Name: a non-invasive method for generating the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee
Uploaded: 2021-07-05T14:30:00
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Questo studio è stato sostenuto in parte da una sovvenzione JSPS KAKENHI (numeri JP18H03129 e JP18K19739). Questa ricerca ha anche ricevuto finanziamenti dall'Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), che è supportata dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) e dal National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) del National Institutes of Health con il numero di premio P2CHD086843. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Il protocollo è stato approvato dal Comitato per la ricerca sugli animali dell'Università di Kyoto (numero di approvazione: Med kyo 17616).
1. Eseguire la compressione ciclica in vivo sul ginocchio del ratto
<ol><li>Indurre l'anestesia animale sperimentale<ol><li>Indurre l'anestesia in un ratto Wistar di 12 settimane (256,8 ± 8,7 g) mediante inalazione di soluzione di isoflurano al 5% nella scatola dell'anestesia.</li>
		<li>Iniettare per via intraperitoneale una miscela di tre a...

<ol>
	<li>De Souza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+axial+loading+of+mouse+tibiae+increases+cortical+bone+formation+and+modifies+trabecular+organization:+a+new+model+to+study+cortical+and+cancellous+compartments+in+a+single+loaded+element.">Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element.</a> Bone. 37 (6), 810-818 (2005).</li><li>Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+a+novel+and+adjustable+noninvasive+murine+joint+loading+model.">Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+response+of+mouse+joint+tissue+to+noninvasive+knee+injury+suggests+treatment+targets.">Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets.</a> Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).</li><li>Poulet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+applied+mechanical+loading+induces+subchondral+bone+thickening+that+may+be+intensified+locally+by+contiguous+articular+cartilage+lesions.">Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).</li><li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+cell-mediated+changes+in+articular+cartilage+and+bone+in+mice+are+initiated+by+a+single+session+of+controlled+cyclic+compressive+loading.">Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).</li><li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+subchondral+bone+properties+and+changes+in+development+of+load-induced+osteoarthritis+in+mice.">Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice.</a> Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).</li><li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cyclic+compression+causes+cartilage+degeneration+and+subchondral+bone+changes+in+mouse+tibiae.">In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae.</a> Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+cyclic+compressive+loading+on+the+distribution+of+local+Col2+and+superficial+lubricin+in+rat+knee+cartilage.">Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).</li><li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice.">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li><li>Iijima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+the+medial+meniscus+leads+to+subchondral+bone+defects+and+site-specific+cartilage+degeneration+in+an+experimental+rat+model.">Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model.</a> Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).</li></ol>

Per la prima volta, l'attuale protocollo mostra come stabilire un modello di lesione cartilaginea indotta dal carico sul condilo femorale laterale nei ratti, simile al modello di danno intra-articolare nei roditori più piccoli come il topo2. Tuttavia, il protocollo di carico nei topi ha causato gravi formazioni osteofite e lesioni del legamento crociato, che non era l'ideale per valutare gli effetti della compressione ciclica. L'attuale protocollo ha creato una lesione focale della cartilagine ne...

Tradizionalmente, la transezione del legamento crociato anteriore (LCA) o la destabilizzazione del menisco mediale è stata considerata ottimale per lo studio dell'osteoartrite post-traumatica (PTOA) nei piccoli animali. Negli ultimi anni, modelli di compressione ciclica non invasivi sono stati utilizzati per studiare la PTOA. Questo modello è stato originariamente progettato per studiare la risposta ossea spugnosa al carico meccanico1 ed è stato poi modificato come modello animale non chirurgico per gli studi PTOA 2,3,4,5,6. Il razionale è quello di far collidere la cartilagine articolare applicando una forza esterna periodica, che innesca una serie di risposte infiammatorie. Tuttavia, questo modello è stato applicato solo ai topi e l'entità appropriata del carico su animali più grandi non è stata discussa.
Un altro problema con il modello precedente è che il protocollo ad alto volume includeva troppi cicli, che causavano un eccessivo ispessimento dell'osso subcondrale, un effetto collaterale indesiderato, in diversi campioni7. Pertanto, è stato sviluppato un nuovo metodo di compressione ciclica con la grandezza appropriata per animali di grossa taglia e un effetto collaterale di carico inferiore8. L'obiettivo generale del presente articolo è quello di descrivere il protocollo del modello di compressione ciclica non invasivo nei ratti e osservare i risultati rappresentativi della degenerazione della cartilagine. L'attuale protocollo aiuterebbe i lettori interessati all'applicazione del modello di compressione ciclica non invasivo sui ratti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic Apparatus for Small Animals</td>
			<td>SHINANO MFG CO.,LTD.</td>
			<td>SN-487-0T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autograph AG-X</td>
			<td>Shimadzu Corp</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>Precision Universal / Tensile Tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview FV10i microscope</td>
			<td>Olympus Corp</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>A fully automated confocal laser-scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOFLURANE Inhalation Solution</td>
			<td>Pfizer Japan Inc.</td>
			<td>(01)14987114133400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Japan Inc</td>
			<td>L3224</td>
			<td>A quick and easy two-color assay to determine viability of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRAPEZIUM X Software</td>
			<td>Shimadzu Corp</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>Data processing software for Autograph AG-X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive method for generating the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee

La fisiopatologia dell'osteoartrite primaria (OA) rimane poco chiara. Tuttavia, una sottoclassificazione specifica di OA in gruppi di età relativamente più giovani è probabilmente correlata con una storia di danno alla cartilagine articolare e avulsione legamentosa. I modelli animali chirurgici di OA del ginocchio svolgono un ruolo importante nella comprensione dell'insorgenza e della progressione dell'OA post-traumatica e aiutano nello sviluppo di nuove terapie per questa malattia. Tuttavia, i modelli non chirurgici sono stati recentemente considerati per evitare infiammazioni traumatiche che potrebbero influenzare la valutazione dell'intervento. 
In questo studio, è stato sviluppato un modello di ratto con lesione cartilaginea intra-articolare indotto da carico ciclico di compressione in vivo , che ha permesso ai ricercatori di (1) determinare l'entità, la velocità e la durata ottimali del carico che potrebbero causare danni alla cartilagine focale; (2) valutare i cambiamenti patologici spaziotemporali post-traumatici nella vitalità dei condrociti; e (3) valutare l'espressione istologica di molecole distruttive o protettive coinvolte nei meccanismi di adattamento e riparazione contro i carichi di compressione articolari. Questo rapporto descrive il protocollo sperimentale per questa nuova lesione cartilaginea in un modello di ratto.

È stato ottenuto un risultato rappresentativo delle variazioni a breve termine (1 ora e 12 ore) della vitalità dei condrociti in campioni sottoposti a carico ciclico di 20 N. Come mostrato nella Figura 3, il numero di condrociti morti (fluorescenza rossa) è aumentato a 12 ore dopo il trauma. Al contrario, il numero di condrociti viventi (fluorescenza verde) ha continuato a diminuire, con alcuni campioni che non contengono condrociti vivi nell'area interessata.
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A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

Qui, presentiamo il modello di lesione cartilaginea intra-articolare indotta dal carico ciclico del ginocchio di ratto, generato da 60 compressioni cicliche su 20 N, con conseguente danno alla cartilagine condilare femorale nei ratti.

Un metodo non invasivo per generare il modello di lesione cartilaginea intra-articolare indotta dal carico ciclico del ginocchio di ratto

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Questo protocollo dimostra che è possibile causare danni alla cartilagine negli animali, animali più grandi senza alcun intervento chirurgico o distruzione strutturata del ginocchio animale. Il più grande vantaggio è che si rivela ripetitivo negli operatori anche senza esperienza, il che è difficile da ottenere con qualsiasi metodo chirurgico. Inizia montando il ratto anestetizzato sul dispositivo di fissaggio.Posizionare il ratto anestetizzato sdraiato sulla pancia sulla piastra di base con il ginocchio destro attaccato a un piccolo pezzo di resina con una scanalatura concava. Posizionare l'arto posteriore destro nelle posizioni di estensione dell'anca, flessione del ginocchio e estensione della caviglia con il ginocchio flesso a circa 140 gradi. Accomodare il tallone del topo sulla scanalatura a forma di cuneo sul dispositivo mobile.Spostare il dispositivo di fissaggio sullo strumento di prova di sollecitazione e trazione e assicurarsi che non vi sia alcun contatto con la cella di carico. Aprire il software di controllo dello strumento per prove di sollecitazione e trazione e fare clic sul pulsante di calibrazione. Dopo la calibrazione, fissare con attenzione la parte superiore del telaio alla cella di carico.Accendere lentamente la manopola rotante sul pannello operativo principale mobile fino a quando il precarico raggiunge i cinque Newton per mantenere l'articolazione del ginocchio strettamente attaccata al telaio. Nel menu principale, fare clic su crea un nuovo metodo e un'etichetta di sistema. Impostare la modalità test su ciclo e il tipo di test su compressione.Fare clic sull'etichetta del sensore e selezionare la scheda test per verificare che il limite sia entro 60 Newton. Quindi selezionare la scheda Tratto e verificare che il limite sia entro 500 millimetri. Sotto l'etichetta di controllo dei test, selezionare l'origine della crescita per avviare il programma principale con lo 0,3% o fondo scala.Impostare la velocità di corsa in controllo nella prima e terza sezione su un millimetro al secondo, quindi impostare la forza di prova massima nella seconda sezione su 20 Newton e la forza di prova minima nella quarta sezione su cinque Newton. Impostare la durata dell'intero su 0,5 secondi per il carico di picco e 10 secondi per il carico minimo. Nella scheda di precaricamento nella parte inferiore della pagina, assicurarsi che sia selezionata, la velocità di rimozione della deflessione sia impostata su 100 millimetri al minuto e che la forza massima sia di cinque Newton.Impostare il materiale come metallo nell'etichetta del campione. Nel menu principale sotto la sezione seleziona metodo e test, seleziona il metodo appena creato e fai clic su avvia per iniziare il test. Impostare il numero di cicli su 60.Riportare il ratto nella sua gabbia dopo il caricamento e mantenere un programma buio chiaro di 12-12 ore in una gabbia con spazio sufficiente e cibo ad libitum fino al momento dell'analisi. Sono stati studiati i cambiamenti a breve termine nella vitalità dei condrociti in campioni sottoposti a 20 Newton di carico ciclico. Il numero di condrociti morti è aumentato a 12 ore dopo il trauma.Al contrario, il numero di condrociti viventi ha continuato a diminuire. La cartilagine articolare delle ginocchia di ratto che hanno subito 20 Newton di carico dinamico è stata danneggiata e una zona focale della lesione è stata confermata nel condilo femorale laterale in tutti i campioni. La dimensione della lesione non è aumentata progressivamente durante il periodo di osservazione di otto settimane.Il bordo corrispondente all'interfaccia della lesione e della cartilagine non interessata potrebbe essere osservato nella zona interessata. La cosa più importante sono le impostazioni corrette della forza di prova e il numero di cicli. Con questa tecnica, è possibile controllare il carico meccanico alla copertura articolare del sangue, aprendo la strada per esplorare come il carico meccanico influisce sullo sviluppo o sulla prevenzione dell'osteoartrite.

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