Name: visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Yazarlar, SEM örnek hazırlığındaki yardımları için Libby Perry'ye (Augusta Üniversitesi) teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01HL139562 (G.C.) ve K99HL146954 (BS)] ve Amerikan Kalp Derneği [17POST33661254 (BS)] tarafından desteklenmiştir.

NOT: Aşağıdakiler, SEM mikroskobu kullanılarak RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu ölçmek için kullanılan genel bir protokoldür. Farklı hücre tipleri için optimizasyon gerekebilir.
1. Hücre hattı ve hücre kültürü
<ol><li>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %10 (hacim/hacim) ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş RAW 264.7 makrofajlarını nemlendirilmiş bir ink...

<ol>
	<li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipids+in+endocytosis,+phagocytosis,+and+macropinocytosis.">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis:+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance.">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).</li><li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages.">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages.">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).</li><li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis.">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin.">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).</li><li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells.">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens.">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).</li><li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+in+phagocytes:+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).</li><li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases.">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).</li><li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation.">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li><li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism.">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).</li><li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells.">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li><li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL.">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li><li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria.">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+by+macropinocytosis.">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li><li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis.">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li><li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells.">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs.">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li><li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells.">PKC&#948;-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).</li><li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways:+is+it+specific+enough+to+be+useful.">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li><li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li><li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy.">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors.">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li><li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes.">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300 (2015).</li><li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells.">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).</li><li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts.">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li><li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application.">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li><li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+(PLD2),+Grb2+and+Rac2+association.">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li></ol>

Mevcut SEM görüntüleme protokolü, in vitro hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için bir araç sağlar. Mevcut protokol makrofajlara odaklanmasına rağmen, çalışmalar membran fırfırı oluşumunun dendritik hücreler, fibroblastlar, nöronlar ve kanser hücreleri 11,12,14,21,30<sup class="xref...

Makrokinositoz, membran fırfırları1 adı verilen dinamik ve aktin güdümlü plazma membran çıkıntılarının oluşumu yoluyla büyük miktarda hücre dışı sıvının ve içeriğinin içselleştirilmesinden sorumlu endositik bir işlemdir. Bu zar fırfırlarının çoğu, hücreye kapanan ve tekrar kaynaşan ve plazma zarından makropinozomlar 1 olarak da bilinen büyük, heterojen hücre içi endozomlarolarak ayrılan bardaklar oluşturur. Makropinositoz, çok çeşitli hücre tiplerinde makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörleri tarafından indüklenmesine rağmen, doğuştan gelen immün hücrelerde 2,3,4,5,6,7,8 olarak bilinen ek bir benzersiz, kalsiyum bağımlı süreç de gözlenmiştir.
Hücrelerin makropinositoz yoluyla hücre dışı materyali içselleştirme yeteneğinin, besin alımından patojen yakalamaya ve antijen sunumuna kadar çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir 9,10,11. Bununla birlikte, bu süreç seçici olmadığı ve indüklenebilir olduğu için, bir dizi patolojik duruma da dahil olmuştur. Nitekim, önceki çalışmalar makropinositozun Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kanser, nefrolitiyazis ve aterosklerozda önemli bir rol oynadığını ileri sürmüştür 12,13,14,15,16. Ayrıca, bazı bakteri ve virüslerin konakçı hücrelere girmek ve enfeksiyonu indüklemek için makropinositozu kullandıkları gösterilmiştir17,18. İlginçtir ki, makropinositozun uyarılması, çeşitli hastalık koşullarında terapötik ajanların hedefe yönelik olarak verilmesi için dekullanılabilir19,20.
Önceki çalışmalar, makropinositozu inhibe eden farmakolojik ajanların yokluğunda ve varlığında ekstraktüre floresan etiketli sıvı faz belirteçlerini primer primer ve konfokal görüntüleme kullanarak nicelleştirerek makropinositozu araştırmıştır21,22. Makropinositozu inhibe eden mevcut farmakolojik araçlar, 1) aktin polimerizasyon inhibitörleri (sitokalasin D ve latrunkülinler), 2) PI3K blokerleri (LY-290042 ve wortmannin) ve 3) sodyum hidrojen eşanjörlerinin (NHE) (amilorid ve EIPA) inhibitörleri ile sınırlıdır ve bunlardan oluşur 5,14,15,23,24,25 . Ancak bu inhibitörlerin endositozdan bağımsız etkileri olduğu için makropinositozun özellikle in vivo21 olmak üzere solute alım ve hastalık patogenezine katkısını seçici olarak belirlemek zordur.
Taramalı elektron mikroskobu (SEM), odaklanmış bir elektron demeti kullanarak hücrelerin ultra yüksek çözünürlüklü görüntülerini üreten bir elektron mikroskobu türüdür26. Makropinositoz araştırmalarında, SEM görüntüleme, plazma zarının topografik ve morfolojik özelliklerini görselleştirmek, membran fırfırı oluşumunu ölçmek ve makropinozom içselleştirmeye doğru ilerlemelerini araştırmak için altın standart teknik olarak kabul edilmektedir. Ayrıca, taramalı elektron mikroskobu, makropinositoz blokerlerinin varlığında ve yokluğunda, çözünen alımının nicelleştirilmesi ile birlikte, makropinositotik çözünen içselleştirmeyi in vitro olarak incelemek için güvenilir bir strateji sağlar. Bu yazıda, hücrelerin SEM için nasıl hazırlanacağı, hücre yüzeyinin görselleştirileceği, fırfırlı oluşumunun nasıl ölçüleceği ve fincan kapanışı ve makropinozom içselleştirme yönündeki ilerlemelerinin nasıl inceleneceği konusunda ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>77825-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FitC-dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td>
			<td>Anatech USA</td>
			<td>58565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">JSM-IT500HR scanning electron microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>524400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW 264.7 macrophage</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samdri-790 Critical Point Dryer</td>
			<td>Tousimis Research Corporation</td>
			<td>8778B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Aluminum Specimen Mounts</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas red-dextra</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing membrane ruffle formation using scanning electron microscopy

Membran karıştırma, yeni polimerize aktin filamentlerinin bir ağını içeren hareketli plazma membran çıkıntılarının oluşumudur. Membran fırfırları kendiliğinden veya büyüme faktörlerine, inflamatuar sitokinlere ve forbol esterlerine yanıt olarak oluşabilir. Membran çıkıntılarının bazıları, distal kenarlarında kaynaşan dairesel membran fırfırları halinde yeniden organize olabilir ve makropinozomlar adı verilen büyük, heterojen vakuoller olarak sitoplazmaya kapanan ve ayrılan kaplar oluşturabilir. İşlem sırasında, fırfırlar hücre dışı sıvıyı ve makropinozomlar içinde içselleşen çözünürleri yakalar. Yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu (SEM), hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve kapalı makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Aşağıdaki protokol, hücre kültürü koşullarını, membran fırfırı oluşumunun in vitro olarak uyarılmasını ve SEM kullanarak görüntüleme için hücrelerin nasıl düzeltileceğini, dehidre edileceğini ve hazırlanacağını açıklamaktadır. membran karıştırmanın miktarı, veri normalizasyonu ve membran fırfırı oluşumunun uyarıcıları ve inhibitörleri de açıklanmaktadır. Bu yöntem, makropinositozun fizyolojik ve patolojik süreçlerdeki rolü hakkındaki temel soruları cevaplamaya, membran fırfırı oluşumunu düzenleyen yeni hedefleri araştırmaya ve henüz tanımlanmamış fizyolojik stimülatörlerin yanı sıra makropinositozun yeni farmakolojik inhibitörlerini tanımlamaya yardımcı olabilir.

Burada, sunulan teknikten elde edilen sonuçları açıklıyoruz. Şekil 1'de gösterilen temsili SEM görüntüleri, PMA ve M-CSF ile tedaviyi takiben RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu göstermektedir. Görüntüler ilk önce nicelleştirme amacıyla 3.500x'lik bir büyütmede ve daha sonra plazma zarını daha ayrıntılı olarak göstermek için daha yüksek büyütme seviyelerinde (8.500x ila 16.000x) yakalandı. Makrofajların makropinositoz inhibitörü EIPA ile ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Makropinositoz, membran fırfırları olarak da bilinen F-aktin bakımından zengin tabaka benzeri membran projeksiyonlarının oluşumu ile başlatılan oldukça korunmuş bir endositik işlemdir. Makropinositotik solut içselleştirme oranının artması çeşitli patolojik durumlarda rol oynamıştır. Bu protokol, taramalı elektron mikroskobu kullanarak membran fırfırı oluşumunu in vitro olarak ölçmek için bir yöntem sunar.

Taramalı Elektron Mikroskobu ile Membran Fırfırı Oluşumunu Görselleştirme

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Mevcut SEM görüntüleme protokolü, in vitro hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için bir araç sağlar. SEM, makropinositik membran aktivitelerini görselleştirmek için kullanılabilecek hücre yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlar. Bu teknik, makropinositozu düzenleyen yeni sinyal yollarını keşfetmek ve yeni stimülatörleri ve mikropinositoz inhibitörlerini tanımlamak için kullanılabilir.Steril cam kapak kaymalarını, otoklavlanmış forseps kullanarak 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirerek başlayın. Daha sonra tohum ham 264.7 makrofajları kapak üzerine mililitre başına 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda kayar ve plakayı gece boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, her bir kuyucuktaki ortamı 500 mikrolitre taze tam ortam ile değiştirin, ardından makrofajlara DMSO gibi bir araç kontrolü veya EIPA gibi bir makropinositoz inhibitörü ile 30 dakika boyunca ön işlemden geçirin.Daha sonra, membran karıştırmayı teşvik etmek için, hücreleri 30 dakika boyunca, bir mikromolar PMA çözeltisi veya mililitre makrofaj kolonisi uyarıcı faktörü başına 100 nanogram gibi makropinositoz uyarıcıları ile tedavi edin. Elektron mikroskobu taramak için hücreleri sabitlemek için, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve kapak fişlerini buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın, ardından kapak kaymalarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir fiksatif içinde inkübe edin ve ardından dört santigrat derecede gece inkübasyonu yapın. Ertesi gün, hücre tek katmanını rahatsız etmeden, yavaşça yıkayın ve daha sonra kapak kaymalarını 15 dakika boyunca 500 mikrolitre 0.1 motorlu sodyum kakodilat içinde inkübe edin.500 mikrolitre damıtılmış su ile iki yıkamanın ardından, kapak kaymalarını 500 mikrolitre derecelendirilmiş etanol serisinde iki kez yıkayın, her yıkamada 10 dakikalık bir inkübasyon ile yıkayın. Kritik nokta kurutma işlemi gerçekleştirmek için, kapak kaymalarını kritik noktalı bir kurutucuya yerleştirin ve% 100 etanol ile örtün. Ardından, güç düğmesine basın ve karbondioksit tankını açın.Sıcaklık sıfır santigrat dereceye düşene kadar soğutma düğmesine yaklaşık 30 saniye basın. Ardından, hazne penceresinde bir kabarcık görünene kadar doldur düğmesine basın. Ardından, temizleme egzozundan gelen etanol kokusu kaybolana kadar temizleme düğmesine basın.Ardından, sıcaklık sıfır santigrat dereceye düşene kadar soğutma düğmesine tekrar basın. Kapatmak için tam ve temizle düğmelerine tekrar basın. Ardından, karbondioksit tankını kapatın.Kapatmak için soğutma tabanına tekrar basın, ardından ısı düğmesine basın. Sıcaklığı 42 santigrat dereceye ve basıncı inç kare başına 1.200 pound'a ayarlayın. Basınç ve sıcaklık dengelendikten sonra, basıncın yavaşça düşmesine izin vermek için boşaltma düğmesine basın.Oda basıncı inç kare başına 150 pound'a ulaştığında, havalandırma tabanına basın ve basınç inç kare başına sıfır pound'a düşene kadar bekleyin. Kritik nokta kurutucuyu kapatın ve kapak kaymalarını çıkarın. Daha sonra, karbon yapışkan musluklar kullanarak, kapak kaymalarını elektron mikroskobu taramak için alüminyum numune yuvalarına monte edin, ardından bir püskürtme kaplayıcısında altın veya paladyum kullanarak püskürtme kaplamasına devam edin.Püskürtme kaplayıcısının güç düğmesini açın. Vakum 30 militorra ulaştıktan sonra, gaz anahtarını kapatıp ince gaz valfini saat yönünün tersine çevirerek nemi ve havayı gidermek için odayı yıkayın. Vakum 200 militorr'a yükseldiğinde, gaz anahtarını kapatın ve vakum 30 militorr'a ulaşana kadar bekleyin.Ardından, gösterildiği gibi nemi ve havayı gidermek için odayı tekrar yıkayın. Odayı üç kez yıkadıktan sonra, zamanlayıcının altına bastırın ve gösterge 10 miliamper okuyana kadar voltaj düğmesini ayarlayın. Ardından, kaplanmış kapak kaymalarını odadan çıkarın.Membran fırfırlarını görselleştirmek ve ölçmek için, numune kapağı fişlerini taramalı elektron mikroskobunun odasına yerleştirin, kapıyı kapatın ve evac düğmesine basın. Mikroskop işletim yazılımını açın ve hızlanma voltajını 15 kilovolta ve çalışma mesafesini 10 milimetreye ayarlayın. Koordinatlar düğmesine basın ve hücreler gözlem ekranının ortasında görünene kadar kontrol cihazının etrafında hareket edin.Büyütmeyi 3.500 X olarak ayarlayın ve Fotoğraf düğmesini tıklatarak örneği görüntüleyin. Burada, PMA ve makrofaj kolonisi uyarıcı faktör ile tedaviyi takiben ham 264.7 makrofajlarda membran fırfırı oluşumunu gösteren temsili taramalı elektron mikroskobu görüntüleri gösterilmektedir. Makrofajların makropinositoz inhibitörü EIPA ile ön tedavisi membran fırfırı oluşumunu azaltır.Fırfır oluşumu sırasında, plazma zarı, tabaka benzeri bir membran çıkıntısı, C şeklinde bir membran fırfırı ve bir makropinositik kap dahil olmak üzere farklı morfolojik aşamalardan geçer. PMA ve makrofaj kolonisi uyarıcı faktör tedavilerini takiben membran fırfırı oluşumu taramalı elektron mikroskobu kullanılarak ölçülebilirken, makropinozom oluşumu Texas kırmızı dekstran ve FM4-64 kullanılarak konfokal mikroskopi gibi alternatif görüntüleme teknikleri ile doğrulanabilir. Mavi oklar zarın karıştığını gösterirken, sarı ve yeşil oklar mikropinozomları işaret eder.Son olarak, makropinositoz, FITC veya Texas kırmızı dekstran gibi bir floresan sıvı faz belirteci kullanılarak akış sitometrisi ile doğrulanabilir ve ölçülebilir. SEM'e ek olarak, makropinositozu araştırmak ve ölçmek için floresan etiketli dekstran içselleştirmesinin canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi analizi de yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Floresan In-Situ Hibridizasyon ve Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Palatal Genişleticilerden Oral Biyofilm Analizi

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

İnsan sklera Konfokal Mikroskobu gerçekleştirmek için bir Laminasyon Tekniği


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Scanning Skeletal Remains for Bone Mineral Density in Forensic Contexts

Kemik Mineral Yoğunluğu adli bağlamlarda için tarama iskelet kalıntıları

The purpose of this paper is to introduce a promising, novel method to aid in the assessment of bone quality in forensically relevant skeletal remains. ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Mikro-diseksiyon emaye Organ dan çene kemiğinde kesici sıçan için çevre Toxicants maruz

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Transözofajiyal ekokardiyografi kalp cerrahisi sırasında kullanarak girdap oluşumu süre noninvaziv belirlenmesi

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...