Name: flow cytometric analysis of apoptotic biomarkers in actinomycin d-treated siha cervical cancer cells
Uploaded: 2021-08-26T14:00:00
Duration: 13 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells at JoVE.com

अध्ययन को राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) और दक्षिण अफ्रीकी चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एसएएमआरसी) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। हम अमरूद म्यूज़ सेल विश्लेषक की खरीद के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य प्रयोगशाला सेवा (एनएचएलएस) को स्वीकार करना चाहते हैं। इस प्रकाशन के सभी आंकड़े Biorender.com के साथ बनाए गए थे।

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	<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+cell+death:+Recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death+2018.">Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).</li><li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+by+design:+apoptosis,+necrosis+and+autophagy.">Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (6), 663-669 (2004).</li><li>Arends, M. J., Morris, R. G., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis.+The+role+of+the+endonuclease.">Apoptosis. The role of the endonuclease.</a> The American journal of pathology. 136 (3), 593-608 (1990).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Apoptosis. , 33-73 (1998).</li><li>Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+apoptosis+detection.">Flow cytometry-based apoptosis detection.</a> Methods in molecular biology. 559, 19-32 (2009).</li><li>. Introduction to Flow Cytometry Basics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html</a> (2021)</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+principles+and+clinical+applications.">Flow cytometry: principles and clinical applications.</a> Med Lab Sci. 45 (2), 165-173 (1988).</li><li>Darzynkiewicz, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry.">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).</li><li>Darzynkiewicz, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+in+cell+necrobiology:+Analysis+of+apoptosis+and+accidental+cell+death+(necrosis).">Cytometry in cell necrobiology: Analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis).</a> Cytometry. 27 (1), 1-20 (1997).</li><li>Ormerod, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+apoptotic+cells+by+flow+cytometry.">The study of apoptotic cells by flow cytometry.</a> Leukemia. 12 (7), 1013-1025 (1998).</li><li>van Engeland, M., Nieland, L. J., Ramaekers, F. C., Schutte, B., Reutelingsperger, C. 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R., Ryan, C., Obermoser, G., Schwarzenberger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry.">Flow cytometry.</a> J Invest Dermatol. 132 (10), 1-6 (2012).</li><li>L&#246;vborg, H., Gullbo, J., Larsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+apoptosis-classical+and+emerging+techniques.">Screening for apoptosis-classical and emerging techniques.</a> Anti-cancer drugs. 16 (6), 593-599 (2005).</li><li>Vorobjev, I. A., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parametric+imaging+of+cell+heterogeneity+in+apoptosis+analysis.">Multi-parametric imaging of cell heterogeneity in apoptosis analysis.</a> Methods. 112, 105-123 (2017).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods in molecular biology. 263, 141-160 (2004).</li><li>Kagami, S., Rizzo, H. L., Lee, J. J., Koguchi, Y., Blauvelt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Th17,+Th22,+and+Th1+cells+are+increased+in+psoriasis.">Circulating Th17, Th22, and Th1 cells are increased in psoriasis.</a> J Invest Dermatol. 130 (5), 1373-1383 (2010).</li><li>. Muse&#174; Annexin V &amp; Dead Cell Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/">https://www.luminexcorp.com/muse-annexin-v-dead-cell-kit/</a> (2019)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Kroemer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+cell+death:+recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death.">Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death.</a> Cell Death and Differentiation. 12 (2), 1463-1467 (2005).</li><li>Apoptosis assays and markers guide. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays">https://www.abcam.com/kits/apoptosis-assays</a> (2021)</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+A+Review+of+Programmed+Cell+Death.">Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Saelens, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+released+from+mitochondria+in+cell+death.">Toxic proteins released from mitochondria in cell death.</a> Oncogene. 23 (16), 2861-2874 (2004).</li><li>Muse&#8482; MitoPotential Kit User's Guide. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit">https://www.luminexcorp.com/muse-mitopotential-kit</a> (2013)</li><li>McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+functions+in+cell+death+and+disease.">Caspase functions in cell death and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (4), 008656 (2013).</li><li>Wigdal, S. S., Kirkland, R. A., Franklin, J. L., Haak-Frendscho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+release+precedes+mitochondrial+membrane+potential+loss+in+cerebellar+granule+neuron+apoptosis:+lack+of+mitochondrial+swelling.">Cytochrome c release precedes mitochondrial membrane potential loss in cerebellar granule neuron apoptosis: lack of mitochondrial swelling.</a> Journal of Neurochemistry. 82 (5), 1029-1038 (2002).</li><li>Muse&#174; Caspase-3/7 Kit. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview">https://www.luminexcorp.com/muse-caspase-3-7-kit/#overview</a> (2019)</li><li>H&#228;cker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+of+apoptosis.">The morphology of apoptosis.</a> Cell and Tissue Research. 301 (1), 5-17 (2000).</li><li>Muse&#174; Multi-Color DNA Damage Kit User's Guide. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview">https://www.luminexcorp.com/muse-multi-color-dna-damage-kit/#overview</a> (2020)</li><li>Kleeff, J., Kornmann, M., Sawhney, H., Korc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinomycin+D+induces+apoptosis+and+inhibits+growth+of+pancreatic+cancer+cells.">Actinomycin D induces apoptosis and inhibits growth of pancreatic cancer cells.</a> International journal of cancer. 86 (3), 399-407 (2000).</li><li>Wlodkowic, D., Skommer, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+of+apoptosis.+Historical+perspective+and+new+advances.">Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances.</a> Experimental oncology. 34 (3), 255-262 (2012).</li><li>Szeberenyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+actinomycin+D+on+RNA+metabolism+in+human+cells.">The effect of actinomycin D on RNA metabolism in human cells.</a> Biochem Mol Biol Educ. 34 (1), 50-51 (2006).</li><li>Ginell, S., Lessinger, L., Berman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+and+molecular+structure+of+the+anticancer+drug+actinomycin+D--some+explanations+for+its+unusual+properties.">The crystal and molecular structure of the anticancer drug actinomycin D--some explanations for its unusual properties.</a> Biopolymers. 27 (5), 843-864 (1988).</li><li>Hou, M. H., Robinson, H., Gao, Y. G., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+actinomycin+D+bound+to+the+CTG+triplet+repeat+sequences+linked+to+neurological+diseases.">Crystal structure of actinomycin D bound to the CTG triplet repeat sequences linked to neurological diseases.</a> Nucleic Acids Res. 30 (22), 4910-4917 (2002).</li></ol>

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इस अध्ययन में, एफसी द्वारा विश्लेषण किए गए एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा कोशिकाओं ने एपोप्टोसिस के लिए महत्वपूर्ण प्रारंभिक और देर से बायोमार्कर का खुलासा किया। सेल की तैयारी, गणना और धुंधला करने के लिए उप-इष्टतम स्थितियों ने गलत परिणामों की पहचान की, एफसी प्रदर्शन करते समय निर्माता के निर्देशों के निकट पालन की आवश्यकता पर जोर दिया।
प्रारंभिक और देर से बायोमार्कर पहचान द्वारा एपोप्टोसिस का यह अध्ययन एपोप्टोसिस की जांच के लिए एनसीसीडी दिशानिर्देशों1 के अनुरूप है। एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा संस्कृतियों ने शुरुआती और देर से एपोप्टोटिक चरणों के लिए सकारात्मक बायोमार्कर का प्रदर्शन किया। पीआई परख और माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता परख से पता चला है कि एक्टिनोमाइसिन डी ने क्रमशः पीएस-फ्लिप पैटर्न और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संक्रमण के अपव्यय को प्रेरित किया। एक बार जब एपोप्टोटिक कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल गड़बड़ी से प्रेरित कोई वापसी के बिंदु तक पहुंच जाती हैं, तो टर्मिनल कैसपेस 3,7 सक्रिय होते हैं। इस अध्ययन में देखे गए टर्मिनल कैसपेस 3 और 7 की सक्रियता देर से चरण एपोप्टोसिस को इंगित करती है। इसके अलावा, टर्मिनल कैसपेस सक्रियण इंटरन्यूक्लियोसोमल डीएनए दरार और व्यापक डीएनए विखंडन का कारण बनता है, जिसे शास्त्रीय रूप से जेल वैद्युतकणसंचलन28,38 द्वारा देखे गए चरण-सीढ़ी पैटर्न के रूप में रिपोर्ट किया गया है।
एटीएम और एच 2 ए के साथ परमाणु क्षति। एक्स एफसी डीएनए क्षति परख ने डीएनए और कुल डीएनए क्षति में डबल-स्ट्रैंड ब्रेक दिखाया। इन परिणामों ने प्रयोगात्मक संस्कृतियों में शास्त्रीय डाउनस्ट्रीम कैसपेज़-प्रेरित एपोप्टोटिक परमाणु क्षति (कैरियोरहेक्सिस और कैरियोरिलिसिस) की पुष्टि की। इस प्रकार कई प्रवाह साइटोमेट्रिक बायोमाकर्स के उपयोग ने एपोप्टोसिस में अनुक्रमिक मल्टीस्टेज घटनाओं का पता लगाया और प्रारंभिक और देर से एपोप्टोटिक चरणों में सटीक और पुन: पहचान की गई सेल आबादी की पहचान की। ये निष्कर्ष मनुष्यों में कैंसर के उपचार में एक्टिनोमाइसिन डी की ज्ञात प्रो-एपोप्टोटिक विशेषताओं के अनुरूप हैं 37,39,40,41 और एपोप्टोसिस की जांच करने वाले एफसी सेल कल्चर प्रयोगों में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक्टिनोमाइसिन डी के उपयोग का समर्थन करते हैं।
इस अध्ययन में सेल आबादी की गेटिंग को नकारात्मक माध्यम और विलायक नियंत्रणों द्वारा सूचित किया गया था, जिसने स्वस्थ कोशिकाओं से एपोप्टोटिक को अलग किया था। वैकल्पिक रूप से, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों की आबादी के मिश्रण का उपयोग सेल जनसंख्या गेट 7,9 सेट करने के लिए जीवित और एपोप्टोटिक सेल आबादी को परिभाषित करने के लिए भी किया जा सकता है। एक बार रोगग्रस्त और स्वस्थ सेलुलर राज्यों को परिभाषित और गेट किया जाता है, तो टेम्पलेट सेटिंग्स को बाद के सभी प्रयोगात्मक और नियंत्रण संस्कृतियों पर लागू किया जा सकता है।
झूठे परिणामों से बचने के लिए एफसी प्रोटोकॉल का सख्ती से पालन आवश्यक है। प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, निम्नलिखित समस्याएं देखी गईं: (1) कम सेल एकाग्रता, (2) उच्च सेल एकाग्रता, (3) सेल क्लंपिंग, (4) लंबे समय तक धुंधलापन, और (5) खराब नमूना हैंडलिंग। अनुकूलित प्रोटोकॉल आवश्यकताओं के सख्त पालन से इन समस्याओं को रोका जा सकता है। यह सटीक डेटा प्राप्त करने के लिए एफसी के लिए पूर्व-विश्लेषणात्मक और विश्लेषणात्मक चरणों की महत्वपूर्ण प्रकृति पर जोर देता है। सेल की तैयारी के दौरान, ट्रिप्सिनाइजेशन, पाइपटिंग, सेंट्रीफ्यूजेशन और कमजोर पड़ने को देखभाल के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। ओवर-ट्रिप्सिनाइजेशन और जोरदार पाइपिंग के परिणामस्वरूप क्रमशः कोशिकाओं के रासायनिक और यांत्रिक कतरनी हो सकते हैं। लंबे समय तक और उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन के परिणामस्वरूप सेल टूटने और उच्च सेलुलर मलबे की गिनती हो सकती है। सेल घटनाओं के गलत अधिग्रहण को कम करने के लिए इष्टतम सेल एकाग्रता की आवश्यकता होती है। इसलिए, इष्टतम सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्राथमिक सेल निलंबन को पतला किया जाना चाहिए।
इसके अलावा, नमूनों को संभालते समय, सेल क्लंपिंग और सेल विखंडन को रोकने के लिए देखभाल की जानी चाहिए और यह सुनिश्चित करना चाहिए कि विश्लेषण के दौरान कोशिकाएं निलंबन में रहें। सेल क्लंपिंग को रोकने के लिए नमूना हैंडलिंग एकल लामिनर सेल प्रवाह की अनुमति देता है, उपकरण के केशिका ट्यूबिंग के यांत्रिक अवरोध को रोकता है, और नकली बड़े सेल आकार इंडेक्स को रोकता है। एक और चेतावनी प्रकाश के खिलाफ संस्कृतियों की रक्षा कर रही है ताकि फोटो-ऑक्सीकरण से बचा जा सके और गलत-नकारात्मक परिणामों को रोकने के लिए परख में फ्लोरोफोर े के शमन को रोका जा सके। कोशिकाओं के धुंधला चरण और बाद के प्रसंस्करण चरणों में न्यूनतम प्रकाश जोखिम सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसके अलावा, लंबे समय तक इम्यूनोस्टेनिंग समय के परिणामस्वरूप गलत-सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं क्योंकि प्रोटीन गैर-विशेष रूप से दागदार होते हैं। इसलिए, निर्माता-निर्धारित इनक्यूबेशन धुंधला अवधि का पालन महत्वपूर्ण है।
सारांश में, एफसी एपोप्टोसिस का सटीक रूप से पता लगा सकता है और सेल संस्कृति में शुरुआती और देर से एपोप्टोसिस बायोमार्कर के बीच भेदभाव कर सकता है। इसके अलावा, प्रौद्योगिकी में प्रगति ने सेल स्वास्थ्य और जटिल इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों का अध्ययन करने के लिए गैर-विशेषज्ञ वैज्ञानिकों के लिए बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर के निर्माण को जन्म दिया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Lasec</td>
			<td>P1PLA044C-000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P10-040500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes/Eppendorf</td>
			<td>Merck</td>
			<td>EP0030122208-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Annexin V kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH100105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Caspase-3/7 kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH100108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Count and Viability kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH600103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse DNA Damage kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH200107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse MitoPotential kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MCH100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70013065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiHa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P10-040500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of apoptotic biomarkers in actinomycin d-treated siha cervical cancer cells

एपोप्टोसिस बायोमाकर्स की जांच एक बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा गर्भाशय ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं में की गई थी। एपोप्टोसिस के प्रारंभिक बायोमाकर्स (एनेक्सिन वी और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता) और देर से बायोमाकर्स (कैसपेस 3 और 7, और डीएनए क्षति) को प्रयोगात्मक और नियंत्रण संस्कृतियों में मापा गया था। संस्कृतियों को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। कोशिकाओं को तब ट्रिप्सिन का उपयोग करके अलग किया गया था और प्रवाह साइटोमेट्रिक सेल काउंट परख का उपयोग करके गणना की गई थी। कोशिकाओं को एनेक्सिन वी परख, एक माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रोकेमिकल ट्रांसमेम्ब्रेन संभावित परख, एक कैसपेस 3/7 परख और एक डीएनए क्षति परख का उपयोग करके एपोप्टोसिस के लिए विश्लेषण किया गया था। यह लेख एपोप्टोसिस और पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री का अवलोकन प्रदान करता है, और एसआईएचए कोशिकाओं के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक प्रोटोकॉल को विस्तृत करता है। परिणाम सकारात्मक, नकारात्मक और उप-इष्टतम प्रयोगात्मक डेटा का वर्णन करते हैं। इस विश्लेषणात्मक मंच का उपयोग करके एपोप्टोसिस के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण करने में व्याख्या और चेतावनी पर भी चर्चा की गई है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण एपोप्टोसिस के लिए प्रारंभिक और देर से बायोमार्कर का सटीक माप प्रदान करता है।

सेल गिनती और व्यवहार्यता (चित्रा 3) के परिणामों से पता चला है कि नमूने में 95.2% कोशिकाएं जीवित थीं, और 4.8% मृत थीं। मूल नमूने में कुल सेल एकाग्रता 6.20 x 106 सेल / एमएल थी।
एनेक्सीन वी और सेल डेथ परख (चित्रा 4) ने नियंत्रण की तुलना में 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज किए गए सिहा कोशिकाओं में एपोप्टोटिक कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण वृद्धि (पी < 0.0001) दिखाई। चूंकि प्रारंभिक चरण एपोप्टोसिस के दौरान कोशिकाओं में एनेक्सिन वी धुंधला बढ़ जाता है, इस खोज से पता चलता है कि 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी ने सिहा कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित किया।
माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रोकेमिकल ट्रांसमेम्ब्रेन संभावित परख (चित्रा 5) ने एक्टिनोमाइसिन डी, मध्यम नियंत्रण और विलायक नियंत्रण के बीच सेल स्वास्थ्य प्रोफाइल (जीवित, विध्रुवीकृत और जीवित, विध्रुवीकृत और मृत, मृत) में एक महत्वपूर्ण कमी (पी < 0.0001) का प्रदर्शन किया। इन आंकड़ों से पता चलता है कि 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी ने सिहा कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल विध्रुवण को प्रेरित किया।
कैसपेस 3/7 परख (चित्रा 6) ने नियंत्रण की तुलना में 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज किए गए सिहा कोशिकाओं में कैसपेस 3 और 7 के महत्वपूर्ण (पी < 0.0001) सक्रियण का प्रदर्शन किया। ये खोज दर्शाती है कि 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी ने सिहा कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित किया।
डीएनए क्षति परख (चित्रा 7) से पता चला है कि 100 एनजी / एमएल एक्टिनोमाइसिन डी काफी (पी < 0.0001) ने डीएनए क्षति मार्करों, एटीएम और एच 2 ए को प्रेरित किया। एक्स, सिहा कोशिकाओं में। यह खोज एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज किए गए सिहा कोशिकाओं में डीएनए क्षति में महत्वपूर्ण वृद्धि का सुझाव देती है।
उप-मानक प्रयोगों के परिणाम (चित्रा 8) सभी परखों में विश्लेषणात्मक विचारों को प्रदर्शित करते हैं। सेल एकाग्रता डेटा की सटीकता को प्रभावित करती है। चित्रा 8 ए में, सेल गिनती अस्वीकार्य रूप से कम है। डॉट प्लॉट के सभी 4 क्वाड्रेंट्स में गेटेड सेल आबादी में कम सिग्नल तीव्रता होती है। निर्माता अंतिम नमूना मात्रा में 300-700 कोशिकाओं / μL के लिए परख का अनुकूलन करता है। यह उदाहरण निर्माता द्वारा निर्धारित सही नमूना एकाग्रता का उपयोग करने के महत्व को दर्शाता है।
इसके अलावा, उच्च सेल सांद्रता ने भी गलत परिणाम दिए (चित्रा 8 बी)। मध्यम और प्रयोगात्मक संस्कृतियों ने क्रमशः 99.95% और 100% जीवित कोशिकाओं का प्रदर्शन किया। दोनों परखों के लिए प्रवाह दर निर्माता की 100-500 कोशिकाओं / μL की अनुकूलित एकाग्रता से अधिक थी और गलत विश्लेषण से बचने के लिए 1x परख बफर के साथ कमजोर पड़ने की आवश्यकता थी।
प्रयोगात्मक संस्कृतियों की तैयारी के दौरान सेल क्लंपिंग से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह सेल आकार सूचकांक में वृद्धि के कारण गलत परिणाम पैदा करता है, जैसा कि एनेक्सिन वी परख में दिखाया गया है। चित्रा 8 सी उच्च सेल एकाग्रता की दोहरी समस्या को दर्शाता है जो निर्माता के निर्देश और सेल क्लंपिंग से अधिक है, जैसा कि सिहा मध्यम नियंत्रण में 4 से अधिक सेल आकार सूचकांक से स्पष्ट है। उच्च कोशिका एकाग्रता को मध्यम संस्कृतियों में कोशिकाओं के एक उज्ज्वल लाल विमान बनाने वाली कोशिकाओं की शीट िंग द्वारा चित्रित किया जाता है, जो उच्च एपोप्टोटिक सेल आबादी का प्रदर्शन करता है।
संस्कृतियों के लंबे समय तक धुंधला होने से प्रोटीन का गैर-विशिष्ट बंधन हो सकता है और इसके परिणामस्वरूप गलत परिणाम हो सकते हैं, जैसा कि एनेक्सिन वी परख द्वारा प्रदर्शित किया गया है। चित्रा 8 डी लंबे समय तक धुंधला होने के कारण मध्यम और प्रयोगात्मक संस्कृतियों के लिए समान परिणाम प्रदर्शित करता है।
खराब नमूना हैंडलिंग, अनुयायी कोशिकाओं के विस्तारित ट्रिप्सिनीकरण, धोने के चरणों के दौरान जोरदार पाइपिंग, और उच्च गति और लंबे समय तक सेंट्रीफ्यूजेशन कदम सेल लाइसिस और सेल मलबे की उच्च मात्रा का कारण बनते हैं। चित्रा 8 ई में, कैसपेस 3/7 परख द्वारा विश्लेषण की गई संस्कृतियां एक छोटे सेल आकार सूचकांक (<2.2 सेल आकार सूचकांक) द्वारा प्रमाणित सेल मलबे में वृद्धि का प्रदर्शन करती हैं। इसलिए डेटा अधिग्रहण के लिए नमूने तैयार करते समय सावधानी बरतनी चाहिए।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig03.jpg"> चित्रा 3: सेल गिनती और व्यवहार्यता परख। जनसंख्या प्रोफ़ाइल मलबे को जीवित और मृत कोशिकाओं से अलग करती है। दो-आयामी डॉट प्लॉट गेटेड है और जीवित और मृत कोशिका आबादी को विभाजित करता है। सूचना पैनल सेल गिनती, कुल व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत, और नमूने में व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है। इन आंकड़ों का उपयोग बाद के एपोप्टोसिस विश्लेषण के लिए सभी नमूनों में सेल गिनती को मानकीकृत करने के लिए किया जा सकता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig04.jpg"> चित्रा 4: एनेक्सिन वी परख। सभी नमूने समान गेटिंग पैरामीटर दिखाते हैं, और प्रत्येक उप-आबादी के सांख्यिकीय विश्लेषण से एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में एपोप्टोसिस में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चलता है। सभी परखों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में किया गया था, और प्रत्येक प्रयोग को तीन प्रतियों में परख लिया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पी < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig05.jpg"> चित्रा 5: माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रोकेमिकल ट्रांसमेम्ब्रेन संभावित परख। सभी नमूने समान गेटिंग पैरामीटर दिखाते हैं, और प्रत्येक उप-आबादी के सांख्यिकीय विश्लेषण से एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में महत्वपूर्ण गड़बड़ी का पता चलता है। सभी परखों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में किया गया था, और प्रत्येक प्रयोग को तीन प्रतियों में परख लिया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पी < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig06.jpg"> चित्रा 6: कैसपेस 3/7 पहचान परख। सभी नमूने समान गेटिंग पैरामीटर दिखाते हैं, और प्रत्येक उप-आबादी के सांख्यिकीय विश्लेषण से एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में कैसपेस 3/7 गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चलता है। सभी परखों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में किया गया था, और प्रत्येक प्रयोग को तीन प्रतियों में परख लिया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पी < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig07.jpg"> चित्रा 7: डीएनए क्षति परख। सभी नमूने समान गेटिंग पैरामीटर दिखाते हैं, और प्रत्येक उप-आबादी के सांख्यिकीय विश्लेषण से एक्टिनोमाइसिन डी के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में डबल-स्ट्रैंड डीएनए क्षति और कुल डीएनए क्षति में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चलता है। सभी परख तीन स्वतंत्र प्रयोगों पर किए गए थे, और प्रत्येक प्रयोग को तीन प्रतियों में परख लिया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। * पी < 0.05; पी < 0.001; पी < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig07large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig8v2.jpg"> चित्रा 8: उप-इष्टतम प्रयोगात्मक स्थितियां खराब परिणाम देती हैं । (ए) कोशिकाओं की कम सांद्रता, (बी) कोशिकाओं की उच्च सांद्रता, (सी) सेल क्लंपिंग और एकत्रीकरण उच्च सेल आकार सूचकांक द्वारा स्पष्ट है, (डी) दोनों नमूनों में सकारात्मक धुंधलापन में वृद्धि से स्पष्ट सेल नमूनों का लंबे समय तक धुंधलापन, और (ई) सेलुलर मलबे में वृद्धि (सेल आकार सूचकांक < 2.2) से स्पष्ट खराब नमूना हैंडलिंग। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig8v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

एपोप्टोसिस को प्रारंभिक और देर से एपोप्टोटिक बायोमार्कर के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा चिह्नित किया जा सकता है। सर्वाइकल कैंसर सेल लाइन, सिहा, का विश्लेषण बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके एक्टिनोमाइसिन डी के साथ उपचार के बाद एपोप्टोसिस बायोमार्कर के लिए किया गया था।

एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं में एपोप्टोटिक बायोमार्कर का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

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