Name: a non-invasive method for generating the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee
Uploaded: 2021-07-05T14:30:00
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Cette étude a été financée en partie par une subvention JSPS KAKENHI (numéros JP18H03129 et JP18K19739). Cette recherche a également reçu un financement de l’Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), qui est soutenue par l’Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) et le National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution P2CHD086843. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Le protocole a été approuvé par le Comité de recherche animale de l’Université de Kyoto (numéro d’approbation: Med kyo 17616).
1. Effectuer une compression cyclique in vivo sur le genou du rat
<ol><li>Induire une anesthésie animale expérimentale<ol><li>Induire l’anesthésie chez un rat Wistar âgé de 12 semaines (256,8 ± 8,7 g) par inhalation d’une solution d’isoflurane à 5% dans la boîte d’anesthésie.</li>
		<li>Injecter par voie intrapéritonéale un méla...

<ol>
	<li>De Souza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+axial+loading+of+mouse+tibiae+increases+cortical+bone+formation+and+modifies+trabecular+organization:+a+new+model+to+study+cortical+and+cancellous+compartments+in+a+single+loaded+element.">Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element.</a> Bone. 37 (6), 810-818 (2005).</li><li>Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+a+novel+and+adjustable+noninvasive+murine+joint+loading+model.">Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+response+of+mouse+joint+tissue+to+noninvasive+knee+injury+suggests+treatment+targets.">Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets.</a> Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).</li><li>Poulet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+applied+mechanical+loading+induces+subchondral+bone+thickening+that+may+be+intensified+locally+by+contiguous+articular+cartilage+lesions.">Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).</li><li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+cell-mediated+changes+in+articular+cartilage+and+bone+in+mice+are+initiated+by+a+single+session+of+controlled+cyclic+compressive+loading.">Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).</li><li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+subchondral+bone+properties+and+changes+in+development+of+load-induced+osteoarthritis+in+mice.">Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice.</a> Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).</li><li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cyclic+compression+causes+cartilage+degeneration+and+subchondral+bone+changes+in+mouse+tibiae.">In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae.</a> Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+cyclic+compressive+loading+on+the+distribution+of+local+Col2+and+superficial+lubricin+in+rat+knee+cartilage.">Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).</li><li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice.">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li><li>Iijima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+the+medial+meniscus+leads+to+subchondral+bone+defects+and+site-specific+cartilage+degeneration+in+an+experimental+rat+model.">Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model.</a> Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).</li></ol>

Pour la première fois, le protocole actuel montre comment établir un modèle de lésion cartilagineuse induite par la charge sur le condyle fémoral latéral chez le rat, similaire au modèle de lésions intra-articulaires chez les rongeurs plus petits tels que la souris2. Cependant, le protocole de charge chez la souris a provoqué une formation sévère d’ostéophytes et des lésions ligamentaires croisées, ce qui n’était pas idéal pour évaluer les effets de la compression cyclique. Le...

Traditionnellement, la transsection ou la déstabilisation du ménisque croisé antérieur (LCA) a été considérée comme optimale pour étudier l’arthrose post-traumatique (PTOA) chez les petits animaux. Ces dernières années, des modèles de compression cyclique non invasifs ont été utilisés pour étudier le PTOA. Ce modèle a été conçu à l’origine pour étudier la réponse osseuse spongieuse à la charge mécanique1 et a ensuite été modifié en tant que modèle animal non chirurgical pour les études PTOA 2,3,4,5,6. La raison est de faire entrer en collision le cartilage articulaire en appliquant une force externe périodique, ce qui déclenche une série de réponses inflammatoires. Cependant, ce modèle n’a été appliqué qu’aux souris, et l’ampleur appropriée de la charge sur les animaux plus gros n’a pas été discutée.
Un autre problème avec le modèle précédent est que le protocole à volume élevé comprenait trop de cycles, ce qui provoquait un épaississement excessif de l’os sous-chondral, un effet secondaire indésirable, dans plusieurs échantillons7. Par conséquent, une nouvelle méthode de compression cyclique avec l’ampleur appropriée pour les gros animaux et un effet secondaire de charge plus faible a été mise au point8. L’objectif global du présent article est de décrire le protocole du modèle de compression cyclique non invasive chez le rat et d’observer les résultats représentatifs de la dégénérescence du cartilage. Le protocole actuel aiderait les lecteurs intéressés par l’application du modèle de compression cyclique non invasive sur les rats.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic Apparatus for Small Animals</td>
			<td>SHINANO MFG CO.,LTD.</td>
			<td>SN-487-0T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autograph AG-X</td>
			<td>Shimadzu Corp</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>Precision Universal / Tensile Tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview FV10i microscope</td>
			<td>Olympus Corp</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>A fully automated confocal laser-scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOFLURANE Inhalation Solution</td>
			<td>Pfizer Japan Inc.</td>
			<td>(01)14987114133400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Japan Inc</td>
			<td>L3224</td>
			<td>A quick and easy two-color assay to determine viability of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRAPEZIUM X Software</td>
			<td>Shimadzu Corp</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>Data processing software for Autograph AG-X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive method for generating the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee

La physiopathologie de l’arthrose primaire (OA) reste incertaine. Cependant, une sous-classification spécifique de l’arthrose dans des groupes d’âge relativement plus jeunes est probablement corrélée à des antécédents de lésions du cartilage articulaire et d’avulsion ligamentaire. Les modèles chirurgicaux animaux de l’arthrose du genou jouent un rôle important dans la compréhension de l’apparition et de la progression de l’arthrose post-traumatique et aident au développement de nouvelles thérapies pour cette maladie. Cependant, des modèles non chirurgicaux ont récemment été envisagés pour éviter une inflammation traumatique qui pourrait affecter l’évaluation de l’intervention. 
Dans cette étude, un modèle de lésion intra-articulaire du cartilage chez le rat induit par une charge compressive cyclique in vivo a été développé, ce qui a permis aux chercheurs (1) de déterminer l’ampleur, la vitesse et la durée optimales de la charge qui pourrait causer des lésions cartilagineuses focales; (2) évaluer les changements pathologiques spatio-temporels post-traumatiques de la vitalité des chondrocytes; et (3) évaluer l’expression histologique de molécules destructrices ou protectrices impliquées dans les mécanismes d’adaptation et de réparation contre les charges de compression articulaire. Ce rapport décrit le protocole expérimental pour cette nouvelle lésion cartilagineuse dans un modèle de rat.

Un résultat représentatif des changements à court terme (1 h et 12 h) de la viabilité des chondrocytes dans des échantillons soumis à une charge cyclique de 20 N a été obtenu. Comme le montre la figure 3, le nombre de chondrocytes morts (fluorescence rouge) a augmenté 12 h après le traumatisme. Inversement, le nombre de chondrocytes vivants (fluorescence verte) a continué de diminuer, certains échantillons ne contenant aucun chondrocytes vivants dans la zone touchée.
<p clas...

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A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

Ici, nous présentons le modèle de lésion cartilagineuse intra-articulaire induite par la charge cyclique du genou du rat, générée par 60 compressions cycliques sur 20 N, entraînant des dommages au cartilage condylien fémoral chez le rat.

Méthode non invasive pour générer le modèle de lésion cartilagineuse intra-articulaire induite par la charge cyclique du genou du rat

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Ce protocole montre qu’il est possible de causer des lésions cartilagineuses chez les animaux, les animaux plus gros sans aucune intervention chirurgicale ou destruction structurée du genou de l’animal. Le plus grand avantage est que le s’avère répétitif chez les opérateurs, même sans expérience, ce qui est difficile à réaliser avec n’importe quelle méthode chirurgicale. Commencez par monter le rat anesthésié sur le dispositif de fixation.Placez le rat anesthésié couché sur le ventre sur la plaque de base avec son genou droit attaché à un petit morceau de résine avec une rainure concave. Placez le membre postérieur droit dans les positions d’extension de la hanche, de flexion du genou et d’extension de la cheville avec le genou fléchi à environ 140 degrés. Accommodez le talon du rat sur la rainure en forme de coin sur le luminaire mobile.Déplacez le dispositif de fixation vers l’instrument d’essai de contrainte et de traction et assurez-vous qu’il n’y a pas de contact avec le capteur de force. Ouvrez le logiciel de contrôle des instruments d’essai de contrainte et de traction et cliquez sur le bouton d’étalonnage. Après l’étalonnage, fixez soigneusement le haut du cadre au capteur de charge.Allumez lentement le bouton rotatif du panneau de commande principal mobile jusqu’à ce que la précharge atteigne cinq Newtons pour maintenir l’articulation du genou étroitement attachée au cadre. Dans le menu principal, cliquez sur créer une nouvelle méthode et une nouvelle étiquette système. Définissez le mode de test sur cycle et le type de test sur compression.Cliquez sur l’étiquette du capteur et sélectionnez l’onglet de test pour vérifier que la limite est comprise entre 60 Newtons. Sélectionnez ensuite l’onglet de contour et vérifiez que la limite est inférieure à 500 millimètres. Sous l’étiquette de contrôle de test, sélectionnez l’origine de la croissance pour démarrer le programme principal avec 0,3% ou pleine échelle.Réglez la vitesse de course en contrôle dans les première et troisième sections à un millimètre par seconde, puis réglez la force d’essai maximale dans la deuxième section à 20 Newtons et la force d’essai minimale dans la quatrième section à cinq Newtons. Définissez la durée de l’ensemble sur 0,5 seconde pour la charge maximale et 10 secondes pour la charge minimale. Dans l’onglet de préchargement au bas de la page, assurez-vous que activé, la vitesse de suppression de la déviation est réglée sur 100 millimètres par minute et la force maximale est de cinq Newtons.Placez le matériau en métal dans l’étiquette de l’échantillon. Dans le menu principal, sous la section Sélectionner la méthode et le test, sélectionnez la méthode qui vient d’être générée et cliquez sur Démarrer pour commencer le test. Définissez le nombre de cycles sur 60.Remettez le rat dans sa cage après le chargement et maintenez un horaire de 12 à 12 heures dans une cage avec suffisamment d’espace et de nourriture ad libitum jusqu’à ce qu’il soit temps pour l’analyse. Les changements à court terme de la viabilité des chondrocytes dans des échantillons soumis à 20 Newtons de charge cyclique ont été étudiés. Le nombre de chondrocytes morts a augmenté 12 heures après le traumatisme.À l’inverse, le nombre de chondrocytes vivants a continué de diminuer. Le cartilage articulaire des genoux du rat qui a subi 20 Newtons de charge dynamique a été endommagé et une zone de lésion focale a été confirmée dans le condyle fémoral latéral dans tous les échantillons. La taille de la lésion n’a pas augmenté progressivement au cours de la période d’observation de huit semaines.La bordure correspondant à l’interface de la lésion et du cartilage non affecté a pu être observée dans la zone touchée. Le plus important est le réglage correct de la force d’essai et le nombre de cycles. Avec cette technique, on peut contrôler la charge mécanique à la couverture articulaire du sang, ouvrant la voie à l’exploration de la façon dont la charge mécanique affecte le développement ou la prévention de l’arthrose.

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