Patient-afledt tumor organoider rekapitulere arkitekturen og funktionen af tumorvæv præcist med bedre reproducerbarhed af sygdom. Derfor, en patients reaktion på anti-cancer medicin kan evalueres præcist ved hjælp af denne model. Tumor organoider er uegnede til en in-vitro høj gennemløb assay system eller celle analyse på grund af store klynger dannelse i kultur.
Ved hjælp af denne teknik blev der udviklet enkel og mere præcis HTS til evaluering af molekylære målrettede lægemidler. Da organoidkulturen er meget forskellig fra 2D-kultur, kan man føle sig forvirret over kulturen i starten, men det er vigtigt omhyggeligt at observere organoidernes morfologiske ændringer. Efter at have fjernet den frosne modbydelige fra flydende kvælstofopbevaring, forsigtigt agitere patienten afledt tumor organoider i et vandbad ved 37 grader Celsius i et minut.
Fjern den modbydelige fra vandbadet og tør med 70% ethanol. Sæt derefter hætteglasset i biosikkerhedsskabet. Overfør tumororganoiderne i et 15 milliliterrør, der indeholder mediet til organoider.
Brug en tre milliliter overførsel pipette til forsigtigt at blande tumor organoider og medium ved pipetter op og ned fem gange. Pellet ned tumor organoider ved centrifugering. Kassér supernatanten og genbrug tumororganoid pellet i fem milliliter frisk medium.
Overfør tumor organoid suspension i en T25 kolbe og inkubere ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter en uge af den første passage, overføre tumor organoid suspension fra to T25 kolber i to centrifuge rør og pellet ned tumor organoider ved centrifugering. Anslå tumor organoid pellet volumen og genbruge pellet i 2,5 milliliter frisk medium pr rør.
Pool tumor organoid suspension i et rør. Overfør den poolede suspension til en T75 kolbe indeholdende 10 milliliter frisk medium og inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter 24 timers medium forandring hakker tumororganoiderne ved hjælp af et cellefragmenterings- og dispersionsinstrument udstyret med en filterholder, der indeholder et 70 mikrometernetfilter.
Fortynd 15 milliliter tumor organoid suspension 10 gange. Brug celleaffjedring dispenser til frø 40 mikroliters af fortyndet tumor organoid suspension i en 384-godt ultra lav vedhæftet fil spheroid mikroplade. Efter 24 timer skal du bruge en væskebehandler til at tilføje 0,04 mikroliter testmiddelopløsninger fra 10 serielle fortyndinger ved endelige koncentrationsintervaller på 20 mikromolar til 1,0 nanomolar i brøndene og inkubere pladen i seks dage.
Ved inkubationens afslutning tilsættes intracellulær ATP-målereagens i testtjerne. Brug en mixer til at blande indholdet af pladen og inkubere pladen i 10 minutter ved ca. 25 grader Celsius. Brug en pladelæser til at måle det intracellulære ATP-indhold som luminescens.
Efter 24 timer af den tredje passage, placere en 384-godt ultra lav vedhæftet fil spheroid mikroplade med 40 mikroliter af medium pr samt en destination plade på cellen picking og billedbehandling system. Byg plukkekammeret med seks milliliter kulturmedium og centrifuge ved 1.500 gange G i to minutter for at fjerne luftboblerne. Tilføj fire mikroliter af tumor organoid suspension i plukkekammeret, og sæt plukkammeret på systemet.
Lad celleklyngerne sætte sig i bunden af kammeret i et minut efter spredningen, og start derefter kammerets scanning. Indstil plukstørrelsen til 140 til 160 mikrometer på systemet til automatisk valg af celleklynger. Kontroller derefter kvaliteten af de markerede celleklynger på de scannede billeder, og overfør 10 celleklynger pr. brønd ved hjælp af plukspidser til destinationspladen.
I den aktuelle undersøgelse blev effekten af anti-cancer agenter på den patient-afledte tumor organoid vurderet. Den høje følsomhed for alle anticancermidlerne blev angivet ved de halvmaksimtiske hæmmende koncentrationsværdier, der var mindre end to mikromolar i området under kurveværdierne mindre end 282. For en antistof afhængig cellulær cytotoksicitet vurdering, procent cytolyse af tumor organoider i overværelse af to forskellige antistoffer blev målt.
Procent cytolyse steg med tiden. Uden antistofferne på seks timer med effektoren til målcelleforholdet på en-til-en nåede cytolyset 45%Mens cytolyset ved forholdet mellem to og en nåede 70%Den naturlige dræbercelle medierede cytolyse ved hjælp af trastuzumab var ca. 60% ved effektoren til målcelleforholdet på en-til-en og 80% ved forholdet mellem to og en på seks timer. I modsætning hertil havde cetuximab en dosis afhængig indvirkning på den naturlige dræbercelle medieret cytolyse.
Ved den højeste koncentration af cetuximab blev der observeret 90% cytolyse ved effektoren til målcelleforholdet på en til en, og 100% cytolyse blev observeret ved forholdet mellem to og en, hvilket indikerer høj effekt af cetuximab. En høj gennemløb assay system ved hjælp af patient-afledt tumor organoider er bedre end at evaluere potentielle anti-cancer agenter og giver muligheder for lægemiddelvurdering og fremskridt i personlig medicin.