Name: synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets
Uploaded: 2021-10-15T14:10:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Brandon Helfield für die Unterstützung beim Bau des Gasaustauschers und Dr. Miffy Hok Yan Cheng für technische Diskussionen. Die Autoren danken den folgenden Finanzierungsquellen: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute und Princess Margaret Cancer Foundation.

<ol>
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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Ultraschallbildgebung ist eine nicht-invasive, nichtionisierende Form der medizinischen Bildgebung, die akustische Wellen nutzt. Während Ultraschallgeräte tragbarer sind und Echtzeitbilder liefern können, kann die Ultraschallbildgebung unter einem geringen Kontrast leiden, was es für Sonographen schwierig macht, ähnlich echogene pathologische Merkmale zuverlässig zu unterscheiden. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, können Mikroblasen in den Wirt injiziert werden, um den Gefäßkontrast zu verbessern. Mikroblasen sind mikrometergroße gasgefüllte Kontrastmittel, die sehr echogen zu akustischen Wellen sind und einen verbesserten Gefäßkontrast1,2bieten können. Die Schalen und Gaskerne von Mikroblasen können für verschiedene Anwendungen wie Bildgebung, Thrombolyse, Zellmembranpermeabilisierung oder transiente Gefäßöffnung angepasst werden2.
Ein Nachteil von Mikroblasen ist ihre kurze Zirkulationshalbwertszeiten. Zum Beispiel haben klinisch verfügbare Perflutren-Lipid-Mikrosphären nur eine Halbwertszeit von 1,3 Minuten3. Für lange Bildgebungssitzungen sind mehrere Injektionen von Mikroblasen erforderlich. Ein weiterer Nachteil von Mikroblasen sind ihre großen Durchmesser. Während Perflutren-Lipid-Mikrosphären etwa 1 bis 3 μm Durchmesser haben, klein genug, um in Gefäßen zu zirkulieren, sind sie zu groß, um zu extravasieren und sich passiv in interessanten Geweben wie Tumorenanzusammeln 4. Eine Strategie, um diese Einschränkungen zu überwinden, besteht darin, die Gaskern-Mikroblasen zu kleineren Flüssigkerntröpfchen zu kondensieren5,6. Während Tröpfchen in ihrem flüssigen Zustand nicht echogen sind, können sie bei Ultraschall mit ausreichend hohem Spitzenunterdruck zu Mikroblasen verdampft werden, wodurch ihre Fähigkeit, Kontrast zu liefern, wiedererlangt wird. Dies ermöglicht es dem Tröpfchen, die günstigere Pharmakokinetik eines kleinen Flüssigkeitskerns zu nutzen, während die Fähigkeit erhalten bleibt, Kontrast zu liefern, wenn er insoniert ist und ohne die chemische Zusammensetzung zu verändern4,7.
Decafluorbutan ist eine ideale Perfluorkohlenstoffverbindung zur Phasenverschiebung zwischen gasförmigen und flüssigenZuständen5,6,7. Decafluorbutan ermöglicht die Kondensation von Mikroblasen zu Tröpfchen mit Temperaturreduktion allein, während weniger dichte Perfluorkohlenwasserstoffe eine zusätzliche Druckbeauftauung erfordern5. Dieses schonende Verfahren minimiert die Zerstörung von Blasen während der Kondensation7,8,9. Da ihre Kerne flüssig sind, sind Tröpfchen nicht echogen und für Ultraschall unsichtbar. Bei Anwendung ausreichender akustischer oder thermischer Energie können die Flüssigkeitskerne jedoch wieder in einen gasförmigen Zustand verdampfen und echogene Mikroblasen erzeugen8. Diese Verdampfung ermöglicht die Kontrolle darüber, wann und wo Mikroblasen erzeugt werden sollen.
Während Tröpfchen für die passive Akkumulation, In-situ-Verdampfung oder Verbesserung der Zellpermeabilität4nützlich sind, können Tröpfchen (und ihre Fragmente) ex vivonicht abgebildet oder quantifiziert werden. Daher werden quantifizierbare Begleitdiagnostika, wie fluoreszierende4,10,11,magnetische Partikel12,optisch absorbierende Mittel13,als Analogon verwendet, um die Tröpfchenabgabe an gewebe von Interesse zu messen. Zum Beispiel verwendeten Helfield et al. eine Co-Injektion von fluoreszierenden Nanoperlen zur histologischen Bildquantifizierung von Mausorganen, da Tröpfchen nicht fluoreszierend nachgewiesen werden konnten4. Der Nachteil von Begleitdiagnostika besteht darin, dass die verfolgbare Komponente abhängig von ihrem individuellen pharmakokinetischen Profil unabhängig vom Tröpfchen wirken kann.
Glücklicherweise kann die Hülle aus Mikroblasen und Tröpfchen angepasst werden. Zum Beispiel demonstrierten Huynh et al. Ultraschallkontrastmittel mit Porphyrin-Lipid-Schalen, wodurch multimodale Mikroblasen erzeugt wurden14. Porphyrine sind eine Klasse organischer Verbindungen mit einer aromatischen Makrozyllstruktur14,15. Sie sind optisch absorbierend, fluoreszierend und können zu einer Vielzahl von Metallen für die Strahlentherapie, radionuklidbasierte Bildgebung oder spurenmetallbasierte Quantifizierung chelatisiert werden14. Ein Beispiel für Porphyrin ist Pyropheophorbid (Pyro). Durch die Konjugation von Pyro auf Lipide und die Einarbeitung von Pyro-Lipiden in Mikroblasen oder Tröpfchen können sie durch mehrere Modalitäten abgebildet und verfolgt werden: akustisch, fluoreszierend und durch Absorption14. Dieses multimodale Kontrastmittel könnte verwendet werden, um die Akkumulation zu verfolgen und zu quantifizieren. Dies könnte die Notwendigkeit von Begleitdiagnostika eliminieren, da die quantifizierbare Komponente jetzt auf die Schale konjugiert ist, was eine genauere Lieferquantifizierung ermöglicht16.
Hierin wird ein Protokoll zur Erstellung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen beschrieben. Da Ultraschallkontrastmittel als Plattform für die Verabreichung von Medikamenten an interessante Gewebe wie Tumore2,4verwendet werden können, könnte sich die Erweiterung ihrer Nachweisbarkeit über den Ultraschall hinaus als nützlich für die Quantifizierung der Wirksamkeit der Verabreichung erweisen. Der Zweck dieser Tröpfchen besteht darin, verfolgbare Ultraschallkontrastmittel bereitzustellen, die in der Lage sind, passive Akkumulation in vivo, In-situ-Verdampfung und Akustik zu erzeugen und die Bioverteilung oder Akkumulation von Ex-vivo-Organen zu quantifizieren, ohne auf sekundäre Sensoren angewiesen zu sein. Charakterisierungsmethoden werden auch beschrieben, um das Potenzial von Porphyrintröpfchen als Bioverteilungssensoren aufzuzeigen. Die Auswirkungen der Pyro-Lipid-Belastung in der Schale (0% bis 50% durch molares Verhältnis) werden ebenfalls diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt)</td>
			<td >Avanti Polar Lipids</td>
			<td >880220</td>
			<td >Also known as &#34;DSPE-PEG5K&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td >Avanti Polar Lipids</td>
			<td >855775</td>
			<td>Also known as &#34;DSPC&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Seals, Tear-Off</td>
			<td >VWR</td>
			<td >16171-840</td>
			<td>Standard Aluminum, 13 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath Sonicator</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of&#160; sonicating and heating up to 70 &#176;C,</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Stor Screw Cap Vials</td>
			<td >National Scientific</td>
			<td >BS20NABP</td>
			<td>Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilicate glass clear serum vials</td>
			<td >VWR</td>
			<td >16171-285</td>
			<td>3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap</td>
			<td >VWR</td>
			<td >66011-020</td>
			<td>1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform&#160;</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coulter Counter Elctrolyte Diluent</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Compatible with Coulter Counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decafluorobutane (C4F10)</td>
			<td >FluoroMed</td>
			<td >355-25-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deionized Water</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dry Ice (Carbon Dioxide)</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of temperature control</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E-Z Crimper, 13 mm</td>
			<td >Wheaton</td>
			<td >W225302</td>
			<td>13 mm Standard Aluminum Seals</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E-Z Decapper, 13 mm</td>
			<td >Wheaton</td>
			<td >W225352</td>
			<td>13 mm Standard Aluminum Seals</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescent Spectrophotometer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are&#160; optical windows&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gas Exchanger</td>
			<td >Made in-house</td>
			<td ></td>
			<td>Refer to Supplementary Information - &#34;Other Protocols and Data&#34; for assembly instructions.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass syringes</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GLWR Custom Aperture Tube 10 um</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >B42812</td>
			<td>10 &#181;m aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulated Styrofaom containers with lids</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lyophilization-Style Rubber Stoppers</td>
			<td >VWR</td>
			<td >71000-060</td>
			<td>7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Membrane Diaphram Vacuum Pump</td>
			<td >Sartorius Stedim</td>
			<td >16694-1-60-06</td>
			<td>Adjustable pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metal Tongs</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer</td>
			<td >VisualSonics</td>
			<td ></td>
			<td>21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiSizer 4e</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of sizing from 0.2&#181;m to 6 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >567-0010</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1&#956;m pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles, Conventional</td>
			<td >BD</td>
			<td >305176</td>
			<td>20 gauge, 1.5 inch length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nitrogen Gas</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Called &#34;wax film&#34; in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>1X, 7.4 pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette Tips</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Syringes</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polyethersulfone (PES) Membrane Filter</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>0.2 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Propylene Glycol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td >Made in-house</td>
			<td ></td>
			<td>Also known as &#34;Pyro-SPC&#34;. Refer to &#34;Supplementary Information - Other Protocols and Data&#34; for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermometer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>(-20 to 100 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Also known as &#34;2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure Water</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Type 1 Purity</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultraviolet&#8211;Visible (UV-Vis) Spectrophotometer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultraviolet&#8211;Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacuum Desiccator</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform</td>
			<td >VisualSonics</td>
			<td ></td>
			<td>Pre-clinical ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vialmix</td>
			<td >Bristol-Myers-Squibb</td>
			<td ></td>
			<td>Called &#34;mechanical agitator&#34; in the protocol. Agitates for 45 s.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex Mixer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets

Phasenwechseltröpfchen sind eine Klasse von Ultraschallkontrastmitteln, die sich bei Anwendung ausreichender akustischer Energie in echogene Mikroblasen in situ umwandeln können. Tröpfchen sind kleiner und stabiler als ihre Mikroblasen-Gegenstücke. Herkömmliche Ultraschallkontrastmittel sind jedoch nicht über akustische Rückkopplungsmessungen hinaus verfolgbar, was die Quantifizierung der Bioverteilung oder Akkumulation von Kontrastmitteln ex vivo erschwert. Forscher müssen sich möglicherweise auf fluoreszierende oder optisch absorbierende diagnostische Begleitpartikel verlassen, um auf die Bioverteilung zu schließen. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Schritte zur Erstellung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen mit einer Kondensationsmethode detailliert zu beschreiben. Porphyrine sind fluoreszierende Moleküle mit unterschiedlichen Absorptionsbändern, die auf Lipide konjugiert und in Tröpfchen eingebaut werden können, um die Vielseitigkeit der Tröpfchen zu erweitern und eine robustere Bioverteilung zu ermöglichen und gleichzeitig die akustischen Eigenschaften beizubehalten. Sieben Formulierungen mit unterschiedlichen Porphyrin-Lipid- und Basenlipidgehalten wurden hergestellt, um Mikroblasen- und Tröpfchengrößenverteilungen zu untersuchen. Charakterisierungen, die für porphyrinhaltige Strukturen geeignet sind, werden ebenfalls im Protokoll beschrieben, um ihre analytische Vielseitigkeit in lösungshaltig zu demonstrieren. Die Dimensionierung zeigte, dass die nachkondensierten mittleren Durchmesser 1,72 bis 2,38 Mal kleiner waren als die Vorläuferpopulationen. Die Absorptionscharakterisierung zeigte, dass intakte Baugruppen einen Q-Band-Peak von 700 nm aufwiesen, während gestörte Proben einen Absorptionspeak bei 671 nm aufwiesen. Die Fluoreszenzcharakterisierung zeigte, dass intakte 30% Porphyrin-Lipid-Anordnungen fluoreszierend abgeschreckt wurden (>97%), wobei die Fluoreszenzrückgewinnung bei Störung erreicht wurde. Die akustische Verdampfung zeigte, dass Porphyrintröpfchen bei niedrigeren Drücken nicht echogen waren und bei ausreichenden Drücken in echogene Mikroblasen umgewandelt werden konnten. Diese Charakterisierungen zeigen das Potenzial für Porphyrintröpfchen, die Notwendigkeit von Absorptions- oder fluoreszenzbasierten begleitenden diagnostischen Strategien zur Quantifizierung der Bioverteilung von Ultraschallkontrastmitteln für die Verabreichung oder therapeutische Anwendungen in vivo oder ex vivozu eliminieren.

Vorkondensierte, größensele selected Microbubble-Proben (n = 3) und postkondensierte Tröpfchenproben ( n = 3)wurden auf einem Coulter Counter (CC) mit einer 10 μm-Öffnung dimensioniert. Eine Einschränkung der 10 μm-Öffnung besteht darin, dass partikel kleiner als 200 nm nicht gemessen werden können, was die mittlere Größe und Konzentration verzerren kann. Abbildung 4 zeigt die Größendaten für jede der Formulierungen mit Pyrolipidgehalt. Tabelle 1 zeigt Statistiken basierend auf den Größendaten. Unter Verwendung eines Verhältnisses von vor- und nachkondensierten mittleren Durchmessern zeigten die Ergebnisse, dass die 0% Pyro-Lipid-Formulierung mit 1,72 ± 0,02 die kleinste mittlere Durchmesserverschiebung aufwies. Die 50% Pyro-Lipid-Formulierung hatte mit 2,38 ± 0,08 den größten mittleren Durchmesser. Die 1%ige Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe hatte die höchste beobachtete Konzentration bei (2,71 ± 0,13) × 1010 /ml, während die 40%ige Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe die niedrigste beobachtete Konzentration bei (7,36 ± 0,81) × 109 /ml aufweist. Größendaten zeigten, dass die 10% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe mit 261 ± 13 nm das kleinste Peakdimeter hatte, während die 50% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe mit 390 ± 55 nm die größte hatte. Im Allgemeinen nahm mit zunehmendem Pyro-Lipidgehalt die Konzentration ab und der mittlere Durchmesser nahm zu. Da die nachkondensierten Proben auf der Vorläufer-Mikroblasenprobe basieren, trat der Trend für beide Arten von Ultraschallkontrastmitteln auf. Als der Pyro-Lipidgehalt zunahm, begann sich eine Mikroblasen-Subpopulation (mit einer Spitzengröße von etwa 2000 μm) zu bilden. Dieser sekundäre Peak war in der 0% Pyro-Lipid-Mikroblasenprobe nicht vorhanden und am deutlichsten in den 40% und 50% Pyro-Lipid-Populationen.
Abbildung 5 zeigt repräsentative Absorptionsmessungen der 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe. Der Peak der intakten Probe in PBS betrug 700 nm, während die gestörte Probe in Triton den Peak auf 671 nm verschob. Dabei zeigte sich, dass die intakten Baugruppen im Vergleich zu den einzelnen, unmontierten Lipidkomponenten unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen.
Abbildung 6A zeigt repräsentative Fluoreszenzmessungen der vorkondensierten Mikroblasenprobe, während Abbildung 6B eine nachkondensierte Tröpfchenprobe mit 30% Pyrolipid zeigt. Die intakte Probe in PBS hatte einen Fluoreszenzpeak bei 704 nm, während die gestörte Form einen Peak bei 674 nm aufweist. Subtrahiert man den gestörten Bereich unter der Kurve mit dem intakten Bereich unter der Kurve und dividiert man die Differenz durch den gestörten Bereich unter der Kurve, ergibt sich die Quenching-Effizienz, die für die 30% Pyro-Lipid-Mikroblasenprobe bzw. Tröpfchenprobe 98,61% bzw. 98,07% beträgt.
Um zu demonstrieren, dass Tröpfchen in Mikroblasen umgewandelt werden, wurden verdünnte Tröpfchen abgebildet und in einem 37 °C Strömungsphantom mit einem Ultraschallsystem verdampft. Abbildung 7 zeigt repräsentative Ultraschallbilder der 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe, die bei unterschiedlichen Drücken aufgenommen wurde. Bei niedrigen Drücken (Abbildung 7A) gab es sehr wenig Signal, nur Hintergrundsignal von Luftblasen, die von der Agarsynthese klebten. Dies liegt daran, dass Tröpfchen nicht echogen sind und keinen Ultraschall streuen. Bei einer etwas hohen Leistung wurden einige Mikroblasen erzeugt (Abbildung 7B), wie das Auftreten von hellen Flecken zeigt. Mit zunehmendem Druck wurden mehr Mikroblasen erzeugt (Abbildung 7C und 7D). Dabei zeigte sich auch, dass die Tröpfchen bei 37 °C nicht spontan verdampfen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Bilder der Schritte zur Bildung der 30% igen Pyrolipidlösung. A)Lipidpulver plus Pyro-SPC in Chloroform. B) Lösung zum Auflösen hinzugefügt. C)Lipidfilm getrocknet und auf die Innenwand der Durchstechflasche beschichtet. D)Lipid-Durchstechflasche mit Aluminiumfolie umwickelt (Außenfolie zur Wiederverwendung geklebt). E)Hydratisierte Lipidlösung. F)Lipidlösung in Serumfläschchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Der Gasaustauscher mit 10 Verteilern. Die Ventile, auf die im Protokoll verwiesen wird, sind beschriftet. Anweisungen zum Zusammenbau des Gasaustauschers finden Sie in der Zusatzdatei "Andere Protokolle und Daten". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig03.jpg"> Abbildung 3: A) Die Lipidlösungen der 7 Formulierungen (0% bis 50% Pyro-SPC) in Probenfläschchen. Die Abbildungen B bis D zeigen Bilder der Schritte, die unternommen wurden, um 30% Pyro-Lipid-Tröpfchen herzustellen. B)30% ige Pyro-Lipid-Lösung in einer Probendurchstechflasche. C) Nach der Agitation. D) 15 min Größe ausgewählt. E) Untere Trennwand auf Decafluorbutan-Durchstechflasche übertragen. D) Nachkondensation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig04.jpg"> Abbildung 4: Coulter Counter (CC) Größendaten der von der Größe ausgewählten Mikroblasen- und Tröpfchenproben mit unterschiedlichem Pyrolipidschalengehalt(n = 3). Die durchgezogenen grünen Linien stellen Mikroblasen und die gepunkteten Cyanlinien Tröpfchen dar. A) 0% Pyro-SPC. B)1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D)20% Pyro-SPC. E)30% Pyro-SPC. F)40% Pyro-SPC. G)50% Pyro-SPC. H)Die insgesamt beobachteten Konzentrationen von Mikroblasen- und Tröpfchenproben aus dem CC basierend auf dem Pyro-SPC-Gehalt in der Schale. Alle Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Alle Messungen wurden mit einer 10 μm Apertur durchgeführt, die einen Größenbereich von 200 nm bis 6000 nm aufweist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektroskopie-Absorptionsmessungen von 300 bis 800 nm der nachkondensierten 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe, verdünnt in PBS und in 1% Triton. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig06.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Fluoreszenzemission von 600 bis 750 nm angeregt bei 410 nm. A)Größengewählte, vorkondensierte 30% Pyro-Lipid-Mikroblasenprobe in PBS und in 1% Triton. B)Nachkondensierte 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe in PBS und in 1% Triton. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig07.jpg"> Abbildung 7: Repräsentative Ultraschallbilder eines 37 °C Agar-Strömungsphantoms, aufgenommen mit einem präklinischen 21-MHz-Linear-Array-Wandler im B-Modus (siehe Materialtabelle). Die linke Spalte (Abbildungen A, C, E, & G) zeigt PBS-Steuerelemente. Die rechte Spalte (Abbildungen B, D, F, & H) zeigt 20 μL nachkondensierte 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe, verdünnt in 50 ml 37 °C PBS. Jede Zeile repräsentiert Freifeld-Spitzennegpressumdrücke, die aus der Arbeit von Sheeran et al. geschätzt wurden8 Die gelben Dreiecke zeigen die Fokustiefe an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Methode</td>
			<td>Agent</td>
			<td>Pyro Schale %</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>30</td>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Blasen</td>
			<td>Konz. [/mL]</td>
			<td>(2,76 ± 0,28) × 10^10</td>
			<td>(3.04 ± 0.15) × 10^10</td>
			<td>(2.02 ± 0.11) × 10^10</td>
			<td>(1,91 ± 0,22) × 10^10</td>
			<td>(1.47 ± 0.05) × 10^10</td>
			<td>(8,47 ± 0,95) × 10^9</td>
			<td>(9.89 ± 0.15) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Blasen</td>
			<td>Peak [nm]</td>
			<td>329 ± 6</td>
			<td>297 ± 15</td>
			<td>305 ± 21</td>
			<td>273 ± 14</td>
			<td>310 ± 40</td>
			<td>266 ± 33</td>
			<td>393 ± 89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Blasen</td>
			<td>Mittelwert [nm]</td>
			<td>609 ± 2</td>
			<td>603 ± 15</td>
			<td>635 ± 6</td>
			<td>690 ± 8</td>
			<td>812 ± 1</td>
			<td>935 ± 22</td>
			<td>950 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Blasen</td>
			<td>Median [nm]</td>
			<td>450 ± 6</td>
			<td>421 ± 6</td>
			<td>414 ± 6</td>
			<td>432 ± 5</td>
			<td>490 ± 2</td>
			<td>596 ± 37</td>
			<td>695 ± 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Tröpfchen</td>
			<td>Konz. [/mL]</td>
			<td>(2.18 ± 0.07) × 10^10</td>
			<td>(2.71 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.75 ± 0.18) × 10^10</td>
			<td>(1,72 ± 0,13) × 10^10</td>
			<td>(1.09 ± 0.01) × 10^10</td>
			<td>(7.36 ± 0.81) × 10^9</td>
			<td>(7.38 ± 0.28) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Tröpfchen</td>
			<td>Peak [nm]</td>
			<td>292 ± 0</td>
			<td>297 ± 17</td>
			<td>261 ± 13</td>
			<td>280 ± 9</td>
			<td>268 ± 17</td>
			<td>287 ± 38</td>
			<td>390 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Tröpfchen</td>
			<td>Mittelwert [nm]</td>
			<td>353 ± 5</td>
			<td>350 ± 5</td>
			<td>347 ± 1</td>
			<td>347 ± 4</td>
			<td>397 ± 1</td>
			<td>399 ± 6</td>
			<td>400 ± 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Tröpfchen</td>
			<td>Median [nm]</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>310 ± 1</td>
			<td>315 ± 2</td>
			<td>340 ± 0</td>
			<td>367 ± 5</td>
			<td>370 ± 9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Größendatenstatistik der Mikroblasen- und Tröpfchenproben mit unterschiedlichem Pyro-SPC-Gehalt von Coulter Counter (CC) (n = 3). Alle Fehler weisen auf eine Standardabweichung hin.
Ergänzende Informationen - Lipid Formula Sheet: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Lipid%20Formula%20Sheet.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Informationen - Andere Protokolle und Daten: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Other%20Protocols%20and%20Data.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets

In diesem Protokoll werden Methoden zur Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen beschrieben.

Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen

Phase-change droplets are a class of ultrasound contrast agents that can convert into echogenic microbubbles in situ with the application of sufficient ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es das vollständige Verfahren zur Herstellung von Tröpfchen aus dem Lipidfilm über die Lipidlösung bis hin zu Mikroblasen und dann zu Tröpfchen bietet. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Einfachheit der Kondensation von Mikroblasen zu Tröpfchen. Allein durch Abkühlen und Verwirbeln können Tröpfchen ohne Druckbeaufdruckung hergestellt werden.Eine visuelle Demonstration ist wichtig, da ein einfacher Test, um zu sehen, ob die Mikroblasen erfolgreich kondensiert wurden, darin besteht, die Änderung der Transluzenz visuell zu überprüfen. Kimoon Yoo, ein Masterstudent im Gang Zheng Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Entfernen Sie mit einem Decapper die Aluminiumdichtung auf der Serumdurchstechflasche und übertragen Sie einen Milliliter der Lipidlösung auf eine 1,85-Milliliter-Borosilikatglas-Probendurchstechflasche mit einem Phenol-Schraubverschluss, indem Sie die Lipidlösung die Innenwand hinunterfließen lassen, ohne Blasen zu erzeugen.Mit der 1,85 Milliliter Probenfläschchen können Sie sich darauf vorbereiten, mit dem Gasaustauscher Dekafluorbutangas in den Kopfraum der Probenfläschchen zu fließen. Stellen Sie sicher, dass alle Ventile am Gastauscher ordnungsgemäß geschlossen und die Pumpe ausgeschaltet ist. Öffnen Sie das Verteilerventil und entfernen Sie vorsichtig die entsprechende Nadel aus dem Verteiler.Öffnen Sie Druckventil A und Druckventil B und drehen Sie das Gasflaschenventil ca. 1/16 bis 1/8 gegen den Uhrzeigersinn, um es teilweise zu öffnen. Öffnen Sie das T-Griffventil und entkappen Sie die Probenfläschchen mit der Lipidlösung. Legen Sie die Verteilernadel über die Flüssigkeitsluftschnittstelle der Durchstechflasche, drehen Sie das Luftreglerventil langsam im Uhrzeigersinn, bis sich die Luftreglernadel leicht aus ihrer Ruheposition bewegt, und lassen Sie das Perfluorkohlenstoffgas 30 Sekunden lang sanft in den Kopfraum der Durchstechflasche fließen, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen.Stellen Sie bei Bedarf das Luftreglerventil ein. Nach 30 Sekunden die Probenfläschchen sorgfältig und schnell aufbewahrt, ohne die Durchstechflasche zu sehr zu bewegen. Sowohl das Gasflaschenventil, das T-Griffventil, das Luftreglerventil, das Druckventil A, das Druckventil B und das Verteilerventil.Ummanteln Sie die Nadel vorsichtig, beschriften Sie dann die Probenfläschchen und versiegeln Sie den Hals mit Wachsfolie im Uhrzeigersinn. Lagern Sie die Probenfläschchen im Dunkeln und bei vier Grad Celsius für mindestens 10 Minuten oder bis zu 24 Stunden. Legen Sie etwa 100 Gramm Trockeneis in einen isolierten Behälter und legen Sie normales Eis in einen anderen isolierten Behälter.Holen Sie sich eine zuvor vorbereitete Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche auf 1,5-Zoll-20-Gauge-Nadeln, eine Ein-Milliliter-Kunststoffspritze, einen 200-Milliliter-Behälter, eine Metallzange und ein Thermometer. Legen Sie die Probendurchstechflasche mit der Lipidlösung in das mechanische Rührwerk und rühren Sie 45 Sekunden lang. Es sollte eine Veränderung der Farbe und Transluzenz geben.Stellen Sie nach dem mechanischen Rühren die Probendurchstechflasche rechts vor Licht abgeschirmt auf und starten Sie einen 15-minütigen Countdown, um die Durchstechflasche abzukühlen und die Mikroblasen auszuwählen. Wenn der Countdown 10 Minuten erreicht hat, füllen Sie einen Behälter mit etwa 200 Millilitern Isopropanol und kühlen Sie ihn mit einer Metallzange auf minus 20 Grad Celsius mit Trockeneis ab. Nachdem die Mikroblasen 15 Minuten lang ausgewählt wurden, suchen Sie in der Beispielfläschchen nach der ausgewählten Partition.Halten Sie die Probendurchstechflasche rechts oben, entkappen Sie die Probendurchstechflasche vorsichtig und ziehen Sie etwa 0,7 Milliliter der unteren Trennwand mit einer 1,5 Zoll 20-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Kunststoffspritze befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass keine der oberen Trennwände zurückgezogen ist, und bewegen Sie die Spritze nicht, um Lufteinschlüsse zu entfernen. Wenn Sie auf den Mittelkreis des Gummistopfens zielen, führen Sie eine andere 20-Gauge-Nadel in eine Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche ein, während Sie die Nadel in der Nähe der Oberseite der Serumdurchstechflasche halten, um sie zu entlüften, und führen Sie dann die Nadel mit den ausgewählten Mikroblasen ein.Übertragen Sie langsam die Größe der ausgewählten Mikroblasen. Lassen Sie die Flüssigkeit vorsichtig die Innenwand der Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche hinuntergleiten. Sobald die gesamte ausgewählte Mikroblasenlösung übertragen wurde, entfernen Sie die Nadel mit der Spritze, aber lassen Sie die Entlüftungsnadel drin, um den Unterdruck zu lindern.Fügen Sie dem Isopropanolbad kleine Mengen Trockeneis oder Isopropanol bei Raumtemperatur hinzu, um sicherzustellen, dass die Badtemperatur zwischen minus 15 und minus 17 Grad Celsius liegt. Mit der 20-Gauge-Entlüftungsnadel, die in der Nähe der Oberseite der Serumdurchstechflasche eingeführt wurde, legen Sie die Serumfläschchen und das Isopropanolbad, wobei die Mikroblase unter dem Niveau des Isopropanols gehalten wird, aber der Fläschchenhals darüber und intermittierend die Serumfläschchen für zwei Minuten verwirbelt, um die Mikroblasen zu kondensieren. Schwenken Sie die Serumfläschchen nicht kontinuierlich im Isopropanol und lassen Sie die Lösung nicht einfrieren.Etwa fünf Sekunden schwenken und die Serumfläschchen aus dem Isopropanol heben. Überprüfen Sie die Eiskeimbildung und setzen Sie dann das Wirbeln in Isopropanol fort. Wenn sich Eisbildung abnäht, schwenken Sie die Serumfläschchen in der Luft, bis sie sich auflöst.Nach der zweiminütigen Kondensation die Serumfläschchen aus dem Isopropanolbad entfernen und die Entlüftungsnadel entfernen. Die Mikroblasen sollten zu Tröpfchen kondensiert sein, wie die Änderung der Transluzenz zeigt. Wischen Sie die Serumdurchstechflasche ab, beschriften Sie sie und legen Sie sie auf normales Eis in einen dunklen isolierten Behälter, bis sie einsatzbereit ist.Ungeöffnete Tröpfchen mit intakter Aluminiumdichtung sollten bis zu sechs Stunden stabil sein, solange das geschmolzene Eis bei Bedarf ausgetauscht wird. Wenn Sie gebrauchsfertig sind, entfernen Sie die Aluminiumdichtung mit dem Decapper. Nach der Verwendung dieses Protokolls wurden vorkondensierte, größengewählte Mikroblasen und nachkondensierte Tröpfchen auf einem Coulter-Zähler mit einer 10-Mikron-Öffnung dimensioniert.Die Größendaten für die 30%ige Pyrolipidformulierung werden gezeigt. Die Statistiken, die auf den Größendaten basieren, werden hier angezeigt. Unter Verwendung eines Verhältnisses von vor- und nachkondensierten mittleren Durchmessern zeigten die Ergebnisse, dass mit zunehmendem Pyrolipidgehalt die Konzentration abnahm und der mittlere Durchmesser zunahm.Die repräsentativen Absorptionsmittelmessungen der 30%igen Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe werden gezeigt. Dabei zeigte sich, dass die intakten Baugruppen im Vergleich zu den einzelnen unmontierten Lipidkomponenten unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen, die sich in unterschiedlichen Peaks widerspiegeln. Repräsentative Blütenstandsmessungen der vorkondensierten Mikroblasen-, postkondensierten Tröpfchenprobe mit 30% Pyrolipid werden hier gezeigt und zeigen unterschiedliche Fluoreszenzpeaks für intakte Proben in der gestörten Form.Es werden repräsentative Ultraschallbilder der 30%igen Pyro-Lipid-Tröpfchen-Probe gezeigt, die bei unterschiedlichen Drücken abgebildet wurden. Bei niedrigen Drücken wurde nur ein Hintergrundsignal von Luftblasen beobachtet, die von der Agarsynthese festhielten. Bei einer etwas höheren Leistung wurden einige Mikroblasen erzeugt, was durch das Auftreten von hellen Flecken demonstriert wird.Mit zunehmendem Druck wurden mehr Mikroblasen erzeugt. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Kondensationstemperatur hier für diese spezifische Tröpfchenschalenformulierung optimiert ist. Unterschiedliche Schalenformulierungen können eine andere Temperatur erfordern.

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Forschung

Medizin

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

A Multi-Modal Approach to Assessing Recovery in Youth Athletes Following Concussion

Ein Multi-Modal Ansatz zur Bewertung Rettung in der Jugend Athleten Nach Gehirnerschütterung

Concussion is one of the most commonly reported injuries amongst children and youth involved in sport participation. Following a concussion, youth can ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Aufbau und Charakterisierung von UTI und CAUTI in einem Mausmodell

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Synthese, Charakterisierung und Anwendung von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanosonden zur Erkennung von extrapulmonaler Tuberkulose

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Multi-Modal Home Sleep Monitoring in Older Adults

Multimodale Haus Schlaf Überwachung bei älteren Erwachsenen

The gold standard for sleep monitoring is attended in-lab polysomnography; however, this method may be cost-prohibitive and inconvenient for patients and ...

Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice

Bewertung und Charakterisierung von Hyaloidgefäßen bei Mäusen

In the eye, the embryonic hyaloid vessels nourish the developing lens and retina and regress when the retinal vessels develop. Persistent or failed ...