Patiënt-afgeleide tumor organoïden recapituleren de architectuur en functie van tumorweefsel nauwkeurig met een betere reproduceerbaarheid van de ziekte. Daarom kan de reactie van een patiënt op geneesmiddelen tegen kanker nauwkeurig worden geëvalueerd met behulp van dit model. Tumororganoïden zijn ongeschikt voor een in-vitro high throughput assay systeem of celanalyse vanwege de vorming van grote clusters in cultuur.
Met behulp van deze techniek werd eenvoudige en nauwkeurigere HTS voor de evaluatie van moleculair gerichte geneesmiddelen ontwikkeld. Omdat de organoïdecultuur heel anders is dan de 2D-cultuur, kan men zich in het begin verward voelen over de cultuur, maar het is belangrijk om de morfologische veranderingen van de organoïden zorgvuldig te observeren. Nadat u het bevroren vilein uit de opslag van vloeibare stikstof hebt verwijderd, roert u de van de patiënt afgeleide tumororganoïden gedurende één minuut voorzichtig in een waterbad bij 37 graden Celsius.
Haal het vilein uit het waterbad en veeg af met 70% ethanol. Plaats de injectieflacon vervolgens in de bioveiligheidskast. Breng de tumororganoïden over in een buis van 15 milliliter die het medium voor organoïden bevat.
Gebruik een transferpipet van drie milliliter om de tumororganoïden en het medium voorzichtig te mengen door vijf keer op en neer te pipetteren. Pellet de tumororganoïden neer door centrifugering. Gooi het supernatant weg en resuspend de tumor organoïde pellet in vijf milliliter vers medium.
Breng de tumor organoïde suspensie over in een T25-kolf en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Breng na een week van de eerste passage de tumororganoïde suspensie van twee T25-kolven over in twee centrifugebuizen en pellet de tumororganoïden door centrifugering. Schat het volume van de tumororganoïde pellet en resuspend de pellet in 2,5 milliliter vers medium per buis.
Pool de tumor organoïde suspensie in één buis. Breng de gepoolde suspensie over in een T75-kolf met 10 milliliter vers medium en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na 24 uur van medium verandering, gehakt de tumor organoïden met behulp van een cel fragmentatie en dispersie instrument uitgerust met een filterhouder met een 70 micrometer mesh filter.
Verdun 15 milliliter tumor organoïde suspensie 10 keer. Gebruik de celsuspensiedispenser om 40 microliter verdunde tumororganoïde suspensie te zaaien in een 384-well ultra low attachment sferoïde microplaat. Gebruik na 24 uur een vloeistofhandler om 0,04 microliter testmiddeloplossingen uit 10 seriële verdunningen bij eindconcentratiebereiken van 20 micromolair tot 1,0 nanomolair in de putjes toe te voegen en incubaleer de plaat gedurende zes dagen.
Voeg aan het einde van de incubatie intracellulair ATP-meetreagens toe aan de testputten. Gebruik een mixer om de inhoud van de plaat te mengen en incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij ongeveer 25 graden Celsius. Gebruik een plaatlezer om het intracellulaire ATP-gehalte als luminescentie te meten.
Plaats na 24 uur na de derde passage een 384-well ultra low attachment sferoïde microplaat met 40 microliter medium per put en een bestemmingsplaat op het cell picking and imaging systeem. Bouw de plukkamer met zes milliliter kweekmedium en centrifugeer gedurende twee minuten op 1.500 maal G om de luchtbellen te verwijderen. Voeg vier microliter tumor organoïde suspensie toe in de plukkamer en stel de plukkamer op het systeem in.
Laat de celclusters zich na dispersie gedurende één minuut op de bodem van de kamer nestelen en start vervolgens de kamerscanning. Stel de pickgrootte in op 140 tot 160 micrometer op het systeem voor automatische selectie van celclusters. Controleer vervolgens de kwaliteit van de geselecteerde celclusters op de gescande afbeeldingen en breng 10 celclusters per put over met behulp van pluktips naar de bestemmingsplaat.
In de huidige studie werd het effect van antikankermiddelen op de patiënt-afgeleide tumor organoïde beoordeeld. De hoge gevoeligheid voor alle middelen tegen kanker werd aangegeven door de half maximale remmende concentratiewaarden van minder dan twee micromolair in het gebied onder de curvewaarden van minder dan 282. Voor een antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteitsbeoordeling werd procent cytolyse van tumororganoïden in aanwezigheid van twee verschillende antilichamen gemeten.
Het percentage cytolyse nam toe met de tijd. Zonder de antilichamen na zes uur met de effector-doelcelverhouding van één-op-één, bereikte de cytolyse 45%Terwijl bij de verhouding van twee op één de cytolyse 70% bereikte De natuurlijke killercel gemedieerde cytolyse met trastuzumab was ongeveer 60% bij de effector tot doelcelverhouding van één op één en 80% bij de verhouding van twee tot één na zes uur. Cetuximab daarentegen had een dosisafhankelijk effect op de door de natural killercel gemedieerde cytolyse.
Bij de hoogste concentratie cetuximab werd 90% cytolyse waargenomen bij de verhouding effector tot doelcel van één-op-één, en 100% cytolyse werd waargenomen bij de verhouding van twee op één, wat wijst op een hoge effectiviteit van cetuximab. Een high throughput assay-systeem met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden is superieur aan het evalueren van potentiële anti-kanker middelen en biedt mogelijkheden voor de beoordeling van geneesmiddelen en vooruitgang in gepersonaliseerde geneeskunde.
