Name: a non-invasive method for generating the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee
Uploaded: 2021-07-05T14:30:00
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本研究の一部は、JSPS科研費助成(JP18H03129、JP18K19739)の助成を受けて行われました。 この研究はまた、Eunice Kennedy Shriver国立小児保健人間発達研究所(NICHD)、国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)、および国立衛生研究所の国立生物医学画像生物工学研究所(NIBIB)の支援を受けているAlliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training(AR3T)からも資金提供を受けています。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

京都大学動物研究委員会(承認番号:医学教17616)により承認されました。
1.ラットの膝に in vivo 周期的圧迫を実行します
<ol><li>実験動物の麻酔を誘発する<ol><li>麻酔ボックス内の5%イソフルラン溶液を吸入することにより、12週齢のWistarラット(256.8 ± 8.7 g)に麻酔を誘発します。.</li>
		<li>メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノールを含む3種類の麻酔薬<sup class="xref"...

<ol>
	<li>De Souza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+axial+loading+of+mouse+tibiae+increases+cortical+bone+formation+and+modifies+trabecular+organization:+a+new+model+to+study+cortical+and+cancellous+compartments+in+a+single+loaded+element.">Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element.</a> Bone. 37 (6), 810-818 (2005).</li><li>Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+a+novel+and+adjustable+noninvasive+murine+joint+loading+model.">Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+response+of+mouse+joint+tissue+to+noninvasive+knee+injury+suggests+treatment+targets.">Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets.</a> Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).</li><li>Poulet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+applied+mechanical+loading+induces+subchondral+bone+thickening+that+may+be+intensified+locally+by+contiguous+articular+cartilage+lesions.">Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).</li><li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+cell-mediated+changes+in+articular+cartilage+and+bone+in+mice+are+initiated+by+a+single+session+of+controlled+cyclic+compressive+loading.">Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).</li><li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+subchondral+bone+properties+and+changes+in+development+of+load-induced+osteoarthritis+in+mice.">Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice.</a> Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).</li><li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cyclic+compression+causes+cartilage+degeneration+and+subchondral+bone+changes+in+mouse+tibiae.">In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae.</a> Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+cyclic+compressive+loading+on+the+distribution+of+local+Col2+and+superficial+lubricin+in+rat+knee+cartilage.">Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).</li><li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice.">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li><li>Iijima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+the+medial+meniscus+leads+to+subchondral+bone+defects+and+site-specific+cartilage+degeneration+in+an+experimental+rat+model.">Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model.</a> Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).</li></ol>

現在のプロトコルは初めて、マウス2などの小さなげっ歯類の関節内損傷モデルと同様に、ラットの外側大腿骨顆に負荷誘発軟骨病変のモデルを確立する方法を示しています。しかし、マウスの負荷プロトコルは重度の骨棘形成と十字靭帯病変を引き起こし、周期的圧迫の効果を評価するのに理想的ではありませんでした。現在のプロトコルは、はるかに低い負荷力でラット...

伝統的に、前十字靭帯(ACL)の切断または内側半月板の不安定化は、小動物の心的外傷後変形性関節症(PTOA)の調査に最適であると考えられてきました。近年、非侵襲的な周期的圧縮モデルがPTOAの研究に使用されています。このモデルはもともと機械的負荷に対する海綿骨の反応を調査するために設計され1、その後、PTOA研究2,3,4,5,6の非外科的動物モデルとして変更されました。理論的根拠は、一連の炎症反応を引き起こす周期的な外力を加えることによって関節軟骨を衝突させることです。しかし、このモデルはマウスにのみ適用されており、より大きな動物への負荷の適切な大きさは議論されていませんでした。
以前のモデルの別の問題は、大量のプロトコルに含まれるサイクルが多すぎるため、いくつかのサンプルで軟骨下骨の過度の肥厚、望ましくない副作用を引き起こしたことです7。そこで、大型動物に適した大きさで負荷の副作用が低い新しい周期圧縮法が開発されました8。現在の記事の全体的な目標は、ラットの非侵襲的周期的圧迫モデルのプロトコルを説明し、軟骨変性の代表的な結果を観察することです。現在のプロトコルは、ラットへの非侵襲的周期的圧縮モデルの適用に関心のある読者を助けるでしょう。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic Apparatus for Small Animals</td>
			<td>SHINANO MFG CO.,LTD.</td>
			<td>SN-487-0T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autograph AG-X</td>
			<td>Shimadzu Corp</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>Precision Universal / Tensile Tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview FV10i microscope</td>
			<td>Olympus Corp</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>A fully automated confocal laser-scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOFLURANE Inhalation Solution</td>
			<td>Pfizer Japan Inc.</td>
			<td>(01)14987114133400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Japan Inc</td>
			<td>L3224</td>
			<td>A quick and easy two-color assay to determine viability of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRAPEZIUM X Software</td>
			<td>Shimadzu Corp</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>Data processing software for Autograph AG-X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive method for generating the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee

原発性変形性関節症(OA)の病態生理は不明のままである。しかし、比較的若い年齢層におけるOAの特定の下位分類は、関節軟骨損傷および靭帯剥離の病歴と相関している可能性が高い。膝のOAの外科動物モデルは、心的外傷後OAの発症と進行を理解する上で重要な役割を果たし、この病気の新しい治療法の開発に役立ちます。しかし、非外科的モデルは、介入の評価に影響を与える可能性のある外傷性炎症を回避するために最近検討されている。 
この研究では、 in vivo 周期圧縮負荷によって誘発される関節内軟骨病変ラットモデルが開発され、研究者は(1)局所軟骨損傷を引き起こす可能性のある負荷の最適な大きさ、速度、および持続時間を決定することができました。(2)軟骨細胞の活力における心的外傷後時空間病理学的変化を評価する。(3)関節圧縮荷重に対する適応および修復メカニズムに関与する破壊的または保護的分子の組織学的発現を評価する。この報告では、ラットモデルにおけるこの新しい軟骨病変の実験プロトコルについて説明します。

20 Nの周期負荷を受けたサンプルの軟骨細胞の生存率の短期的変化(1時間および12時間)の代表的な結果が得られました。 図3に示すように、死骸軟骨細胞数(赤色蛍光)は外傷後12時間で増加した。逆に、生きた軟骨細胞の数(緑色蛍光)は減少し続け、患部に生きた軟骨細胞を含まないサンプルもありました。
組織学的には、20N動的荷重を受けたラット膝...

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A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

本稿では,ラットの大腿骨顆軟骨損傷を20N以上60回周期的に圧迫することにより生じたラット膝の周期的荷重誘発関節内軟骨病変モデルを提示する.

ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

このプロトコールは、動物、より大きな動物において、いかなる外科的介入または動物の膝の構造的破壊もなしに軟骨損傷を引き起こすことが可能であることを示している。最大の利点は、経験がなくてもオペレーターが反復的であることが判明し、これはどの外科的方法でも達成するのが難しいことです。麻酔をかけたラットを固定装置に取り付けることから始めます。麻酔をかけたラットを腹の上に置き、右膝を凹溝のある樹脂片に取り付けてベースプレートに置きます。右後肢を股関節伸展、膝の屈曲、足首伸展の位置に置き、膝を約140度曲げます。可動器具のくさび形の溝にラットのかかとを収容します。固定装置を応力および引張試験装置に移動し、ロードセルとの接触がないことを確認します。応力および引張試験装置の制御ソフトウェアを開き、キャリブレーションボタンをクリックします。キャリブレーション後、フレームの上部をロードセルに慎重に取り付けます。可動式のメイン操作パネルの回転ノブを、予圧が5ニュートンに達するまでゆっくりとオンにして、膝関節をフレームにしっかりと取り付けたままにします。メインメニューで、[新しいメソッドとシステムラベルの作成]をクリックします。テストモードをサイクルに設定し、テストタイプを圧縮に設定します。センサーラベルをクリックし、テストタブを選択して、制限が60ニュートン以内であることを確認します。次に、ストロークタブを選択し、制限が500ミリメートル以内であることを確認します。テストコントロールラベルの下で、成長の起源を選択して、0.3%またはフルスケールでメインプログラムを開始します。1番目と3番目のセクションの制御ストローク速度を毎秒1ミリメートルに設定し、2番目のセクションの最大テスト力を20ニュートンに、4番目のセクションの最小テスト力を5ニュートンに設定します。全体の期間をピーク負荷の場合は 0.5 秒、最小負荷の場合は 10 秒に設定します。ページの下部にある[プリロード]タブで、[オン]がオンにチェックされ、たわみ除去速度が毎分100ミリメートルに設定され、最大力が5ニュートンであることを確認します。試験片ラベルで材料を金属として設定します。メインメニューの[メソッドとテストの選択]セクションで、ビルドしたばかりのメソッドを選択し、[開始]をクリックしてテストを開始します。サイクル数を60に設定します。ロード後にラットをケージに戻し、分析の時間になるまで十分なスペースと食物を自由に摂取したケージ内で12〜12時間の明るい暗いスケジュールを維持します。20ニュートンの周期負荷を受けたサンプルにおける軟骨細胞の生存率の短期的な変化を研究しました。死んだ軟骨細胞の数は、外傷後12時間で増加しました。逆に、生きている軟骨細胞の数は減少し続けました。20ニュートンの動的負荷を受けたラット膝の関節軟骨が損傷し、すべてのサンプルで外側大腿骨顆に1つの限局性病変ゾーンが確認されました。病変の大きさは8週間の観察期間中に徐々に増加しなかった。病変と影響を受けていない軟骨の界面に対応する境界が患部に観察される可能性があります。最も重要なことは、試験力とサイクル数の適切な設定です。この技術により、血液の関節被覆への機械的負荷を制御することができ、機械的負荷が変形性関節症の発症または予防にどのように影響するかを探る道を開くことができる。

Research

JoVE Journal

Medicine

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