Name: synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets
Uploaded: 2021-10-15T14:10:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets at JoVE.com

Les auteurs aimeraient remercier le Dr Brandon Helfield pour avoir aidé à construire l’échangeur de gaz et le Dr Miffy Hok Yan Cheng pour les discussions techniques. Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement suivantes : Bourse d’études supérieures de l’Ontario, Instituts de recherche en santé du Canada, Institut de recherche Terry Fox et Fondation du cancer Princess Margaret.

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Paproski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin+nanodroplets:+Sub-micrometer+ultrasound+and+photoacoustic+contrast+imaging+agents.">Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents.</a> Small. 12 (3), 371-380 (2016).</li><li>Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+the+local+and+targeted+delivery+of+osteoarthritis+drugs.">Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs.</a> Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).</li><li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy:+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs.">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’imagerie par ultrasons est une forme non invasive et non ionisante d’imagerie médicale qui utilise des ondes acoustiques. Alors que les échographes sont plus portables et peuvent fournir des images en temps réel, l’imagerie échographique peut souffrir d’un faible contraste, ce qui rend difficile pour les échographistes de distinguer de manière fiable des caractéristiques pathologiques échogéniques similaires. Pour contrer cette limitation, des microbulles peuvent être injectées dans l’hôte pour améliorer le contraste vasculaire. Les microbulles sont des agents de contraste remplis de gaz de la taille d’un micron qui sont hautement échogéniques aux ondes acoustiques et peuvent fournir un contraste de récipient amélioré1,2. Les coquilles et les noyaux de gaz des microbulles peuvent être adaptés à différentes applications, telles que l’imagerie, la thrombolyse, la perméabilisation de la membrane cellulaire ou l’ouverture vasculaire transitoire2.
Un inconvénient des microbulles est leur courte demi-vie de circulation. Par exemple, les microsphères lipidiques de perflutren cliniquement disponibles n’ont qu’une demi-vie de 1,3 minutes3. Pour les longues séances d’imagerie, plusieurs injections de microbulles sont nécessaires. Un autre inconvénient des microbulles est leur grand diamètre. Alors que les microsphères lipidiques perflutren ont un diamètre d’environ 1 à 3 μm, suffisamment petites pour circuler dans le système vasculaire, elles sont trop grandes pour s’extravaser et s’accumulent passivement dans les tissus d’intérêt, tels que les tumeurs4. Une stratégie pour surmonter ces limitations consiste à condenser les microbulles du noyau gazeux en gouttelettes plus petites à noyau liquide5,6. Bien que les gouttelettes ne soient pas échogènes à l’état liquide, elles peuvent être vaporisées en microbulles lors de l’exposition à des ultrasons avec une pression négative de crête suffisamment élevée, retrouvant ainsi leur capacité à fournir un contraste. Cela permet à la gouttelette de tirer parti de la pharmacocinétique plus favorable d’un petit noyau liquide, tout en conservant la capacité de fournir un contraste lorsqu’elle est insonée et sans modifier la composition chimique4,7.
Le décafluorobutane est un composé perfluorocarboné idéal pour le déphasage entre les états gazeux et liquide5,6,7. Le décafluorobutane permet la condensation des microbulles en gouttelettes avec réduction de température seule, tandis que les perfluorocarbures moins denses nécessitent une pressurisation supplémentaire5. Cette méthode douce minimise la destruction des bulles lors de la condensation7,8,9. Comme leurs noyaux sont liquides, les gouttelettes sont non échogéniques et invisibles aux ultrasons. Cependant, avec l’application d’une énergie acoustique ou thermique suffisante, les noyaux liquides peuvent se vaporiser à nouveau dans un état gazeux, générant des microbulles échogéniques8. Cette vaporisation permet de contrôler quand et où générer des microbulles.
Alors que les gouttelettes sont utiles pour l’accumulation passive, la vaporisation in situ ou l’amélioration de la perméabilité cellulaire4,les gouttelettes (et leurs fragments) ne peuvent pas être imagées ou quantifiées ex vivo. Par conséquent, des agents de diagnostic compagnons quantifiables, tels que les fluorescents4,10,11, particules magnétiques12, agents absorbants optiquement13, sont utilisés comme analogue pour évaluer l’administration de gouttelettes aux tissus d’intérêt. Par exemple, Helfield et al. ont utilisé une co-injection de nanobilles fluorescentes pour la quantification d’images histologiques d’organes de souris car les gouttelettes ne pouvaient pas être détectées par fluorescence4. L’inconvénient des agents de diagnostic compagnons est que le composant traçable peut agir indépendamment de la gouttelette en fonction de son profil pharmacocinétique individuel.
Heureusement, la coque des microbulles et des gouttelettes peut être personnalisée. Par exemple, Huynh et al. ont démontré des agents de contraste à ultrasons avec des coquilles porphyrine-lipidique, créant des microbulles multimodales14. Les porphyrines sont une classe de composés organiques à structure macrocylique aromatique14,15. Ils sont optiquement absorbants, fluorescents et peuvent être chélatés en une grande variété de métaux pour la radiothérapie, l’imagerie à base de radionucléides ou la quantification à base de métauxtraces 14. Un exemple de porphyrine est le pyrophéophore (Pyro). En conjuquant Pyro sur des lipides, l’incorporation de pyro-lipides dans des microbulles ou des gouttelettes leur permet d’être imagés et suivis à travers de multiples modalités: acoustiquement, fluorescentement et par absorbance14. Cet agent de contraste multimodal pourrait être utilisé pour suivre et quantifier l’accumulation. Cela pourrait éliminer le besoin d’agents de diagnostic compagnons car le composant quantifiable est maintenant conjugué sur la coque, ce qui permet une quantification plus précise del’administration 16.
Ici, un protocole pour la création de gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase est décrit. Comme les contrastes échographiques peuvent être utilisés comme plate-forme pour l’administration de médicaments aux tissus d’intérêt, tels que les tumeurs2,4, étendre leur détectabilité au-delà des ultrasons pourrait s’avérer utile pour la quantification de l’efficacité de l’administration. Le but de ces gouttelettes est de fournir des agents de contraste à ultrasons traçables capables d’accumulation passive in vivo,de vaporisation in situ et d’acoustique, et ayant le potentiel de quantifier la biodisance ou l’accumulation à partir d’organes ex vivo sans dépendre de capteurs secondaires. Des méthodes de caractérisation sont également décrites pour mettre en évidence le potentiel des gouttelettes de porphyrine en tant que capteurs de biodiss distribution. Les effets de la charge pyro-lipidique dans la coquille (0% à 50% par rapport molaire) sont également discutés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt)</td>
			<td >Avanti Polar Lipids</td>
			<td >880220</td>
			<td >Also known as &#34;DSPE-PEG5K&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td >Avanti Polar Lipids</td>
			<td >855775</td>
			<td>Also known as &#34;DSPC&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Seals, Tear-Off</td>
			<td >VWR</td>
			<td >16171-840</td>
			<td>Standard Aluminum, 13 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath Sonicator</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of&#160; sonicating and heating up to 70 &#176;C,</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Stor Screw Cap Vials</td>
			<td >National Scientific</td>
			<td >BS20NABP</td>
			<td>Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilicate glass clear serum vials</td>
			<td >VWR</td>
			<td >16171-285</td>
			<td>3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap</td>
			<td >VWR</td>
			<td >66011-020</td>
			<td>1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform&#160;</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coulter Counter Elctrolyte Diluent</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Compatible with Coulter Counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decafluorobutane (C4F10)</td>
			<td >FluoroMed</td>
			<td >355-25-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deionized Water</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dry Ice (Carbon Dioxide)</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of temperature control</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E-Z Crimper, 13 mm</td>
			<td >Wheaton</td>
			<td >W225302</td>
			<td>13 mm Standard Aluminum Seals</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E-Z Decapper, 13 mm</td>
			<td >Wheaton</td>
			<td >W225352</td>
			<td>13 mm Standard Aluminum Seals</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescent Spectrophotometer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are&#160; optical windows&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gas Exchanger</td>
			<td >Made in-house</td>
			<td ></td>
			<td>Refer to Supplementary Information - &#34;Other Protocols and Data&#34; for assembly instructions.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass syringes</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GLWR Custom Aperture Tube 10 um</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >B42812</td>
			<td>10 &#181;m aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulated Styrofaom containers with lids</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lyophilization-Style Rubber Stoppers</td>
			<td >VWR</td>
			<td >71000-060</td>
			<td>7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Membrane Diaphram Vacuum Pump</td>
			<td >Sartorius Stedim</td>
			<td >16694-1-60-06</td>
			<td>Adjustable pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metal Tongs</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer</td>
			<td >VisualSonics</td>
			<td ></td>
			<td>21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiSizer 4e</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of sizing from 0.2&#181;m to 6 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >567-0010</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1&#956;m pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles, Conventional</td>
			<td >BD</td>
			<td >305176</td>
			<td>20 gauge, 1.5 inch length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nitrogen Gas</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Called &#34;wax film&#34; in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>1X, 7.4 pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette Tips</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Syringes</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polyethersulfone (PES) Membrane Filter</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>0.2 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Propylene Glycol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td >Made in-house</td>
			<td ></td>
			<td>Also known as &#34;Pyro-SPC&#34;. Refer to &#34;Supplementary Information - Other Protocols and Data&#34; for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermometer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>(-20 to 100 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Also known as &#34;2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure Water</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Type 1 Purity</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultraviolet&#8211;Visible (UV-Vis) Spectrophotometer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultraviolet&#8211;Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacuum Desiccator</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform</td>
			<td >VisualSonics</td>
			<td ></td>
			<td>Pre-clinical ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vialmix</td>
			<td >Bristol-Myers-Squibb</td>
			<td ></td>
			<td>Called &#34;mechanical agitator&#34; in the protocol. Agitates for 45 s.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex Mixer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets

Les gouttelettes à changement de phase sont une classe d’agents de contraste à ultrasons qui peuvent se convertir en microbulles échogéniques in situ avec l’application d’une énergie acoustique suffisante. Les gouttelettes sont plus petites et plus stables que leurs homologues à microbulles. Cependant, les agents de contraste à ultrasons traditionnels ne sont pas traçables au-delà des mesures de rétroaction acoustique, ce qui rend difficile la quantification de la biodiss distribution ou de l’accumulation ex vivo des agents de contraste. Les chercheurs pourraient devoir s’appuyer sur des particules diagnostiques compagnons fluorescentes ou optiquement absorbantes pour déduire la biodisponse. Le but de ce protocole est de détailler les étapes de création de gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase à l’aide d’une méthode de condensation. Les porphyrines sont des molécules fluorescentes avec des bandes d’absorbance distinctes qui peuvent être conjuguées sur des lipides et incorporées dans des gouttelettes pour étendre la polyvalence des gouttelettes, permettant une bio-distribution plus robuste tout en conservant les propriétés acoustiques. Sept formulations avec des teneurs variables en porphyrine-lipides et en lipides de base ont été faites pour étudier les distributions de taille des microbulles et des gouttelettes. Des caractérisations adaptées aux structures contenant de la porphyrine sont également décrites dans le protocole pour démontrer leur polyvalence analytique en solution. Le dimensionnement a montré que les diamètres moyens post-condensés étaient de 1,72 à 2,38 fois plus petits que les populations de précurseurs. La caractérisation de l’absorbance a montré que les assemblages intacts avaient un pic en bande Q de 700 nm tandis que les échantillons perturbés avaient un pic d’absorbance à 671 nm. La caractérisation de la fluorescence a montré que 30% intacts des assemblages porphyrine-lipides étaient trempés par fluorescence (>97%), avec une récupération de fluorescence obtenue lors de la perturbation. La vaporisation acoustique a montré que les gouttelettes de porphyrine n’étaient pas échogènes à des pressions plus basses et pouvaient être converties en microbulles échogéniques avec des pressions suffisantes. Ces caractérisations montrent le potentiel des gouttelettes de porphyrine à éliminer le besoin de stratégies de diagnostic compagnon basées sur l’absorbance ou la fluorescence pour quantifier la biodisance des agents de contraste par ultrasons pour l’administration ou des applications thérapeutiques in vivo ou ex vivo.

Des échantillons de microbulles précondensés et de taille sélectionnée (n = 3) et des échantillons de gouttelettes post-condensées (n = 3) ont été dimensionnés sur un compteur Coulter (CC) avec une ouverture de 10 μm. Une limitation de l’ouverture de 10 μm est qu’il ne peut pas mesurer des particules inférieures à 200 nm, ce qui peut biaiser la taille et la concentration moyennes. La figure 4 montre les données de dimensionnement pour chacune des formulations à teneur en pyro-lipides. Le tableau 1 présente des statistiques basées sur les données de dimensionnement. En utilisant un rapport de diamètres moyens pré- et post-condensés, les résultats ont montré que la formulation pyro-lipidique à 0% avait le plus petit décalage de diamètre moyen à 1,72 ± 0,02. La formulation pyro-lipidique à 50 % avait le plus grand diamètre moyen à 2,38 ± 0,08. L’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 1 % avait la concentration observée la plus élevée à (2,71 ± 0,13) ×10 10 /mL, tandis que l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 40 % avait la concentration observée la plus faible à (7,36 ± 0,81) × 109 /mL. Les données de dimensionnement ont montré que l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 10% avait le plus petit dimètre de crête à 261 ± 13 nm tandis que l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 50% avait le plus grand à 390 ± 55 nm. Généralement, à mesure que la teneur en pyro-lipides augmentait, la concentration diminuait et le diamètre moyen augmentait. Comme les échantillons post-condensés sont basés sur l’échantillon de microbulles précurseurs, la tendance s’est produite pour les deux types d’agents de contraste à ultrasons. Au fur et à mesure que la teneur en pyro-lipides augmentait, une sous-population de microbulles (avec une taille maximale d’environ 2000 μm) a commencé à se former. Ce pic secondaire n’était pas présent dans l’échantillon de microbulles pyro-lipidiques à 0 % et le plus apparent dans les populations de pyro-lipides à 40 % et 50 %.
La figure 5 montre des mesures d’absorbance représentatives de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 30 %. Le pic de l’échantillon intact dans PBS était de 700 nm tandis que l’échantillon perturbé dans Triton a déplacé le pic à 671 nm. Cela a montré que les assemblages intacts ont des propriétés optiques différentes de ceux des composants lipidiques individuels non assemblés.
La figure 6A montre des mesures de fluorescence représentatives de l’échantillon de microbulles pré-condensées tandis que la figure 6B montre un échantillon de gouttelettes post-condensées avec 30% de pyro-lipides. L’échantillon intact dans PBS avait un pic de fluorescence à 704 nm tandis que la forme perturbée avait un pic à 674 nm. En soustrayant la zone perturbée sous la courbe avec la zone intacte sous la courbe et en divisant la différence par la zone perturbée sous la courbe, on donne l’efficacité de trempe, qui s’avère être de 98,61% et 98,07% pour l’échantillon de microbulles pyro-lipidiques à 30% et l’échantillon de gouttelettes, respectivement.
Pour démontrer la conversion des gouttelettes en microbulles, des gouttelettes diluées ont été imagées et vaporisées dans un fantôme d’écoulement à 37 °C avec un système à ultrasons. La figure 7 montre des images échographiques représentatives de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 30 % imagé à différentes pressions. À basse pression(Figure 7A),il y avait très peu de signal, seulement un signal de fond provenant de bulles d’air bloquées par la synthèse de la gélose. En effet, les gouttelettes ne sont pas échogènes et ne diffusent pas d’ultrasons. À une puissance légèrement élevée, quelques microbulles ont été générées(figure 7B),comme le montre l’apparition de mouchetures brillantes. Au fur et à mesure que la pression augmentait, davantage de microbulles étaient générées(Figure 7C et 7D). Cela a également démontré que les gouttelettes ne se vaporisent pas spontanément à 37 °C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig1v2.jpg"> Figure 1: Images des étapes pour former la solution pyro-lipidique à 30%. A) Poudre lipidique plus Pyro-SPC dans le chloroforme. B) Solution dissolvante ajoutée. C) Film lipidique séché et enduit sur la paroi intérieure du flacon. D) Flacon lipidique enveloppé dans du papier d’aluminium (feuille extérieure scotchée pour réutilisation). E) Solution lipidique hydratée. F) Solution lipidique en flacon de sérum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig2v2.jpg"> Figure 2: L’échangeur de gaz à 10 collecteurs. Les vannes référencées dans le protocole sont étiquetées. Voir le fichier supplémentaire « Autres protocoles et données » pour obtenir des instructions sur la façon d’assembler l’échangeur de gaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig03.jpg"> Figure 3: A) Les solutions lipidiques des 7 formulations (0% à 50% pyro-SPC) dans des flacons d’échantillons. Les figures B à D montrent des images des mesures prises pour fabriquer 30% de gouttelettes pyro-lipidiques. B) Solution pyro-lipidique à 30 % dans un flacon d’échantillon. C) Post-agitation. D) 15 min taille sélectionnée. E) Cloison inférieure transférée dans le flacon de décafluorobutane. D) Post-condensation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig04.jpg"> Figure 4: Données de dimensionnement du compteur coulter (CC) des échantillons de microbulles et de gouttelettes sélectionnés par taille avec une teneur différente en coquille pyro-lipidique (n = 3). Les lignes vertes pleines représentent des microbulles et les lignes cyan pointillées représentent des gouttelettes. A) 0 % Pyro-SPC. B) 1 % Pyro-SPC. C) 10 % pyro-RCP. D) 20 % pyro-RCP. E) 30 % pyro-RCP. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H) Concentrations totales observées d’échantillons de microbulles et de gouttelettes du CC sur la base de la teneur en pyro-RCP dans la coquille. Toutes les barres d’erreur indiquent un écart-type. Toutes les mesures ont été effectuées en utilisant une ouverture de 10 μm qui a une plage de taille de 200 nm à 6000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig05.jpg"> Figure 5: Mesures représentatives de l’absorbance par spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis) de 300 à 800 nm de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques post-condensées à 30 % diluées dans du PBS et dans du Triton à 1 %. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig06.jpg"> Figure 6: Émission de fluorescence représentative de 600 à 750 nm excitée à 410 nm. A) Échantillon de microbulles pyro-lipidiques pré-condensé de 30 % sélectionné en taille dans pbS et dans 1 % de triton. B)Échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques post-condensées à 30 % dans le PBS et dans le Triton à 1 %. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig07.jpg"> Figure 7: Images échographiques représentatives d’un fantôme à flux d’agar à 37 °C prises avec un transducteur à réseau linéaire préclinique de 21 MHz en mode B (voir Tableau des matériaux). La colonne de gauche (Figures A, C, E, & G) montre les contrôles PBS. La colonne de droite(figures B, D, Fet H)montre 20 μL d’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques post-condensées à 30 % diluées dans 50 mL de PBS à 37 °C. Chaque rangée représente les pressions négatives de pointe en champ libre, qui ont été estimées à partir des travaux effectués par Sheeran et al.8 Les triangles jaunes indiquent la profondeur de mise au point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Méthode</td>
			<td>Agent</td>
			<td>Pyro Shell %</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>30</td>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bulles</td>
			<td>Conc. [/mL]</td>
			<td>(2,76 ± 0,28) × 10^10</td>
			<td>(3.04 ± 0.15) × 10^10</td>
			<td>(2.02 ± 0.11) × 10^10</td>
			<td>(1,91 ± 0,22) × 10^10</td>
			<td>(1,47 ± 0,05) × 10^10</td>
			<td>(8,47 ± 0,95) × 10^9</td>
			<td>(9,89 ± 0,15) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bulles</td>
			<td>Crête [nm]</td>
			<td>329 ± 6</td>
			<td>297 ± 15</td>
			<td>305 ± 21</td>
			<td>273 ± 14</td>
			<td>310 ± 40</td>
			<td>266 ± 33</td>
			<td>393 ± 89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bulles</td>
			<td>Moyenne [nm]</td>
			<td>609 ± 2</td>
			<td>603 ± 15</td>
			<td>635 ± 6</td>
			<td>690 ± 8</td>
			<td>812 ± 1</td>
			<td>935 ± 22</td>
			<td>950 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bulles</td>
			<td>Médiane [nm]</td>
			<td>450 ± 6</td>
			<td>421 ± 6</td>
			<td>414 ± 6</td>
			<td>432 ± 5</td>
			<td>490 ± 2</td>
			<td>596 ± 37</td>
			<td>695 ± 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gouttelettes</td>
			<td>Conc. [/mL]</td>
			<td>(2.18 ± 0.07) × 10^10</td>
			<td>(2,71 ± 0,13) × 10^10</td>
			<td>(1,75 ± 0,18) × 10^10</td>
			<td>(1,72 ± 0,13) × 10^10</td>
			<td>(1.09 ± 0.01) × 10^10</td>
			<td>(7,36 ± 0,81) × 10^9</td>
			<td>(7,38 ± 0,28) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gouttelettes</td>
			<td>Crête [nm]</td>
			<td>292 ± 0</td>
			<td>297 ± 17</td>
			<td>261 ± 13</td>
			<td>280 ± 9</td>
			<td>268 ± 17</td>
			<td>287 ± 38</td>
			<td>390 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gouttelettes</td>
			<td>Moyenne [nm]</td>
			<td>353 ± 5</td>
			<td>350 ± 5</td>
			<td>347 ± 1</td>
			<td>347 ± 4</td>
			<td>397 ± 1</td>
			<td>399 ± 6</td>
			<td>400 ± 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Gouttelettes</td>
			<td>Médiane [nm]</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>310 ± 1</td>
			<td>315 ± 2</td>
			<td>340 ± 0</td>
			<td>367 ± 5</td>
			<td>370 ± 9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Statistiques des données de dimensionnement des échantillons de microbulles et de gouttelettes ayant une teneur en Pyro-SPC différente de celles du compteur Coulter (CC) (n = 3). Toutes les erreurs indiquent un écart-type.
Renseignements supplémentaires - Feuille de formule lipidique : <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Lipid%20Formula%20Sheet.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Informations supplémentaires - Autres protocoles et données : <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Other%20Protocols%20and%20Data.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets

Dans ce protocole, les méthodes de synthèse et de caractérisation des gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase sont décrites.

Synthèse et caractérisation de gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase

Phase-change droplets are a class of ultrasound contrast agents that can convert into echogenic microbubbles in situ with the application of sufficient ...

Ce protocole est important car il fournit la procédure complète pour créer des gouttelettes du film lipidique à la solution lipidique aux microbulles puis aux gouttelettes. Le principal avantage de cette technique est la simplicité de condensation des microbulles en gouttelettes. Juste en refroidissant et en tourbillonnant, les gouttelettes peuvent être faites sans avoir besoin de pressurisation.Une démonstration visuelle est essentielle car un test simple pour voir si les microbulles ont été condensées avec succès consiste à vérifier visuellement le changement de translucidité. Kimoon Yoo, étudiant à la maîtrise dans le laboratoire Gang Zheng, fera la démonstration de la procédure. À l’aide d’un décapant, retirez le joint en aluminium sur le flacon de sérum et transférez un millilitre de la solution lipidique dans un flacon d’échantillon de verre borosilicate de 1,85 millilitre avec un bouchon à vis phénolique en laissant la solution lipidique s’écouler le long de la paroi intérieure sans créer de bulles.Avec le flacon d’échantillon de 1,85 millilitre, préparez-vous à faire circuler du décafluorobutane dans l’espace de tête du flacon d’échantillon à l’aide de l’échangeur de gaz. Assurez-vous que toutes les vannes de l’échangeur de gaz sont correctement fermées et que la pompe est éteinte. Ouvrez la vanne du collecteur et détez soigneusement l’aiguille correspondante du collecteur.Ouvrez la soupape de pression A et la soupape de pression B et tournez la vanne de la bouteille de gaz environ 1/16 à 1/8 dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour l’ouvrir partiellement. Ouvrez la valve de poignée en T et dévissez le flacon d’échantillon avec la solution lipidique. Placez l’aiguille du collecteur au-dessus de l’interface d’air liquide du flacon, tournez lentement la vanne du régulateur d’air dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que l’aiguille de la jauge du régulateur d’air se déplace légèrement de sa position de repos et laissez le gaz perfluorocarboné s’écouler doucement dans l’espace de tête du flacon pendant 30 secondes, en prenant soin de ne pas créer de bulles.Réglez la vanne du régulateur d’air si nécessaire. Après 30 secondes, conserver soigneusement et rapidement le flacon d’échantillon sans trop déplacer le flacon. La vanne de bouteille de gaz, la vanne de poignée en T, la vanne de régulation d’air, la soupape de pression A, la soupape de pression B et la vanne de collecteur.Gainez soigneusement l’aiguille, puis étiquetez le flacon d’échantillon et scellez le cou avec un film de cire dans le sens des aiguilles d’une montre. Conservez le flacon d’échantillon dans l’obscurité et à quatre degrés Celsius pendant au moins 10 minutes ou jusqu’à 24 heures. Placez environ 100 grammes de glace carbonique dans un récipient isotherme en place de la glace ordinaire dans un autre récipient isotherme.Récupérez un flacon de sérum de décafluorobutane préalablement préparé dans des aiguilles de calibre 20 de 1,5 pouce, une seringue en plastique d’un millilitre, un récipient de 200 millilitres, des pinces en métal et un thermomètre. Placer le flacon d’échantillon avec la solution lipidique dans l’agitateur mécanique et agiter pendant 45 secondes. Il devrait y avoir un changement de couleur et de translucidité.Après l’agitation mécanique, placez le flacon d’échantillon du côté droit à l’abri de la lumière et commencez un compte à rebours de 15 minutes pour refroidir le flacon et sélectionnez la taille des microbulles. Lorsque le compte à rebours a atteint 10 minutes, remplissez un récipient avec environ 200 millilitres d’isopropanol et refroidissez-le à moins 20 degrés Celsius avec de la glace carbonique à l’aide de pinces métalliques. Une fois que les microbulles ont été sélectionnées pendant 15 minutes, recherchez la partition de taille sélectionnée à l’intérieur du flacon d’échantillon.En gardant le flacon d’échantillon côté droit vers le haut, en déplafonner soigneusement le flacon d’échantillon et en prélever environ 0,7 millilitre de la cloison inférieure avec une aiguille de calibre 20 de 1,5 pouce attachée à une seringue en plastique d’un millilitre. Assurez-vous qu’aucune des cloisons supérieures n’est retirée et ne faites pas glisser la seringue pour retirer les poches d’air. En visant le cercle central sur le bouchon en caoutchouc, insérez une aiguille de calibre 20 différente dans un flacon de sérum décafluorobutane tout en gardant l’aiguille près du haut du flacon de sérum pour éventiler, puis insérez l’aiguille avec les microbulles de taille sélectionnée.Transférez lentement la taille des microbulles sélectionnées. Laissez le liquide glisser doucement le long de la paroi intérieure du flacon de sérum de décafluorobutane. Une fois que toute la solution de microbulles sélectionnée a été transférée, retirez l’aiguille avec la seringue, mais gardez l’aiguille de ventilation à l’intérieur pour soulager la pression négative.Ajoutez de petites quantités de glace carbonique ou d’isopropanol à température ambiante au bain d’isopropanol pour vous assurer que la température du bain se situe entre moins 15 et moins 17 degrés Celsius. Avec l’aiguille de ventilation de calibre 20 insérée près du haut du flacon de sérum, placez le flacon de sérum et le bain d’isopropanol, en maintenant le niveau de microbulles en dessous du niveau de l’isopropanol, mais le col du flacon au-dessus et faites tourbillonner par intermittence le flacon de sérum pendant deux minutes pour condenser les microbulles. Ne pas faire tourbillonner le flacon de sérum en continu dans l’isopropanol et ne pas laisser la solution geler.Tourbillonner pendant environ cinq secondes et soulever le flacon de sérum de l’isopropanol. Vérifiez s’il n’y a pas de nucléation de glace, puis recommencez à tourbillonner dans l’isopropanol. S’il y a formation de glace, faites tourbillonner le flacon de sérum dans l’air jusqu’à ce qu’il se dissipe.Après les deux minutes de condensation, retirez le flacon de sérum du bain d’isopropanol et retirez l’aiguille de ventilation. Les microbulles doivent s’être condensées en gouttelettes comme l’indique le changement de translucidité. Essuyez le flacon de sérum, étiquetez-le et placez-le sur de la glace ordinaire dans un récipient isotherme sombre jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.Les gouttelettes non ouvertes avec un joint en aluminium intact doivent être stables jusqu’à six heures tant que la glace fondue est remplacée au besoin. Lorsqu’il est prêt à l’emploi, retirez le joint en aluminium avec le décapant. Après avoir utilisé ce protocole, des microbulles pré-condensées de taille sélectionnée et des gouttelettes post-condensées ont été dimensionnées sur un compteur Coulter avec une ouverture de 10 microns.Les données de dimensionnement pour la formulation pyro-lipidique à 30% sont indiquées. Les statistiques basées sur les données de dimensionnement sont présentées ici. En utilisant un rapport entre les diamètres moyens pré-condensés et post-condensés, les résultats ont montré qu’à mesure que la teneur en pyro-lipides augmentait, la concentration diminuait et le diamètre moyen augmentait.Les mesures représentatives des absorbants de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 30% sont montrées. Cela a montré que les assemblages intacts ont des propriétés optiques différentes, reflétées par des pics différents par rapport aux composants lipidiques individuels non assemblés. Des mesures de floraison représentatives de l’échantillon de microbulles pré-condensées et de gouttelettes post-condensées avec 30% de pyro-lipide sont présentées ici, démontrant différents pics de fluorescence pour des échantillons intacts sous la forme perturbée.Des images échographiques représentatives de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 30% imagées à différentes pressions sont montrées. À basse pression, seul le signal de fond des bulles d’air bloquées par la synthèse de la gélose a été observé. À une puissance légèrement supérieure, quelques microbulles ont été générées, ce qui est démontré par l’apparition de mouchetures brillantes.Plus de microbulles ont été générées à mesure que la pression augmentait. Il est important de se rappeler que la température de condensation ici est optimisée pour cette formulation spécifique de coquille de gouttelettes. Différentes formulations de coquilles peuvent nécessiter une température différente.

Research

JoVE Journal

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