Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Авторы благодарят Либби Перри (Университет Августы) за помощь в подготовке проб SEM. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R01HL139562 (G.C.) и K99HL146954 (B.S.)] и Американской кардиологической ассоциацией [17POST33661254 (B.S.)].

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведен общий протокол, используемый для количественной оценки образования мембранных оборков в макрофагах RAW 264.7 с использованием микроскопии SEM. Оптимизация может потребоваться для различных типов клеток.
1. Клеточная линия и клеточная культура
<ol><li>...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

Настоящий протокол визуализации SEM предоставляет инструмент для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборок, круговых выступов и макропиноцитарных чашек на поверхности клетки in vitro. Хотя текущий протокол фокусируется на макрофагах, исследования показали,...

Макропиноцитоз представляет собой эндоцитарный процесс, ответственный за интернализацию большого количества внеклеточной жидкости и ее содержания путем образования динамических и актин-управляемых протрузий плазматической мембраны, называемых мембранными оборками1. Многие из этих мембранных оборок образуют чашечки, которые закрываются и сливаются обратно в клетку и отделяются от плазматической мембраны в виде больших, гетерогенных внутриклеточных эндосом, также известных как макропиносомы1. Хотя макропиноцитоз индуцируется факторами роста, такими как макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и эпидермальный фактор роста (EGF) в широком диапазоне типов клеток, дополнительный уникальный, кальций-зависимый процесс, известный как конститутивный макропиноцитоз, также наблюдался во врожденных иммунных клетках 2,3,4,5,6,7,8.
Было показано, что способность клеток интернализировать внеклеточный материал посредством макропиноцитоза играет важную роль в различных физиологических процессах, начиная от поглощения питательных веществ до захвата патогенов и представления антигена 9,10,11. Однако, поскольку этот процесс является неселективным и индуцируемым, он также был вовлечен в ряд патологических состояний. Действительно, предыдущие исследования показали, что макропиноцитоз играет важную роль в болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, раке, нефролитиазе и атеросклерозе 12,13,14,15,16. Кроме того, было показано, что некоторые бактерии и вирусы используют макропиноцитоз, чтобы проникнуть в клетки-хозяева и вызвать инфекцию17,18. Интересно, что стимуляция макропиноцитоза может быть также использована для адресной доставки терапевтических средств при различных заболеваниях19,20.
Предыдущие исследования изучали макропиноцитоз путем количественной оценки интернализованных флуоресцентно помеченных маркеров жидкой фазы в отсутствие и присутствие фармакологических агентов, которые ингибируют макропиноцитоз с использованием проточной цитометрии и конфокальной визуализации21,22. Доступные в настоящее время фармакологические средства, ингибирующие макропиноцитоз, ограничены и включают в себя 1) ингибиторы полимеризации актина (цитохалазин D и латрункулины), 2) блокаторы PI3K (LY-290042 и wortmannin) и 3) ингибиторы теплообменников натрия водорода (NHE) (амилорид и EIPA)5,14,15,23,24,25 . Однако, поскольку эти ингибиторы обладают независимыми от эндоцитоза эффектами, трудно выборочно определить вклад макропиноцитоза в поглощение растворенного вещества и патогенез заболевания, особенно in vivo21.
Сканирующая электронная микроскопия (SEM) - это тип электронного микроскопа, который производит изображения клеток со сверхвысоким разрешением с использованием сфокусированного пучка электронов26. В исследованиях макропиноцитоза визуализация SEM рассматривается как метод золотого стандарта для визуализации топографических и морфологических характеристик плазматической мембраны, количественной оценки образования мембранных оборок и исследования их прогрессирования в направлении интернализации макропиносом. Кроме того, сканирующая электронная микроскопия в сочетании с количественной оценкой поглощения растворенного вещества в присутствии и отсутствии блокаторов макропиноцитоза обеспечивает надежную стратегию для изучения интернализации макропиноцитотического растворенного вещества in vitro. В этой статье представлен подробный протокол о том, как подготовить клетки к SEM, визуализировать поверхность клеток, количественно оценить образование рюшей и изучить их прогресс в направлении закрытия чашки и интернализации макропиносом.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

Взъерошение мембраны представляет собой образование подвижных выступов плазматической мембраны, содержащих сетку из вновь полимеризованных актиновых нитей. Оборки мембран могут образовываться спонтанно или в ответ на факторы роста, воспалительные цитокины и сложные эфиры форбола. Некоторые из протрузий мембраны могут реорганизоваться в круглые оборки мембраны, которые сливаются на своих дистальных краях и образуют чашечки, которые закрываются и отделяются в цитоплазму в виде больших, гетерогенных вакуолей, называемых макропиносомами. Во время процесса оборки захватывают внеклеточную жидкость и растворенные вещества, которые интернализируются в макропиносомах. Сканирующая электронная микроскопия с высоким разрешением (SEM) является широко используемым методом визуализации для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборков, круговых выступов и закрытых макропиноцитарных чашек на поверхности клетки. Следующий протокол описывает условия клеточной культуры, стимуляцию образования мембранных рюшей in vitro, а также способы фиксации, обезвоживания и подготовки клеток к визуализации с использованием SEM. Также описана количественная оценка взъерошивания мембраны, нормализация данных, а также стимуляторы и ингибиторы образования мембранных рюшей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о роли макропиноцитоза в физиологических и патологических процессах, исследовать новые мишени, регулирующие образование мембранных оборок, и выявить еще не охарактеризованные физиологические стимуляторы, а также новые фармакологические ингибиторы макропиноцитоза.

Здесь мы опишем результаты представленной методики. Репрезентативные изображения SEM, показанные на рисунке 1 , демонстрируют образование мембранных оборок в макрофагах RAW 264.7 после обработки PMA и M-CSF. Изображения были сначала сделаны с увеличением 3 500x для целей количеств...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Макропиноцитоз представляет собой высококонсервативный эндоцитарный процесс, инициируемый образованием F-актин-богатых листообразных мембранных проекций, также известных как мембранные оборки. Повышенная скорость макропиноцитотической интернализации растворенного вещества была вовлечена в различные патологические состояния. Этот протокол представляет собой метод количественной оценки образования мембранных оборок in vitro с использованием сканирующей электронной микроскопии.

Визуализация образования мембранных оборок с помощью сканирующей электронной микроскопии

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Настоящий протокол визуализации SEM предоставляет инструмент для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборок, круговых выступов и макропиноцитарных чашек на поверхности клетки in vitro. SEM обеспечивает изображения поверхности клеток с высоким разрешением, которые могут быть использованы для визуализации активности макропиноцитарной мембраны. Этот метод может быть использован для открытия новых сигнальных путей, регулирующих макропиноцитоз, и выявления новых стимуляторов и ингибиторов микропиноцитоза.Начните с размещения стерильных стеклянных покровов в колодцах из 24-луночной пластины с использованием автоклавных щипцов. Затем семена сырых 264,7 макрофагов на крышку проскальзывают с плотностью от 10 до шестой клетки на миллилитр и инкубируют пластину в течение ночи в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день замените среду в каждой лунке 500 микролитрами свежей полной среды, затем предварительно обработайте макрофаги в течение 30 минут с помощью контроля транспортного средства, такого как DMSO, или ингибитора макропиноцитоза, такого как EIPA.Затем, чтобы способствовать взъерошению мембраны, обработайте клетки в течение 30 минут стимуляторами макропиноцитоза, такими как одномикролярный раствор PMA или 100 нанограммов на миллилитр макрофагального колониестимулирующего фактора. Чтобы зафиксировать ячейки для сканирующей электронной микроскопии, аспирируют среду из скважин и дважды промывают крышку слипами с ледяным PBS, затем инкубируют крышку в фиксаторе в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей ночной инкубацией при четырех градусах Цельсия. На следующий день, не нарушая клеточный монослой, аккуратно промыть и затем высиживать крышку на 500 микролитрах 0,1-моторного какодилата натрия в течение 15 минут.После двух промывок 500 микролитрам дистиллированной воды промывайте крышку дважды в 500 микролитрах градуированной серии этанола с 10-минутной инкубацией в каждой промывке. Для выполнения сушки в критической точке поместите крышку в сушилку критической точки и накройте их 100% этанолом. Затем нажмите кнопку питания и откройте резервуар с углекислым газом.Нажимайте кнопку охлаждения в течение примерно 30 секунд, пока температура не снизится до нуля градусов Цельсия. Затем нажимайте кнопку заполнения, пока в окне камеры не появится пузырь. Далее нажимаем кнопку продувки до тех пор, пока запах этанола из выхлопных газов продувки не исчезнет.Затем нажмите кнопку охлаждения еще раз, пока температура не снизится до нуля градусов Цельсия. Повторно нажмите кнопки полного заполнения и очистки, чтобы отключить их. Затем закройте резервуар с углекислым газом.Повторно нажмите на холодное дно, чтобы выключить его, затем нажмите кнопку нагрева. Установите температуру на 42 градуса Цельсия и давление на 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Как только давление и температура стабилизируются, нажмите кнопку выпуска, чтобы давление медленно снижалось.Как только давление в камере достигнет 150 фунтов на квадратный дюйм, нажмите на дно вентиляционного отверстия и подождите, пока давление не снизится до нуля фунтов на квадратный дюйм. Выключите сушилку в критической точке и удалите крышку. Затем, используя угольные клеевые краны, установите крышку на алюминиевые образцы креплений для сканирующей электронной микроскопии, затем приступайте к напылению покрытия с использованием золота или палладия в напыляющемся покрытии.Включите кнопку питания напыляемого коатера. После того, как вакуум достигнет 30 миллиторров, промывайте камеру, чтобы удалить влагу и воздух, выключив газовый выключатель и повернув клапан тонкого газа против часовой стрелки. Как только вакуум увеличится до 200 миллиторр, выключите газовый выключатель и подождите, пока вакуум не достигнет 30 миллиторов.Затем снова промыть камеру, чтобы удалить влагу и воздух, как показано на рисунке. После промывки камеры три раза нажмите на дно таймера и отрегулируйте ручку напряжения до тех пор, пока датчик не считывает 10 миллиампер. Затем снимите крышку с покрытием из камеры.Чтобы визуализировать и количественно оценить оборки мембраны, вставьте крышку образца в камеру сканирующего электронного микроскопа, закройте дверцу и нажмите кнопку эвакуатора. Откройте операционное программное обеспечение микроскопа и установите ускоряющее напряжение на 15 киловольт, а рабочее расстояние на 10 миллиметров. Нажмите кнопку «Координаты» и перемещайтесь вокруг контроллера, пока ячейки не появятся в центре экрана наблюдения.Установите увеличение на 3 500 X и создайте образец, нажав кнопку «Фото». Здесь показаны репрезентативные изображения сканирующей электронной микроскопии, демонстрирующие образование мембранных оборок в сырых макрофагах 264,7 после обработки PMA и макрофагальным колониестимулирующим фактором. Предварительная обработка макрофагов ингибитором макропиноцитоза EIPA ослабляет образование мембранных оборков.Во время образования рюшей плазматическая мембрана подвергается различным морфологическим стадиям, включая листообразную мембранную протрузию, С-образную мембранную оборку и макропиноцитарную чашечку. Образование мембранных оборок после лечения PMA и макрофагов, стимулирующих колонии, может быть количественно определено с помощью сканирующей электронной микроскопии, тогда как образование макропиносом может быть подтверждено альтернативными методами визуализации, такими как конфокальная микроскопия с использованием техасского красного декстрана и FM4-64. Синие стрелки указывают на взъерошивание мембраны, в то время как желтые и зеленые стрелки указывают на микропиносомы.Наконец, макропиноцитоз может быть подтвержден и количественно определен с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентного маркера фазы жидкости, такого как FITC или техасский красный декстран. В дополнение к SEM, визуализация живых клеток и анализ проточной цитометрии флуоресцентно меченой интернализации декстрана также могут быть выполнены для исследования и количественной оценки макропиноцитоза.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Устные Анализ биопленки небных расширителей по флуоресценции in-situ гибридизация и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Количественная клубочковой проницаемости Флуоресцентные макромолекул Используя 2-фотонной микроскопии в Мюнхене крыс Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Формирование человеческого эпителия простаты с использованием тканевых Рекомбинация грызунов мочеполовой Мезенхима Синус и стволовых клеток человека

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Использование ламинирование Методика Выполните конфокальной микроскопией Человеческой склеры


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Количественная визуализация инфильтрата лейкоцитов в мышиной модели фульминантного миокардита методом микроскопии легких листов

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

подготовки и<em&gt; In Vitro</em&gt; Характеристика замагниченного MIR-модифицированная эндотелиальные клетки

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Расследование фон Виллебранда фактор патофизиологии с помощью потока камеры модели фон Виллебранда фактор тромбоцитов строки формирования

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

Сканирования скелетных останков для минеральной плотности костной ткани в судебно-контекстах

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Микро рассечение эмаль органа от нижней челюсти резцы крыс воздействию экологических токсикантов

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Неинвазивный определение Vortex время формирования с помощью Чреспищеводная эхокардиография при сердечной хирургии

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...