosesser, undersøke nye mål som regulerer membran ruffle dannelse, og identifisere ennå ukarakteriserte fysiologiske stimulatorer samt nye farmakologiske hemmere av makropinocytose.

Her beskriver vi resultatene fra den presenterte teknikken. Representative SEM-bilder vist i figur 1 viser membran ruffle dannelse i RAW 264.7 makrofager etter behandling med PMA og M-CSF. Bilder ble først tatt med en forstørrelse på 3500x for kvantifiseringsformål og deretter ved høyere forstørrelsesnivåer (8500x til 16 000x) for å vise plasmamembranen med større detaljer. Forbehandling av makrofager med makropinocytosehemmeren EIPA svekket membran ruffle formasjon (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Makropinocytose er en svært konservert endokytisk prosess initiert av dannelsen av F-aktinrike arklignende membranprojeksjoner, også kjent som membran ruffles. Økt grad av makropinocytotisk solute internalisering har vært involvert i ulike patologiske forhold. Denne protokollen presenterer en metode for å kvantifisere membran ruffle formasjon in vitro ved hjelp av skanning elektronmikroskopi.

Visualisere membran ruffle formasjon ved hjelp av skanning elektron mikroskopi

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Den nåværende SEM-bildeprotokollen gir et verktøy for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring, og makropinocytiske kopper på celleoverflaten in vitro. SEM gir bilder med høy oppløsning av celleoverflaten som kan brukes til å visualisere makropinocytiske membranaktiviteter. Denne teknikken kan brukes til å oppdage nye signalveier som regulerer makropinocytose, og identifisere nye stimulatorer og hemmere av mikropinocytose.Begynn med å plassere sterile glassdekselslipper i brønner på en 24-brønnsplate ved hjelp av autoklavede tang. Deretter glir frø rå 264,7 makrofager på dekselet med en tetthet på 10 til de sjette cellene per milliliter og inkuberer platen over natten i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Påfølgende dag, erstatt media i hver brønn med 500 mikroliter ferske komplette medier, og forbehandle deretter makrofagene i 30 minutter med en kjøretøykontroll som DMSO eller en makropinocytosehemmer som EIPA.Deretter, for å fremme membran ruffling, behandle cellene i 30 minutter med makropinocytosestimulatorer, for eksempel en en-mikromolar PMA-løsning eller 100 nanogram per milliliter makrofagkoloni stimulerende faktor. For å fikse cellene for skanning av elektronmikroskopi, aspirer mediet fra brønnene og vask dekselet to ganger med iskald PBS, og inkuber deretter dekselet glir i et fikseringsmiddel i 30 minutter ved romtemperatur etterfulgt av inkubering over natten ved fire grader Celsius. Påfølgende dag, uten å forstyrre cellemonolayeren, vask forsiktig og inkuber deretter dekselets glid i 500 mikroliter av 0,1-motors natriumkakroktylat i 15 minutter.Etter to vasker med 500 mikroliter destillert vann, vask dekselet to ganger i 500 mikroliter av en gradert etanolserie med en 10-minutters inkubasjon i hver vask. For å utføre kritisk punkttørking, plasser dekselet i en kritisk punkttørker og dekk dem med 100% etanol. Trykk deretter på strømknappen og åpne karbondioksidtanken.Trykk på avkjølingsknappen i ca. 30 sekunder til temperaturen synker til null grader Celsius. Trykk deretter på fyllknappen til det vises en boble i kammervinduet. Trykk deretter på renseknappen til lukten av etanol fra renseeksosen forsvinner.Trykk deretter på kjøleknappen igjen til temperaturen synker til null grader Celsius. Trykk hele knappene og tøm knappene på nytt for å slå dem av. Lukk deretter karbondioksidtanken.Trykk på den kjølige bunnen igjen for å slå den av, og trykk deretter på varmeknappen. Sett temperaturen til 42 grader Celsius og trykk til 1,200 pounds per kvadrattomme. Når trykket og temperaturen stabiliserer seg, trykker du på lufteknappen slik at trykket kan reduseres sakte.Når kammertrykket når 150 pund per kvadrattomme, trykker du på ventilbunnen og venter til trykket synker til null pund per kvadrattomme. Slå av den kritiske tørketrommelen og fjern dekselslippene. Deretter, ved hjelp av karbonlimkraner, monter dekselslippene på aluminiumsprøvefestene for skanning av elektronmikroskopi, og fortsett deretter å sputterbelegg ved hjelp av gull eller palladium i en sputter coater.Slå på av/på-knappen på sputtercoateren. Etter at vakuumet når 30 millitorr, skyll kammeret for å fjerne fuktighet og luft ved å slå av gassbryteren og vri den fine gassventilen mot klokken. Når vakuumet øker til 200 millitorr, slår du av gassbryteren og venter til vakuumet når 30 millitorr.Skyll deretter kammeret igjen for å fjerne fuktighet og luft som vist. Etter å ha spylt kammeret tre ganger, trykk på timerbunnen og juster spenningsknappen til måleren viser 10 milliampere. Fjern deretter de belagte dekselslippene fra kammeret.For å visualisere og kvantifisere membran ruffles, sett prøvedekselet gli inn i kammeret til et skanningselektronmikroskop, lukk døren og trykk på evakueringsknappen. Åpne mikroskopets driftsprogramvare og sett den akselererende spenningen til 15 kilovolt og arbeidsavstanden til 10 millimeter. Trykk koordinatknappen og flytt rundt kontrolleren til cellene vises midt på observasjonsskjermen.Sett forstørrelsen til 3500 X og bilde prøven ved å klikke Bilde-knappen. Vist her er representative skanning elektron mikroskopi bilder, demonstrere membran ruffle dannelse i rå 264.7 makrofager etter behandling med PMA og makrofag koloni stimulerende faktor. Forbehandling av makrofager med makropinocytosehemmeren EIPA demper membran ruffle formasjon.Under ruffleformasjon gjennomgår plasmamembranen distinkte morfologiske stadier, inkludert et arklignende membranutstikk, en C-formet membran ruffle og en makropinocytisk kopp. Membran ruffle formasjon etter PMA og makrofag koloni stimulerende faktor behandlinger kan kvantifiseres ved hjelp av skanning elektron mikroskopi, mens makropinosom dannelse kan bekreftes av alternative avbildningsteknikker, for eksempel konfikal mikroskopi ved hjelp av Texas rød dextran og FM4-64. De blå pilene indikerer membranruffling, mens de gule og grønne pilene peker mot mikropinosomene.Til slutt kan makropinocytose bekreftes og kvantifiseres gjennom strømningscytometri ved hjelp av en fluorescerende væskefasemarkør som FITC eller Texas rød dextran. I tillegg til SEM kan levende celleavbildning og strømningscytometrianalyse av fluorescerende merket dextran internalisering også utføres for å undersøke og kvantifisere makropinocytose.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantifisere Glomerular permeabilitet i Fluorescent Macromolecules Bruke 2-Photon Mikroskopi i München Wistar rotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Dannelse av human prostata Epitel hjelp Tissue rekombinasjon av gnager Urogenitale Sinus mesenchyme og menneskelige stamceller

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Ved hjelp av en Laminering teknikk for å utføre Konfokalmikroskopi av Human Sclera


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murin modell av Fulminant myokarditt ved lysarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Fremstilling og<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av magnetisert mir-modifisert endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Undersøker von Willebrand faktor Patofysiologien ved hjelp av en Flow Chamber modell av von Willebrand faktor-Platederivert streng formasjon

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

Skanning skjelettrester for beinmineraltetthet i rettsmedisinske sammenhenger

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Mikro-Disseksjon av emalje orgel fra Mandibular helikopteret rotter utsatt for miljømessig giftstoffer

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Noninvasiv besluttsomhet Vortex formasjon tid ved hjelp av Transesophageal Echocardiography under kirurgi

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...