Name: synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets
Uploaded: 2021-10-15T14:10:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Brandon Helfield per aver contribuito a costruire lo scambiatore di gas e il Dr. Miffy Hok Yan Cheng per le discussioni tecniche. Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute e Princess Margaret Cancer Foundation.

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+monolayer+collapse+and+microbubble+stability.">Lipid monolayer collapse and microbubble stability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).</li><li>Overchuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtherapeutic+Photodynamic+Treatment+Facilitates+Tumor+Nanomedicine+Delivery+and+Overcomes+Desmoplasia.">Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia.</a> Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).</li><li>Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation.">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li><li>Paproski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin+nanodroplets:+Sub-micrometer+ultrasound+and+photoacoustic+contrast+imaging+agents.">Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents.</a> Small. 12 (3), 371-380 (2016).</li><li>Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+the+local+and+targeted+delivery+of+osteoarthritis+drugs.">Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs.</a> Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).</li><li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy:+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs.">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'imaging ad ultrasuoni è una forma non invasiva e non ionizzante di imaging medico che utilizza onde acustiche. Mentre gli scanner ad ultrasuoni sono più portatili e possono fornire immagini in tempo reale, l'imaging a ultrasuoni può soffrire di basso contrasto, rendendo difficile per gli ecografisti distinguere in modo affidabile caratteristiche patologiche ecogeniche simili. Per contrastare questa limitazione, le microbolle possono essere iniettate nell'ospite per migliorare il contrasto vascolare. Le microbolle sono agenti di contrasto riempiti di gas di dimensioni micron che sono altamente ecogenici alle onde acustiche e possono fornire un contrasto maggiore del vaso1,2. I gusci e i nuclei di gas delle microbolle possono essere personalizzati per diverse applicazioni, come l'imaging, la trombolisi, la permeabilizzazione della membrana cellulare o l'apertura vascolare transitoria2.
Uno svantaggio delle microbolle è la loro breve emivita di circolazione. Ad esempio, le microsfere lipidiche perflutren clinicamente disponibili hanno solo un'emivita di 1,3 minuti3. Per lunghe sessioni di imaging, sono necessarie iniezioni multiple di microbolle. Un altro inconveniente delle microbolle sono i loro grandi diametri. Mentre le microsfere lipidiche perflutren hanno un diametro compreso tra 1 e 3 μm, abbastanza piccole da circolare in vascolarizzazione, sono troppo grandi per essere stravasate e si accumulano passivamente nei tessuti di interesse, come i tumori4. Una strategia per superare queste limitazioni è quella di condensare le microbolle gas-core in goccioline più piccole, liquid-core5,6. Mentre le goccioline non sono ecogeniche nel loro stato liquido, possono essere vaporizzate in microbolle dopo l'esposizione agli ultrasuoni con una pressione negativa di picco sufficientemente elevata, riacquistando la loro capacità di fornire contrasto. Ciò consente alla goccia di sfruttare la farmacocinetica più favorevole di un piccolo nucleo liquido, pur mantenendo la capacità di fornire contrasto quando insonata e senza modificare la composizione chimica4,7.
Il decafluorobutano è un composto perfluorocarburo ideale per lo sfasare tra gli stati gassoso e liquido5,6,7. Il decafluorobutano consente la condensazione delle microbolle in goccioline con la sola riduzione della temperatura, mentre i perfluorocarburi meno densi richiedono una pressurizzazione aggiuntiva5. Questo metodo delicato riduce al minimo la distruzione delle bolle durante la condensazione7,8,9. Poiché i loro nuclei sono liquidi, le goccioline non sono ecogeniche e invisibili agli ultrasuoni. Tuttavia, con l'applicazione di sufficiente energia acustica o termica, i nuclei liquidi possono vaporizzare di nuovo in uno stato gassoso, generando microbolle ecogeniche8. Questa vaporizzazione consente di controllare quando e dove generare microbolle.
Mentre le goccioline sono utili per l'accumulo passivo, la vaporizzazione in situ o il miglioramento della permeabilità cellulare4, le goccioline (e i loro frammenti) non possono essere immagini o quantificate ex vivo. Pertanto, l'agente diagnostico complementare quantificabile, comefluorescenti 4,10,11, particelle magnetiche12, agenti otticamente assorbenti13, sono utilizzati come analogo per misurare la consegna di goccioline ai tessuti di interesse. Ad esempio, Helfield et al. hanno utilizzato una co-iniezione di nano-perline fluorescenti per la quantificazione delle immagini istologiche degli organi di topo poiché le goccioline non potevano essere rilevate fluorescentemente4. Lo svantaggio degli agenti diagnostici di accompagnamento è che il componente tracciabile può agire indipendentemente dalla goccia a seconda del suo profilo farmacocinetico individuale.
Fortunatamente, il guscio di microbolle e goccioline può essere personalizzato. Ad esempio, Huynh et al. hanno dimostrato agenti di contrasto ad ultrasuoni con gusci di porfirina-lipidi, creando microbolle multimodali14. Le porfirine sono una classe di composti organici a struttura macrocilica aromatica14,15. Sono otticamente assorbenti, fluorescenti e possono essere chelati a un'ampia varietà di metalli per la radioterapia, l'imaging a base di radionuclidi o la quantificazione a base di metalli in traccia14. Un esempio di porfirina è il pirofeoforbide (Pyro). Coniugando Pyro sui lipidi, incorporando Piro-lipidi in microbolle o goccioline consente loro di essere ripresi e tracciati attraverso molteplici modalità: acusticamente, fluorescentemente e attraverso l'assorbanza14. Questo agente di contrasto multimodale potrebbe essere utilizzato per tracciare e quantificare l'accumulo. Ciò potrebbe eliminare la necessità di agenti diagnostici complementari poiché il componente quantificabile è ora coniugato sul guscio, consentendo una quantificazione di consegna più accurata16.
Qui viene delineato un protocollo per la creazione di goccioline di porfirina a cambiamento di fase multimodale. Poiché gli agenti di contrasto ad ultrasuoni possono essere utilizzati come piattaforma per la somministrazione di farmaci ai tessuti di interesse, come i tumori2,4, estendere la loro rilevabilità oltre gli ultrasuoni potrebbe rivelarsi utile per la quantificazione dell'efficacia della consegna. Lo scopo di queste goccioline è quello di fornire agenti di contrasto ad ultrasuoni tracciabili in grado di accumulo passivo in vivo,vaporizzazione in situ e acustica, e con il potenziale di quantificare la biodispertura o l'accumulo da organi ex vivo senza la dipendenza da sensori secondari. I metodi di caratterizzazione sono anche delineati per mostrare il potenziale delle goccioline di porfirina come sensori di biodispressione. Vengono anche discussi gli effetti del carico piro-lipidico nel guscio (da 0% a 50% dal rapporto molare).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt)</td>
			<td >Avanti Polar Lipids</td>
			<td >880220</td>
			<td >Also known as &#34;DSPE-PEG5K&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td >Avanti Polar Lipids</td>
			<td >855775</td>
			<td>Also known as &#34;DSPC&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Seals, Tear-Off</td>
			<td >VWR</td>
			<td >16171-840</td>
			<td>Standard Aluminum, 13 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bath Sonicator</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of&#160; sonicating and heating up to 70 &#176;C,</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Stor Screw Cap Vials</td>
			<td >National Scientific</td>
			<td >BS20NABP</td>
			<td>Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilicate glass clear serum vials</td>
			<td >VWR</td>
			<td >16171-285</td>
			<td>3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap</td>
			<td >VWR</td>
			<td >66011-020</td>
			<td>1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform&#160;</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coulter Counter Elctrolyte Diluent</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Compatible with Coulter Counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decafluorobutane (C4F10)</td>
			<td >FluoroMed</td>
			<td >355-25-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deionized Water</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dry Ice (Carbon Dioxide)</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of temperature control</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E-Z Crimper, 13 mm</td>
			<td >Wheaton</td>
			<td >W225302</td>
			<td>13 mm Standard Aluminum Seals</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E-Z Decapper, 13 mm</td>
			<td >Wheaton</td>
			<td >W225352</td>
			<td>13 mm Standard Aluminum Seals</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescent Spectrophotometer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are&#160; optical windows&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gas Exchanger</td>
			<td >Made in-house</td>
			<td ></td>
			<td>Refer to Supplementary Information - &#34;Other Protocols and Data&#34; for assembly instructions.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass syringes</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GLWR Custom Aperture Tube 10 um</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >B42812</td>
			<td>10 &#181;m aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycerol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulated Styrofaom containers with lids</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lyophilization-Style Rubber Stoppers</td>
			<td >VWR</td>
			<td >71000-060</td>
			<td>7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Membrane Diaphram Vacuum Pump</td>
			<td >Sartorius Stedim</td>
			<td >16694-1-60-06</td>
			<td>Adjustable pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metal Tongs</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer</td>
			<td >VisualSonics</td>
			<td ></td>
			<td>21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MultiSizer 4e</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of sizing from 0.2&#181;m to 6 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >567-0010</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1&#956;m pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles, Conventional</td>
			<td >BD</td>
			<td >305176</td>
			<td>20 gauge, 1.5 inch length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nitrogen Gas</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Called &#34;wax film&#34; in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>1X, 7.4 pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette Tips</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Sizes will depend on desired volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Syringes</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polyethersulfone (PES) Membrane Filter</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>0.2 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Propylene Glycol</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td >Made in-house</td>
			<td ></td>
			<td>Also known as &#34;Pyro-SPC&#34;. Refer to &#34;Supplementary Information - Other Protocols and Data&#34; for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermometer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>(-20 to 100 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Also known as &#34;2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol&#34;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure Water</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Type 1 Purity</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultraviolet&#8211;Visible (UV-Vis) Spectrophotometer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultraviolet&#8211;Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td>Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacuum Desiccator</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform</td>
			<td >VisualSonics</td>
			<td ></td>
			<td>Pre-clinical ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vialmix</td>
			<td >Bristol-Myers-Squibb</td>
			<td ></td>
			<td>Called &#34;mechanical agitator&#34; in the protocol. Agitates for 45 s.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex Mixer</td>
			<td >Any brand</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets

Le goccioline a cambiamento di fase sono una classe di agenti di contrasto ad ultrasuoni che possono convertirsi in microbolle ecogeniche in situ con l'applicazione di energia acustica sufficiente. Le goccioline sono più piccole e più stabili delle loro controparti di microbolle. Tuttavia, i tradizionali agenti di contrasto ad ultrasuoni non sono rintracciabili al di là delle misurazioni di feedback acustico, il che rende difficile quantificare la biodistribuendo o l'accumulo di agenti di contrasto ex vivo. I ricercatori potrebbero dover fare affidamento su particelle diagnostiche di accompagnamento fluorescenti o otticamente assorbenti per dedurre la biodisponimo distribuzione. Lo scopo di questo protocollo è quello di dettagliare i passaggi per la creazione di goccioline di porfirina a cambiamento di fase multimodale utilizzando un metodo di condensazione. Le porfirine sono molecole fluorescenti con bande di assorbanza distinte che possono essere coniugate sui lipidi e incorporate in goccioline per estendere la versatilità delle goccioline, consentendo una biodistribuendozione più robusta pur mantenendo le proprietà acustiche. Sono state fatte sette formulazioni con diversi contenuti di porfirina-lipidi e lipidi di base per studiare le distribuzioni di dimensioni di microbolle e goccioline. Caratterizzazioni adatte a strutture contenenti porfirina sono anche descritte nel protocollo per dimostrare la loro versatilità analitica in soluzione. Il dimensionamento ha mostrato che i diametri medie post-condensati erano da 1,72 a 2,38 volte più piccoli delle popolazioni precursori. La caratterizzazione dell'assorbanza ha mostrato che gli assemblaggi intatti avevano un picco in banda Q di 700 nm, mentre i campioni interrotti avevano un picco di assorbanza a 671 nm. La caratterizzazione della fluorescenza ha mostrato che gli assemblaggi intatti del 30% di porfirina-lipidi erano fluorescenti (>97%), con recupero di fluorescenza ottenuto in caso di interruzione. La vaporizzazione acustica ha mostrato che le goccioline di porfirina non erano ecogeniche a pressioni più basse e potevano essere convertite in microbolle ecogeniche con pressioni sufficienti. Queste caratterizzazioni mostrano il potenziale delle goccioline di porfirina per eliminare la necessità di assorbanza o strategie diagnostiche di accompagnamento basate sulla fluorescenza per quantificare la biodisdistribuzioni di agenti di contrasto ad ultrasuoni per la somministrazione o applicazioni terapeutiche in vivo o ex vivo.

Campioni di microbolle precon condensati e selezionati per dimensioni(n = 3) e campioni di goccioline post-condensate(n = 3) sono stati dimensionati su un contatore Coulter (CC) con un'apertura di 10 μm. Una limitazione dell'apertura di 10 μm è che non può misurare particelle più piccole di 200 nm, il che può distorcere la dimensione media e la concentrazione. La Figura 4 mostra i dati di dimensionamento per ciascuna delle formulazioni con contenuto pirolipidico. La tabella 1 mostra le statistiche basate sui dati di dimensionamento. Utilizzando un rapporto tra diametri medie pre- e post-condensati, i risultati hanno mostrato che la formulazione piro-lipidica allo 0% aveva il più piccolo spostamento medio del diametro a 1,72 ± 0,02. La formulazione piroipidica al 50% aveva il diametro medio maggiore a 2,38 ± 0,08. Il campione di goccioline pirolipidiche all'1% aveva la più alta concentrazione osservata a (2,71 ± 0,13) ×10 10 /mL mentre il campione di goccioline pirolipidiche al 40% aveva la concentrazione più bassa osservata a (7,36 ± 0,81) × 109 /mL. I dati di dimensionamento hanno mostrato che il campione di goccioline piro-lipidiche al 10% aveva il più piccolo dimetro di picco a 261 ± 13 nm, mentre il campione di goccioline piro-lipidiche al 50% aveva il più grande a 390 ± 55 nm. Generalmente, con l'aumentare del contenuto pirolipidico, la concentrazione diminuiva e il diametro medio aumentava. Poiché i campioni post-condensati si basano sul campione di microbolle precursori, la tendenza si è verificata per entrambi i tipi di agenti di contrasto ad ultrasuoni. Con l'aumento del contenuto di piro-lipidi, una sottopopolazione di microbolle (con una dimensione di picco a circa 2000 μm) ha iniziato a formarsi. Questo picco secondario non era presente nel campione di microbolle piro-lipidiche allo 0% e più evidente nelle popolazioni pirolipidiche al 40% e al 50%.
La Figura 5 mostra le misure rappresentative di assorbanza del campione di goccioline pirolipidiche al 30%. Il picco del campione intatto in PBS era di 700 nm mentre il campione interrotto in Tritone ha spostato il picco a 671 nm. Ciò ha dimostrato che gli assemblaggi intatti hanno proprietà ottiche diverse rispetto ai singoli componenti lipidici non assemblati.
La Figura 6A mostra misure rappresentative di fluorescenza del campione di microbolle precon condensate mentre la Figura 6B mostra un campione di goccioline post-condensato con il 30% di pirolipidi. Il campione intatto in PBS aveva un picco di fluorescenza a 704 nm mentre la forma interrotta aveva un picco a 674 nm. Sottraendo l'area interrotta sotto la curva con l'area intatta sotto la curva e dividendo la differenza per l'area interrotta sotto la curva si ottiene l'efficienza di spegnimento, che risulta essere rispettivamente del 98,61% e del 98,07% per il campione di microbolle piro-lipidiche al 30% e il campione di goccioline.
Per dimostrare la conversione delle goccioline in microbolle, le goccioline diluite sono state riprese e vaporizzate in un fantasma di flusso a 37 ° C con un sistema ad ultrasuoni. La Figura 7 mostra immagini ecografiche rappresentative del campione di goccioline pirolipidiche al 30% ripreso a diverse pressioni. A basse pressioni (Figura 7A), c'era pochissimo segnale, solo il segnale di fondo dalle bolle d'aria bloccate dalla sintesi dell'agar. Questo perché le goccioline non sono ecogeniche e non disperdono gli ultrasuoni. Ad una potenza leggermente elevata, sono state generate alcune microbolle (Figura 7B) come mostrato dalla comparsa di macchie luminose. Con l'aumentare della pressione, sono state generate più microbolle (Figura 7C e 7D). Ciò ha anche dimostrato che le goccioline non vaporizzano spontaneamente a 37 °C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig1v2.jpg"> Figura 1: Immagini dei passaggi per formare la soluzione pirolipidica al 30%. A)Polvere lipidica più Pyro-SPC in cloroformio. B)Aggiunta la soluzione di dissoluzione. C)Film lipidico essiccato e rivestito sulla parete interna del flaconcino. D)Flaconcino lipidico avvolto in un foglio di alluminio (foglio esterno nastrato per il riutilizzo). E)Soluzione lipidica idratata. F)Soluzione lipidica in flaconcino sierico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig2v2.jpg"> Figura 2: Lo scambiatore di gas a 10 collettori. Le valvole a cui si fa riferimento nel protocollo sono etichettate. Vedere File supplementare "Altri protocolli e dati" per istruzioni su come assemblare lo scambiatore di gas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig03.jpg"> Figura 3: A) Le soluzioni lipidiche delle 7 formulazioni (da 0% a 50% Pyro-SPC) in flaconcini campione. Le figure da B a D mostrano le immagini dei passi compiuti per produrre il 30% di goccioline piro-lipidiche. B)Soluzione piroipidica al 30% in un flaconcino campione. C)Post-agitazione. D) 15 min taglia selezionata. E) Partizione inferiore trasferita al flaconcino di decafluorobutano. D)Post-condensa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig04.jpg"> Figura 4: Dati di dimensionamento coulter counter (CC) dei campioni di microbolle e goccioline selezionati con diverso contenuto di guscio piro lipidico(n = 3). Le linee verdi solide rappresentano le microbolle e le linee ciano tratteggiate rappresentano le goccioline. A) 0% Piro-SPC. B) 1% Piro-SPC. C)10% Piro-SPC. D)20% Piro-SPC. E) 30% Piro-SPC. F)40% Piro-SPC. G) 50% Piro-SPC. H)Le concentrazioni totali osservate di campioni di microbolle e goccioline dal CC in base al contenuto di Pyro-SPC nel guscio. Tutte le barre di errore indicano la deviazione standard. Tutte le misurazioni sono state eseguite utilizzando un'apertura di 10 μm che ha un intervallo di dimensioni da 200 nm a 6000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig05.jpg"> Figura 5: Misure rappresentative di assorbanza per spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis) da 300 a 800 nm del campione di goccioline pirolipidiche post-condensato al 30% diluito in PBS e in Tritone all'1%. Fare clic qui per <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig05large.jpg" target="_blank">visualizzare una versione più ampia di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig06.jpg"> Figura 6: Emissione rappresentativa di fluorescenza da 600 a 750 nm eccitata a 410 nm. A) Campione di microbolle piroipidiche precon condensato e preconfezionato in PBS e tritone all'1%. B)Campione di goccioline pirolipidiche post-condensate al 30% in PBS e in Tritone all'1%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig07.jpg"> Figura 7: Immagini ecografiche rappresentative di un fantasma di flusso di agar a 37 °C prelevate con un trasduttore lineare pre-clinico a 21 MHz in modalità B (vedere Tabella dei materiali). La colonna di sinistra(figure A, C, Ee G)mostra i controlli PBS. La colonna di destra(Figure B, D, Fe H)mostra 20 μL di campione di goccioline pirolipidiche post-condensato al 30% diluito in 50 mL di PBS a 37 °C. Ogni riga rappresenta le pressioni negative di picco a campo libero, che sono state stimate dal lavoro svolto da Sheeran et al.8 I triangoli gialli indicano la profondità di messa a fuoco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Metodo</td>
			<td>Agente</td>
			<td>Pyro Shell %</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>30</td>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bolle</td>
			<td>[/mL]</td>
			<td>(2.76 ± 0.28) × 10^10</td>
			<td>(3.04 ± 0.15) × 10^10</td>
			<td>(2.02 ± 0.11) × 10^10</td>
			<td>(1.91 ± 0.22) × 10^10</td>
			<td>(1,47 ± 0,05) × 10^10</td>
			<td>(8,47 ± 0,95) × 10^9</td>
			<td>(9,89 ± 0,15) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bolle</td>
			<td>Picco [nm]</td>
			<td>329 ± 6</td>
			<td>297 ± 15</td>
			<td>305 ± 21</td>
			<td>273 ± 14</td>
			<td>310 ± 40</td>
			<td>266 ± 33</td>
			<td>393 ± 89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bolle</td>
			<td>Media [nm]</td>
			<td>609 ± 2</td>
			<td>603 ± 15</td>
			<td>635 ± 6</td>
			<td>690 ± 8</td>
			<td>812 ± 1</td>
			<td>935 ± 22</td>
			<td>950 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Bolle</td>
			<td>Mediana [nm]</td>
			<td>450 ± 6</td>
			<td>421 ± 6</td>
			<td>414 ± 6</td>
			<td>432 ± 5</td>
			<td>490 ± 2</td>
			<td>596 ± 37</td>
			<td>695 ± 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Goccioline</td>
			<td>[/mL]</td>
			<td>(2.18 ± 0.07) × 10^10</td>
			<td>(2.71 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1,75 ± 0,18) × 10^10</td>
			<td>(1,72 ± 0,13) × 10^10</td>
			<td>(1,09 ± 0,01) × 10^10</td>
			<td>(7.36 ± 0.81) × 10^9</td>
			<td>(7.38 ± 0.28) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Goccioline</td>
			<td>Picco [nm]</td>
			<td>292 ± 0</td>
			<td>297 ± 17</td>
			<td>261 ± 13</td>
			<td>280 ± 9</td>
			<td>268 ± 17</td>
			<td>287 ± 38</td>
			<td>390 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Goccioline</td>
			<td>Media [nm]</td>
			<td>353 ± 5</td>
			<td>350 ± 5</td>
			<td>347 ± 1</td>
			<td>347 ± 4</td>
			<td>397 ± 1</td>
			<td>399 ± 6</td>
			<td>400 ± 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>Goccioline</td>
			<td>Mediana [nm]</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>310 ± 1</td>
			<td>315 ± 2</td>
			<td>340 ± 0</td>
			<td>367 ± 5</td>
			<td>370 ± 9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Statistiche dei dati di dimensionamento dei campioni di microbolle e goccioline con diverso contenuto di Pyro-SPC da Coulter Counter (CC) (n = 3). Tutti gli errori indicano una deviazione standard.
Informazioni supplementari - Lipid Formula Sheet: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Lipid%20Formula%20Sheet.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Informazioni supplementari - Altri protocolli e dati: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Other%20Protocols%20and%20Data.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets

In questo protocollo vengono delineati i metodi per sintetizzare e caratterizzare le goccioline di porfirina multimodali a cambiamento di fase.

Sintesi e caratterizzazione di goccioline di porfirina multimodali a cambiamento di fase

Phase-change droplets are a class of ultrasound contrast agents that can convert into echogenic microbubbles in situ with the application of sufficient ...

Questo protocollo è significativo perché fornisce la procedura completa per la creazione di goccioline dal film lipidico alla soluzione lipidica alle microbolle e quindi alle goccioline. Il vantaggio principale di questa tecnica è la semplicità per condensare le microbolle in goccioline. Solo raffreddando e vorticando, le goccioline possono essere fatte senza la necessità di pressurizzazione.Una dimostrazione visiva è fondamentale perché un semplice test per vedere se le microbolle sono state condensate con successo è controllando visivamente il cambiamento nella traslucenza. A dimostrare la procedura sarà Kimoon Yoo, allievo di un master nel laboratorio di Gang Zheng. Utilizzando un decapper, rimuovere il sigillo di alluminio sul flaconcino di siero e trasferire un millilitro della soluzione lipidica in una fiala campione di vetro borosilicato da 1,85 millilitro con un tappo a vite fenolica lasciando che la soluzione lipidica scorra lungo la parete interna senza creare bolle.Con il flaconcino campione da 1,85 millilitro prepararsi a fluire in gas decafluorobutano nello spazio di testa del flaconcino del campione utilizzando lo scambiatore di gas. Assicurarsi che tutte le valvole dello scambiatore di gas siano chiuse correttamente e che la pompa sia spenta. Aprire la valvola del collettore e rimuovere con cautela l'ago corrispondente dal collettore.Aprire la valvola di pressione A e la valvola di pressione B e ruotare la valvola del cilindro del gas di circa 1/16 a 1/8 in senso antiorario per aprirla parzialmente. Aprire la valvola della maniglia a T e srotolare il flaconcino del campione con la soluzione lipidica. Posizionare l'ago del collettore sopra l'interfaccia dell'aria liquida del flaconcino, ruotare lentamente la valvola del regolatore dell'aria in senso orario fino a quando l'ago del misuratore del regolatore dell'aria si sposta leggermente dalla sua posizione di riposo e lasciare che il gas perfluorocarburi fluisca delicatamente nello spazio di testa del flaconcino per 30 secondi, facendo attenzione a non creare bolle.Regolare la valvola del regolatore dell'aria, se necessario. Dopo 30 secondi, conservare con cura e rapidamente il flaconcino del campione senza muovere troppo il flaconcino. Sia la valvola del cilindro del gas, la valvola della maniglia a T, la valvola del regolatore dell'aria, la valvola di pressione A, la valvola di pressione B e la valvola del collettore.Inghinare con cura l'ago, quindi etichettare il flaconcino del campione e sigillare il collo con pellicola di cera andando in senso orario. Conservare il flaconcino del campione al buio e a quattro gradi Celsius per almeno 10 minuti o fino a 24 ore. Mettere circa 100 grammi di ghiaccio secco in un contenitore isolato in un contenitore isolato in un altro contenitore isolato.Recupera una fiala di siero di decafluorobutano precedentemente preparata su aghi da 1,5 pollici calibro 20, una siringa di plastica da un millilitro, un contenitore da 200 millilitri, pinze metalliche e un termometro. Posizionare il flaconcino campione con la soluzione lipidica nell'agitatore meccanico e agitare per 45 secondi. Ci dovrebbe essere un cambiamento di colore e traslucenza.Dopo l'agitazione meccanica, tenere il flaconcino del campione sul lato destro al riparo dalla luce e iniziare un conto alla rovescia di 15 minuti per raffreddare il flaconcino e selezionare le microbolle. Quando il conto alla rovescia ha raggiunto i 10 minuti, riempire un contenitore con circa 200 millilitri di isopropanolo e raffreddarlo a meno 20 gradi Celsius con ghiaccio secco usando pinze metalliche. Dopo che le microbolle sono state selezionate per 15 minuti, cercare la dimensione selezionata della partizione all'interno del flaconcino campione.Mantenendo il flaconcino del campione sul lato destro verso l'alto, srotolare accuratamente il flaconcino del campione e prelevare circa 0,7 millilitri della partizione inferiore con un ago da 1,5 pollici calibro 20 attaccato a una siringa di plastica da un millilitro. Assicurarsi che nessuna delle partizioni superiori sia ritirata e non far scorrere la siringa per rimuovere le sacche d'aria. Puntando al cerchio centrale sul tappo di gomma, inserire un ago diverso calibro 20 in una fiala di siero di decafluorobutano mantenendo l'ago vicino alla parte superiore della fiala di siero per sfogare e quindi inserire l'ago con le microbolle selezionate di dimensioni selezionate.Trasferire lentamente le microbolle selezionate di dimensioni. Lasciare che il liquido scivoli delicatamente lungo la parete interna del flaconcino di siero di decafluorobutano. Una volta trasferita tutta la soluzione di microbolle selezionata, rimuovere l'ago con la siringa, ma tenere l'ago di sfiato per alleviare la pressione negativa.Aggiungere piccole quantità di ghiaccio secco o isopropanolo a temperatura ambiente al bagno di isopropanolo per garantire che la temperatura del bagno sia compresa tra meno 15 e meno 17 gradi Celsius. Con l'ago di sfiato calibro 20 inserito vicino alla parte superiore del flaconcino di siero, posizionare il flaconcino di siero e il bagno di isopropanolo, mantenendo il livello della microbolla al di sotto del livello dell'isopropanolo, ma il collo del flaconcino sopra di esso e a intermittenza ruotare il flaconcino di siero per due minuti per condensare le microbolle. Non far roteare continuamente il flaconcino di siero nell'isopropanolo e non lasciare che la soluzione si congeli.Ruotare per circa cinque secondi e sollevare il flaconcino di siero dall'isopropanolo. Controllare la nucleazione del ghiaccio, quindi riprendere a turbinare in isopropanolo. Se c'è formazione di ghiaccio, ruotare la fiala di siero nell'aria fino a quando non si dissipa.Dopo i due minuti di condensazione rimuovere il flaconcino di siero dal bagno di isopropanolo e rimuovere l'ago di sfiato. Le microbolle dovrebbero essersi condensate in goccioline come indicato dal cambiamento di traslucenza. Pulire il flaconcino di siero, etichettarlo e metterlo su ghiaccio normale in un contenitore isolato scuro fino al momento dell'uso.Le goccioline non epri con una guarnizione in alluminio intatta dovrebbero essere stabili fino a sei ore finché il ghiaccio fuso viene sostituito secondo necessità. Quando è pronto per l'uso, rimuovere la guarnizione in alluminio con il decapper. Dopo aver utilizzato questo protocollo, microbolle precon condensate e selezionate e goccioline post-condensate sono state dimensionate su un contatore Coulter con un'apertura di 10 micron.Vengono mostrati i dati di dimensionamento per la formulazione piro-lipidica al 30%. Le statistiche basate sui dati di dimensionamento sono mostrate qui. Utilizzando un rapporto tra diametri medie pre e post-condensati, i risultati hanno mostrato che all'aumentare del contenuto piro-lipidico, la concentrazione diminuiva e il diametro medio aumentava.Vengono mostrate le misure rappresentative degli assorbenti del campione di goccioline piro-lipidiche al 30%. Ciò ha dimostrato che gli assemblaggi intatti hanno proprietà ottiche diverse riflesse da picchi diversi rispetto ai singoli componenti lipidici non assemblati. Qui vengono mostrate misurazioni rappresentative della microbolletta precon condensata, del campione di goccioline post-condensate con il 30% di pirolipidi, dimostrando diversi picchi di fluorescenza per campioni intatti nella forma interrotta.Vengono mostrate immagini ecografiche rappresentative del campione di goccioline piro-lipidiche al 30% visualizzate a diverse pressioni. A basse pressioni, è stato osservato solo il segnale di fondo delle bolle d'aria bloccate dalla sintesi dell'agar. A una potenza leggermente superiore, sono state generate alcune microbolle, il che è dimostrato dalla comparsa di macchie luminose.Più microbolle sono state generate all'aumentare della pressione. È importante ricordare che la temperatura di condensazione qui è ottimizzata per questa specifica formulazione di guscio di goccioline. Diverse formulazioni di shell possono richiedere una temperatura diversa.

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