Name: high-throughput in vitro assay using patient-derived tumor organoids
Uploaded: 2021-06-14T14:00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids at JoVE.com

ברצוננו להודות לחולים שסיפקו את הדגימות הקליניות המשמשות במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מתוכנית המחקר התרגומית של מחוז פוקושימה.

כל הניסויים הכוללים חומרים שמקורם באדם בוצעו על פי הצהרת הלסינקי ואושרו מראש על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית פוקושימה (מספרי אישור 1953 ו-2192; תאריכי אישור 18 במרץ 2020 ו-26 במאי 2016, בהתאמה). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים שסיפקו את הדגימות הקליניות ששימשו במחקר זה.
1. תרבות של PDOs
הערה: F-PDOs יוצרים אשכולות תאים המציגים מגוון של מורפוגות הטרוגניות וגדלים בתרבות ההשעיה(איור 1). יתר על כן, F-PDOs ניתן לתרבות במשך יותר מ 6 חודשים והוא יכול להיות cryop שמורות לשימוש עתידי.
<ol><li>הפשרת PDOs מאוחסנים (יום 0)<ol>
<li>PDOs הפשרה וזרע (למשל, RLUN007, אדנוקרצינומה ריאות) ביום 0(איור 1). ראשית, להוסיף 15 מ"ל של בינוני עבור PDOs (ראה טבלה של חומרים) המכיל 1% של תוספת B-27 ו 30 ng/mL של גורם גדילה אפידרמיס צינור צנטריפוגה סטרילי 50 מ"ל.</li>
		<li>לאחר הסרת הפיקיון הקפוא מאחסון חנקן נוזלי, יש להסעיר בעדינות את ה-PDOs באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לאחר מכן, להסיר את הקרבון מאמבט המים, לנגב את הקרבון עם 70% אתנול, ולאחר מכן להעביר את הקרבון לתוך ארון בטיחות ביולוגי.</li>
		<li>העבר את התוכן של המשחקון לצינור המכיל 15 מ"ל של בינוני עבור PDOs. מערבבים את PDOs ובינוני על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה חמש פעמים עם pipette העברה 3 מ"ל. צנטריפוגה הצינור ב 200 x גרם במשך 3 דקות ב ~ 25 °C (70 °F) ולהשליך את supernatant. יש להזרים מחדש את כדורי ה-PDO ב-5 מ"ל של מדיום טרי ולהעבירלבקבוקון 2 ס"מ 2 (ראו טבלת חומרים)עם צנרת עדינה. לבסוף, תרבות PDOs באינקובטור ב 37 °C (5% CO2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשנות את המדיום פעמיים בשבוע (ימים 3-7). צנטריפוגה השעיית PDO כדי לזרז את אשכולות התאים, ולהחליף 4 מ"ל של המדיום (80% נפח). תרגיע את התאים במדיום הטרי. הערה: רוב RLUN007 מופיעים כאשכולות תאים שקוטרם 100-500 מיקרומטר. כאשר צבעו של פנול אדום במדיום משתנה לצהוב כפי שמוצג באיור 1A, החליפו את המדיום בתדירות גבוהה יותר. אם המדיום הופך לצהוב ביום שלאחר ההחלפה, וכל אשכול תאים מתמזג ויוצר אשכולות גדולים יותר שקוטרם >500 מיקרומטר, מעבר ביחס מפוצל של 1:2.</li>
	<li>תת-תרבות (ימים 8-28) של PDOs הערה: בהתחשב בקושי למדוד בפועל את מספר התאים הבודדים, תזמון המעבר נקבע על סמך צפיפות מתאימה של אשכול התאים וגודל גלולה PDO לאחר צנטריפוגה (איור 1B). במקרה של RLUN007, נפח כדור PDO מגיע 30 μL (צפיפות רוויה ב 25 ס"מ2 צלוחיות) כ 2 שבועות לאחר הפשרה.<ol>
<li>להעברה מבקבוק אחד 25 ס"מ2 לשני 25 ס"מ2 צלוחיות (P1), להעביר את השעיית PDO לתוך צינור צנטריפוגה צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 2 דקות בכ 25 °C (70 °F). להעריך את הנפח של כדורי PDO, ולהשליך את supernatant. resuspend כדורי PDO באמצעות פיפטה 5 מ"ל ב 5 מ"ל של בינוני טרי. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה חמש פעמים במהירות נמוכה. לאחר מכן, להעביר מחצית הנפח של מתלה PDO (2.5 מ"ל) לתוך שני צלוחיות, ולהוסיף 2.5 מ"ל של בינוני טרי לכל בקבוקון. תרבית התאים ב 37 °C (5% CO2).</li>
		<li>להעברה משני צלוחיות25 ס"מ לבקבוקון אחד 75 ס"מ2 (P2), להעביר את השעיית PDO משני צלוחיות לשני צינורות צנטריפוגה וצנטריפוגה PDO ב 200 x גרם במשך 2 דקות בכ 25 °C (75 °F). לאחר מכן, להעריך את הנפח של כדורי PDO ו resuspend הכדור ב 2.5 מ"ל של בינוני טרי (לכל צינור). לאחר מכן, לשלב את מתלה PDO בצינור אחד עם זה ב השני ולהעביר אותו 75 ס"מ2 בקבוקון המכיל 10 מ"ל של מדיום טרי. תרבית התאים ב 37 °C (5% CO2). העבר את PDOs תת-תרבותי משני 25 ס"מ2 צלוחיות לאחד 75 ס"מ2 בקבוקון כשבוע לאחר המעבר הראשון(איור 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. עיכוב גדילה HTS
הערה: הפעילות מעכבת הצמיחה של סוכני נגד נגד PDOs מוערכת על ידי מדידת תוכן ה- ATP התאי, כפי שמוצג באיור 2. שלב זה מתבצע באמצעות ערכת צ'ק-צ'י של התאמת תאים הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
<ol><li>ביום 0, תרבות PDOs (למשל, RLUN007) בבקבוקונים עד מספר נאות של אשכולות תאים זמינים לבדיקה. יום אחד לפני הזריעה, להעביר את השעיית PDO מ 75 ס"מ2 בקבוקון לצינור 15 מ"ל צנטריפוגה ב 200 x g במשך 2 דקות כדי למדוד את נפח גלולה PDO. לאחר מכן, resuspend גלולה PDO ב 15 מ"ל של בינוני טרי ולהעביר אותו בחזרה 75 ס"מ2 בקבוקון. תרבית התאים ב 37 °C (5% CO2). הערה: נפח גלולה PDO הנדרש תלוי בקצב הדילול של כל PDO ובמספר לוחות 384-well המשמשים לבדיקה. עבור RLUN007, 200 μL של נפח גלולה התא נחוץ לזרוע לתוך עשר לוחות 384-well.</li>
	<li>ביום 1 (24 שעות לאחר שינוי המדיום), טחון את PDOs באמצעות ציוד פיצול ופיזור תאים (ראה טבלה של חומרים) עם מחזיק מסנן המכיל מסנן רשת 70 מיקרומטר. לאחר מכן, לדלל 15 מ"ל של השעיית PDO על ידי 10x. זרע 40 μL של השעיית PDO לתוך 384-טוב אולטרה נמוך ספירואיד (עגול התחתון) מיקרו-לוחות (ראה טבלה של חומרים)באמצעות מתקן מתלה תא (ראה טבלה של חומרים). הערה: עבור כריית אשכולות תאים, מומלץ להשתמש בציוד פיצול ופיזור התאים הזמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>בשעה 24 שעות לאחר זריעה (יום 2), לטפל PDOs עם 0.04 μL של פתרונות סוכן בדיקה בטווחי ריכוז סופיים של 20 μM עד 1.0 nM (10 דילול טורי) באמצעות מטפל נוזלי (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>ביום 8 (144 שעות לאחר טיפול בחומר הבדיקה), להוסיף ATP תאי מדידה ריאגנט לבארות הבדיקה. מערבבים את הצלחות באמצעות מערבל ודגרה במשך 10 דקות ב 25 °C (70 °F). מדוד את תוכן ה- ATP התאי כאות באמצעות קורא לוחות (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>כדי לחשב את הכדאיות של התא, חלק את כמות ה- ATP בבארות הבדיקה לפי זה בבארות הבקרה המכילות את הרכב, כאשר הרקע מופחת. כדי לחשב את קצב הצמיחה על פני 6 ימים, לחלק את כמות ATP בבארות בקרת הרכב על ידי זה בבארות בקרת הרכב 24 שעות לאחר זריעה.</li>
	<li>חשב את ריכוז המעכבות של 50%(IC 50) ואת השטח מתחת לערכי העקומה (AUC) מעקומות תגובת המינון באמצעות תוכנת ניתוח נתונים ביולוגית (ראה טבלה של חומרים). גורם Z הוא פרמטר ללא ממד הנע בין 1 (הפרדה אינסופית) ל- <0, המוגדר כ- Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc + - μc-|, כאשר פקדי σc+, σc-, μc+ו- μc - הם סטיות התקן (σ) והממוצעים (μ) של הפקדים הגבוהים (c+) והנמוך (c−)14, בהתאמה.</li>
</ol>3. HTS עם מערכת קטיף תאים והדמיה לעיכוב גדילה
הערה: אם יש סטייה גדולה (כאשר מקדם השונות [CV] ב- assay הוא יותר מ -20%) בנתונים באמצעות פרוטוקול 2, PDOs בגודל שנבחר עשויים להיות זרע לתוך 96-באר או 384-טוב לוחות באמצעות מערכת איסוף תאים והדמיה(איור 2). הפרוטוקול זהה לפרוטוקול המתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2 בסעיף הקודם. שלב זה מתבצע באמצעות מערכת איסוף והדמיה של תאים הזמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים).
<ol><li>ביום 1, להגדיר 384-טוב אולטרה נמוך מיקרו-לוח קבצים מצורפים עם 40 μL של בינוני / טוב צלחת יעד על מערכת איסוף התא והדמיה.</li>
	<li>מלא את תא הקטיף (ראה טבלת חומרים) עם 6 מ"ל של בינוני תרבות וצנטריפוגה ב 1,500 x g במשך 2 דקות כדי להסיר בועות אוויר. הוסיפו את ה-PDOs המושעים במדיום (נפח כדורי PDO, 4 מיקרו-אל) לתא הקטיף והגדירו את המערכת.</li>
	<li>עמדו בחדר לפחות דקה אחת, ואחריה פיזור, כך שאשכולות התאים יישבו בתחתית התא; לאחר מכן, לבצע סריקה של התא.</li>
	<li>הגדר את גודל האיסוף ל- 140-160 מיקרומטר (שטח 15,386-20,000 מיקרומטר2) במערכת לבחירה אוטומטית של אשכולות תאים. לאחר מכן, בדוק את איכות אשכולות התאים שנבחרו בתמונות הסרוקות והעבר עשרה אשכולות תאים לכל באר באמצעות עצות איסוף (ראה טבלת חומרים) ללוח היעד.</li>
	<li>בצע את שלבי הפרוטוקול מהשלב 2.3 ואילך.</li>
</ol>4. HTS לציטוקסיה תאית תלוית נוגדנים
הערה: שלב זה מתבצע באמצעות מערכת זמינה מסחרית (ראה טבלה של חומרים), שהוא מכשיר מדידת עבלה חשמלית. הוא משמש להערכת ציטוליזה של PDOs על ידי ציטוקסיה תאית תלוית נוגדנים (ADCC) עם נוגדנים חד שבטיים ותאי רוצח טבעי (NK)(איור 3). תאי NK מיוצרים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים באמצעות ערכת הייצור של תאי NK (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
<ol><li>מדידת פעילות ADCC<ol>
<li>ביום 0, מעיל צלחת 96-well (ראה שולחן חומרים) עם 50 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל פתרון פיברונקטין (0.5 מיקרוגרם / טוב) ב 4 °C (5 °F) לילה.</li>
		<li>ביום 1, לאחר הסרת פתרון פיברונקטין, להוסיף 50 μL של מדיום התרבות לכל באר כדי למדוד את העכבה ברקע.</li>
		<li>לפני זריעה, להוסיף 5 מ"ל של ריאגנט דיסוציאציה תרבית התא (ראה טבלה של חומרים) ל- PDOs (RLUN007: 100 μL של כדור PDO ב 75 ס"מ2 בקבוקון) ודגרה באינקובטור CO2 ב 37 °C במשך 20 דקות כדי לפזר את PDOs. כדי לעצור טריפסיניזציה, להוסיף 5 מ"ל של בינוני, צנטריפוגה ולהסיר את ריאגנט דיסוציאציה. לשטוף את PDOs עם בינוני טרי לסנן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>ספירת מספר התאים באמצעות מנתח יכולת ההובלה של התא (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>מעבירים את מתלה PDO למאגר ומערבבים באמצעות צינור רב ערוצי. מוסיפים את ההשעיה PDO לבארות ב 5 x 104 תאים / גם בצלחת 96-well. כל באר מכילה נפח סופי של 100 μL. לאחר מכן, מניחים את הצלחת בארון בטיחות ביולוגי בסביבות 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
		<li>מעבירים את הצלחת למכשיר באינקובטור CO2 ב 37 °C (50 °F). רשומות שינויים באותות העכבה כל 15 דקות כמדד התא.</li>
		<li>להפשיר את תאי NK באמבט מים 37 °C באותו יום כמו זריעת PDO. העבר את התאים מהחפתון לצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של בינוני עבור תאי NK (ראה טבלה של חומרים) וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בערך 25 °C (5 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא ב 10 מ"ל של מדיום טרי. לאחר ספירת התאים, התאם את צפיפות התא ל- 1 x 106 תאים/מ"ל והעבר לבקבוק2 75 ס"מ. תרבית תאי NK באינקובטור5% CO 2 ב 37 °C (5 °F).</li>
		<li>ביום 2, הכינו את פתרונות הנוגדנים (תמיסת מלח עם פוספט) בריכוז הסופי בלוחות סטריליים עם 96 בארות.</li>
		<li>הסר 60 μL של בינוני מכל באר, ולהוסיף 10 μL של פתרון trastuzumab או cetuximab (10 מיקרוגרם / מ"ל, 1 מיקרוגרם / מ"ל, ו 0.1 מיקרוגרם / מ"ל) ל- PDOs. העבר את הלוחות בחזרה למכשיר באינקובטור ורשום את אינדקס התא למשך שעה.</li>
		<li>העבר את ההשעיה של תא NK לצינור 50 מ"ל וספור את מספר התא. צנטריפוגות התאים ב 300 x g במשך 5 דקות ולהתאים את צפיפות תא NK ל 1 x 106 תאים / מ"ל ו 2 x 106 תאים / מ"ל עם המדיום עבור PDOs.</li>
		<li>הוסף 50 μL של השעיית תא NK לתאי המחולל (NK) ביחס תא יעד (RLUN007) של 1:1 או 2:1. הריכוזים הסופיים של הנוגדנים הם 1 מיקרוגרם / מ"ל, 0.1 מיקרוגרם / מ"ל, ו 0.01 מיקרוגרם / מ"ל. שמור את הצלחת בערך 25 °C (5 °F) במשך 15 דקות, ולהחזיר את הצלחות לכלי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>איסוף וניתוח נתונים<ol>
<li>המרת אינדקס התא לאחוז מערכי ציטוליזה באמצעות תוכנת ניתוח (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>אחוז הציטוליזה מתייחס לאחוז תאי היעד שנהרגו על-ידי תאי NK לעומת תאי יעד (PDOs) בלבד כפקד. הפחת את מדדי התאים של הבארות המכילות רק תאי NK מהאינדקס של בארות המדגם בכל נקודת זמן. לנרמל כל ערך לאינדקס התא מיד לפני הוספת נוגדנים. המר את אינדקס התאים המנורמל לאחוז ציטוליזה באמצעות המשוואה הבאה: % ציטוליזה = (1 - אינדקס תאים מנורמל [בארות מדגם]) / אינדקס תאים מנורמל (בארות יעד בלבד) x 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line-based+platforms+to+evaluate+the+therapeutic+efficacy+of+candidate+anticancer+agents.">Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+technology+and+applications+in+cancer+research.">Organoid technology and applications in cancer research.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 116 (2018).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+for+patient-derived+cancer+models+and+next-generation+living+biobanks.">Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks.</a> Cells. 8 (11), 1327 (2019).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+miniaturized+3D+organoid+culture+platform+for+ultra-high-throughput+screening.">Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tumor+culture+systems+for+functional+drug+testing+and+therapy+response+prediction.">Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li><li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+horizons+of+patient-derived+xenograft+models+in+colorectal+cancer+translational+research.">Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research.</a> Cancers (Basel). 11 (9), 1321 (2019).</li><li>Hum, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+analysis+of+cancer+behavior+cultured+in+vitro,+in+vivo,+and+ex+vivo.">Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo.</a> Cancers (Basel). 12 (3), 690 (2020).</li><li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues.">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues.</a> Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+for+evaluating+molecular+targeted+drugs+using+lung+patient-derived+tumor+organoids.">An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids.</a> Cells. 8 (5), 481 (2019).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+in+vitro+patient-derived+tumor+models+to+evaluate+anticancer+agents+and+cancer+immunotherapy.">Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy.</a> Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li></ol>

פוג'יפילם Wako ביו פתרונות תאגיד היא חברת בת של פוג'יפילם Wako טהור כימיקלים, הבעלים המסחרי של F-PDO ו F-PDO מדיה על ידי העברת רישיון.

המאפיין הייחודי של PDOs הוא שהם אינם מופרדים באופן אנזימטי לתאים בודדים במהלך תרבית או תימורת ושמירה על אשכולות תאים בתרבות. לכן, לא ניתן לספור במדויק את מספר התאים תחת מיקרוסקופ. כדי לפתור בעיה זו, מספר התאים נקבע חזותית על ידי רירית צינור צנטריפוגה המכיל את התאים עם צינורות המסומנים ברמות עבור 50-200 μL (איור 1B). יתר על כן, מכיוון שקשה למדוד את נפח הגלולה של צבירי תאים בתרבית בבקבוק2 ס"מ חזותית, זמן המעבר נקבע באמצעות שינוי הצבע הבינוני מאדום לצהוב והעלייה הבולטת בתאים בודדים או בפסולת עם זמן המעבר כאינדיקטורים (איור 1A,C). זו הנקודה של העברת PDOs. כמות כדורי PDO נמדדת חזותית לאחר צנטריפוגה בכל שינוי בינוני. כאשר נפח הכדור מפסיק לעלות, והבינוני הופך לצהוב ביום שלאחר החלפה בינונית, המדיום נחשב רווי בצפיפות, והעברתה מתבצעת. עוצמת הכדור מוגדרת עבור כל PDO. אם ה-PDOs אינם מתרבים, כמות המדיום משתנה מ-80% ל-50% בזמן החילוף הבינוני, וצפיפות ה-PDOs גדלה בתרבות.
HTS מתאים PDOs פותח. התפוקה שלו היא לפחות 10 עד 20 צלחות 384-well המבוצעות באמצעות בקבוקון אחד 75 ס"מ2 של PDO, ומספר הצלחות המעובדות ליום הוא לפחות 50. בנוסף, תוצאות ההערכה של תרופות נגד נגדים שונים על ידי HTS באמצעות PDOs כבר דווחו.
בעת ביצוע HTS, סתימת מסנן הרשת הנגרמת על-ידי כריית F-PDOs באמצעות פיצול התא וציוד הפיזור מטופלת בתחילה על-ידי שינוי גודל הרשת של המסנן ל- 100 מיקרומטר. השלב הבא הוא להפחית את נפח השעיית PDO החל על כלי הזכוכית. בעת הכנת פתרונות חומר בדיקה עבור HTS, תרכובות במשקל מולקולרי נמוך מומסים בדרך כלל דימתיל גופרתי, ואת הנוגדנים מומסים מלוחים פוספט-חוצץ. הממס המתאים משמש כחומר הבדיקה, ואת נתוני הבקרה מתקבלים מן הממס בשימוש.
להלן תיאור של אופן ההתמודדות עם השונות בנתוני ה- assay. אם יש שונות גדולה בנתונים במבחן באמצעות לוחות 384-well, יש לשנות את צלחת הבדיקה לפורמט צלחת 96-well. גורם הדילול PDO (מספר אשכולות תאים זרעים) נבדק גם לאחר זריעת הצלחת. לבסוף, ניתן להשתמש במערכת איסוף והדמיה של תאים כדי לבחור את הגודל של PDOs לבדיקה. לפני הוספת PDOs לתא, יש להסיר תאים בודדים ואשכולות תאים קטנים על-ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה כדי שתוכל לזהות כראוי PDOs. אם תאים בודדים או אשכולות תאים קטנים גלויים לאחר הוספת PDOs לתא, ניתן לבצע פיזורים מרובים כדי להסיר את התאים הבודדים. לאחר מכן, למרות שלמערכת איסוף התאים וההדמיה יש פונקציה המאפשרת לשמור על הצלחת להתחמם, פונקציה זו אינה משמשת בגלל אידוי של מדיום התרבות כאשר המערכת עובדת במשך תקופה ארוכה של זמן. לבסוף, אמצעי האחסון של אשכולות תאים אינו ידוע מכיוון שהוא מזוהה על-ידי תמונה מכוונת. יתר על כן, אם שני PDOs או יותר חופפים, PDO יחיד לא ניתן לזהות כראוי. עם זאת, ניתן להסיר PDOs לא רצויים באמצעות פונקציית הסרה על ידי בדיקת אותם על התמונה הסרוקה לאחר המהלך.
מכשיר מדידת העכבות החשמליות משמש בדרך כלל לתאי סרטן יעד חסידים כדי לפקח על שינויים בעמעמה במהלך התפשטות התאים. לכן, לא זוהה שינוי באינדקס התאים של PDOs שאינם דבקים. בניסיון לפתור בעיה זו, יש צורך לחקור את תנאי הזריעה כגון צפיפות PDO וטיפול אנזימטי (אנזים דיסוציאציה של תאים וזמן הטיפול) בהתאם לסוג PDO. בארות בצלחת חייב להיות מצופה גם עם מטריצה חוץ תאית מתאימה עבור PDOs זריעה. PDOs הם זרעים ללא טיפול אנזימטי, בהתאם לסוג של PDO. RLUN007 שימש למדידת המכשול על ידי זריעת PDOs על צלחת 96 באר לאחר פיזור אותם על ידי טיפול אנזימטי. RLUN007 טופל עם ריאגנט דיסוציאציה תרבית התא במשך 20 דקות ב 37 °C (50 °F) כדי לפזר את התאים ולחבר אותם לבארות של צלחת 96-באר. בהתחשב בכך שתאי RLUN007 מנותקים יוצרים מיד אגרגטים, רצוי לזרוע על הצלחות מיד לאחר סינון באמצעות מסננת. לאחר העברת ההשעיה של התא מהצינור למאגר, המאגר הועבר בעדינות מימין לשמאל פעמיים עד שלוש פעמים והוצמד למעלה ולמטה חמש פעמים לפני זריעתו על הצלחת. ההשעיה הייתה מעורבת גם עם כל תוספת לבאר. לאחר מכן הונחה הצלחת בארון בטיחות ביולוגי למשך 30 דקות (עבור PDOs) או 15 דקות (לתאי NK) כדי לאפשר לתאים להפיץ באופן שווה בבאר. הנקודה החשובה השנייה היא כי טיפול בנוגדנים ותאי NK צריך להיות מתוזמן להתרחש לפני מדד התא מגיע לרמה ואת הערך הוא לא פחות מ 0.5. במקרה של RLUN007, הזמן האופטימלי להתחיל את ההסתה הוא 20-22 שעות לאחר ה ציפוי, ומספר התא לזרוע הוא 5 x 104 תאים / טוב.
באופן כללי, התרבות והביקורת עבור organoids הגידול להשתמש מטריצות חוץ תאיות כגון מטריג'ל כדי ליצור פיגומים רקמת הגידול או אנזימים כגון טריפסין קולגנאז כדי לשבש את organoids3,4,5,6,7. היתרון של שיטה זו הוא שאין צורך במטריצה חוץ-תאית או בטיפול אנזימטי במהלך התרבות והבדיקה (למעט מבדיקות באמצעות מכשיר מדידת העכבות החשמליות), מה שמפחית באופן משמעותי את דרישות העבודה והעלויות. יתר על כן, שיטה זו קלה יחסית להתאמה למערכות בדיקת HTS ומערכות מדידה שונות. עם זאת, השימוש במטריצה חוץ תאית רצוי למטרות מחקר מסוימות מכיוון שהוא יכול לשמש כפיגומים לתאים ולהשפיע על מורפוגנזה, בידול והומאוסטזיס ברקמות.
במחקר זה, PDOs (RLUN007) עם מוטציה EGFR (L858R) כי הוא רגיש קלינית מעכבי EGFR וביטוי גבוה של הגן EGFR (נתונים לא הראו) שימשו להערכת מעכבי EGFR. הוכח כי הרגישות של RLUN007 למעכבי EGFR הייתה גבוהה יותר מזו של F-PDOs אחרים שמקורם בסרטןריאות 13 (איור 4). לכן, HTS באמצעות PDOs, אשר שומרים על המאפיינים של רקמת הגידול, הוא עדיף על הערכה של סוכנים נגד נגדים פוטנציאליים ומציג הזדמנויות להערכת תרופות והתקדמות ברפואה מותאמת אישית. למרות HTS מתאים להקרנה הראשונית של סוכנים, זה לא לשחזר את microenvironment הגידול ולכן לא יכול להעריך את היעילות של תרופות ב vivo. לכן, מערכת במבחנה שיכולה לחקות רקמת גידול אנושית ב- vivo על ידי תרבית משותפת עם תאי אנדותל וסקולריים ותאים סטרומיים אחרים או טכנולוגיית איברים על שבב בהיעדר מודלים של בעלי חיים נמצאת כעת בפיתוח.

קווי תאים סרטניים אנושיים מקובלים ללמוד את הביולוגיה של הסרטן ולהעריך סוכני נגד סרטן. עם זאת, קווי תאים אלה אינם בהכרח משמרים את המאפיינים המקוריים של רקמת המקור שלהם מכיוון שהמורפולוגיה, המוטציה הגנטית ופרופיל ביטוי הגנים שלהם יכולים להשתנות במהלך התרבות לאורך תקופות ארוכות. יתר על כן, רוב קווי התאים האלה מתורבתים בשכבת מונו-שכבתית או משמשים כקסנוגרפטים מורינים, שאף אחד מהם לא מייצג פיזית רקמת גידול1,2. לכן, היעילות הקלינית של סוכני נגד סרטן לא יכול להיות זהה לזה שנצפו בשורות תאים סרטניים. לכן, במערכות הפריה, כגון בדיקות ex vivo באמצעות קסנוגרפטים גידול שמקורם בחולה או organoids גידול נגזר המטופל (PDOs) ומודלים כדוריים גידול לשחזר במדויק את המבנה והתפקוד של רקמות הגידול, פותחו. ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמודלים אלה מנבאים את תגובת המטופלים לסוכני סרטן על ידי השוואה ישירה לרקמת הסרטן המתאימה. מערכות במבחנה אלה הוקמו עבור סוגים שונים של רקמות הגידול, ומערכות בדיקת תפוקה גבוהה הקשורות (HTS) לבדיקת תרופות פותחו גם3,4,5,6,7. תרביות האורגנויד האקס ויואו הטרוגניות של גידולים ראשוניים המתקבלים מחולים או גידולים שמקורם בחולים צברו תאוצה ניכרת בשנים האחרונות בגלל קלות התרבות שלהם ויכולתם לשמור על המורכבות של תאים ברקמה סטרומית8,9,10. מודלים אלה צפויים לשפר את ההבנה של הביולוגיה של הסרטן ולהקל על הערכת יעילות התרופה במבחנה.
סדרה של PDOs חדשני נוצרו לאחרונה מסוגים שונים של רקמת הגידול, המיועד F-PDO, תחת פרויקט המחקר התרגומי Fukushima. PDOs ליצור אשכולות תאים גדולים עם מורפולוגיה דומה לזו של הגידול המקור והוא יכול להיות תרבית במשך יותר משישה חודשים11. ההסטולוגיה ההשוואתית וניתוחי ביטוי הגנים המקיפים הראו כי התכונות של מחשבי ה- PDOs קרובות לאלו של רקמות הגידול המקור שלהם, גם לאחר צמיחה ממושכת בתנאי תרבות. יתר על כן, HTS מתאים הוקם עבור כל סוג של PDO ב 96-well ו 384-טוב צלחות. בבדיקות אלה נעשה שימוש כדי להעריך כמה סוכנים ממוקדים מולקולריים ונוגדנים. כאן, כימותרפיה סטנדרטית (paclitaxel ו carboplatin) המשמש לסרטן רירית הרחם הוערכו באמצעות F-PDOs נגזר חולה שלא הגיב paclitaxel ו carboplatin. בהתאם לכך, הפעילות מעכבת צמיחת התא של paclitaxel ו carboplatin נגד PDO זה היה חלש (IC50: >10 מיקרומטר). בנוסף, מחקרים קודמים דיווחו כי הרגישות של כמה F-PDOs לסוכנים כימותרפיים וסוכנים ממוקדים מולקולריים עולה בקנה אחד עם היעילות הקלינית11,12,13. לבסוף, שינויים במבנה בסדר גבוה יותר של PDOs הנגרמים על ידי סוכני נגדים נותחו באמצעות מערכת ניתוח תאים תלת מימדית12,13. תוצאות ההערכה של סוכני נגד נגד דיכאון באמצעות HTS מבוסס PDO דומים עם התוצאות הקליניות שהושגו עבור סוכנים אלה. כאן, פרוטוקול מוצג עבור HTS פשוט ומדויק יותר שניתן להשתמש בו כדי להעריך את העוצמה של סוכני נגד נגדים ואימונותרפיה באמצעות מודלים PDO.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4516</td>
			<td>Plates for HTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdoptCell-NK kit</td>
			<td>Kohjin Bio</td>
			<td>16030400</td>
			<td>Kit for NK cell production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cancer Cell Expansion Media plus</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical</td>
			<td>032-25745</td>
			<td>Medium for F-PDO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALyS505N-175</td>
			<td>Cell Science &#38; Technology institute</td>
			<td>10217P10</td>
			<td>Medium for NK cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL HANDLER</td>
			<td>Yamaha Motor</td>
			<td>-</td>
			<td>Cell picking and imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPet FT</td>
			<td>JTEC</td>
			<td>-</td>
			<td>Cell fragmentation and dispersion equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9683</td>
			<td>Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 555</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>-</td>
			<td>Liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-plate VIEW 96</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>300601020</td>
			<td>Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Solution</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical</td>
			<td>063-05591</td>
			<td>Plate coating for xCELLigence RTCA System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-PDO</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International</td>
			<td>-</td>
			<td>The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morphit software, version 6.0</td>
			<td>The Edge Software Consultancy</td>
			<td></td>
			<td>Biological data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop Combi</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td>Cell suspension dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Chamber</td>
			<td>Yamaha Motor</td>
			<td>JLE9M65W230</td>
			<td>Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Tip</td>
			<td>Yamaha Motor</td>
			<td>JLE9M65W300</td>
			<td>Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLUN007</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International</td>
			<td></td>
			<td>Lung tumor derived F-PDO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Cell culture dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 25 cm&#178; Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4616</td>
			<td>Culture flask for PDO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75 cm&#178; Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td>Culture flask for PDO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence immunotherapy software, version 2.3</td>
			<td>ACEA Bioscience</td>
			<td>-</td>
			<td>Analysis software for xCELLigence RTCA System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence RTCA System</td>
			<td>ACEA Bioscience</td>
			<td>-</td>
			<td>Electrical impedance measuring instrument for cytolysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput in vitro assay using patient-derived tumor organoids

אורגנוידים סרטניים שמקורם בחולה (PDOs) צפויים להיות מודל פרה-אקליני לסרטן עם רבייה טובה יותר של מחלות מאשר מודלים מסורתיים של תרבית תאים. PDOs נוצרו בהצלחה ממגוון גידולים אנושיים כדי לשחזר את הארכיטקטורה והתפקוד של רקמת הגידול בצורה מדויקת ויעילה. עם זאת, PDOs אינם מתאימים עבור מערכת בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה (HTS) או ניתוח תאים באמצעות 96-well או 384-well צלחות בעת הערכת תרופות נגד כי הם הטרוגניים בגודל וליצור אשכולות גדולים בתרבות. תרבויות וביקורות אלה משתמשות במטרישות חוץ-תאיות, כגון מטריגל, כדי ליצור פיגומים של רקמת הגידול. לכן, PDOs יש תפוקה נמוכה ועלות גבוהה, וזה כבר קשה לפתח מערכת בדיקת מתאים. כדי לטפל בבעיה זו, HTS פשוט ומדויק יותר הוקם באמצעות PDOs כדי להעריך את העוצמה של תרופות נגד ואימונותרפיה. אין ויטרו HTS נוצר המשתמש PDOs הוקמה גידולים מוצקים תרבית 384-היטב צלחות. HTS פותח גם להערכת פעילות ציטוקסיה תאית תלוית נוגדנים כדי לייצג את התגובה החיסונית באמצעות PDOs בתרבית לוחות 96-well.

HTS מדויק מאוד פותח באמצעות PDOs ו 384-well microplates כדי להעריך סוכני נגד, ופיתוח של HTS עבור כל PDO דווח בעבר10,11,12,13. הביצועים של HTS הוערך על ידי חישוב קורות העיר ואת Z'factor. Z'factor היא שיטה מקובלת לאימות איכות וביצועי בדיקות, והבדיקה מתאימה ל- HTS אם ערך זה הוא >0.514. נקודות ה-datum של הבקרה ב-384-well על לוחות באמצעות RLUN007 הראו שונות מועטה, עם ערכי קורות שוק של 5.8% ו-Z-factors מחושבים של 0.83, כפי שמוצג באיור 4. תוצאות אלה מצביעות על כך שבדיקה זו יש ביצועים גבוהים עבור HTS. כדי לחקור את הרגישות של PDOs סוכני נגד סרטן באמצעות HTS, עיכוב גדילה הוערך באמצעות RLUN007 מטופלים עם שמונה סוכני נגד סרטן, במיוחד, מעכבי קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) (afatinib, erlotinib, gefitinib, laפטיניב, osimertinib, ו rociletinib) ו paclitaxel, שהם טיפולים קליניים סטנדרטיים לסרטן ריאות תאים לא קטנים, ו mitomycin C כשליטה חיובית. ערכיIC 50 ו- AUC של סוכני נגד ההטיה עבור כל PDO מוצגים באיור 4. RLUN007 הראה רגישות גבוהה (IC50 < 2 מיקרומטר, AUC < 282) עבור כל מעכבי EGFR וסוכני נגד נגד אחרים. עקומות סיגמויד שחושבו עבור כל הנתונים הצביעו על כך שניתן למדוד במדויק את הפעילות המעכבת של סוכני נגד העיקולים.
מערכת איסוף ההדמיה וההדמיה של התאים משמשת כאשר הנתונים משתנים באופן משמעותי באמצעות המתודולוגיה שלעיל. מערכת איסוף התאים וההדמיה, שבוחרת אשכולות תאים במדויק מבלי לפגוע בהם, מאפשרת לבצע לבדיקות HTS מדויקות על ידי יישור גודל אשכול התאים כדי לא לכלול פסולת תאים ממערכת ה- assay. כאשר המערכת לא הייתה בשימוש, ערך קורות העיר היה 26.0% וערך Z'factor היה 0.23 (הנתונים לא הוצגו). עם זאת, ערכי קורות המשתמשים ב-CV ו-Z'factor שופרו ב-6.4% וב-0.81% וב-0.81, בהתאמה.
כדי לחקור ציטוליזה של PDOs עם פעילות ADCC באמצעות מכשיר מדידת עקשנות חשמלית, אשר מנטר את המספר, מורפולוגיה, וחיבור של תאים במשך זמן רב, שינויים באותות עקשנות הוערכו באמצעות RLUN007 שטופלו בנוגדנים (trastuzumab ו cetuximab) ותאי NK כתאי אפקטים בצלחת 96-well. בהשוואה לשליטה המורכבת מתאי יעד בלבד, אחוז הציטוליזה גדל עם הזמן. הוא הגיע ל-45% או 75% לאחר 6 שעות ביחס E:T של 1:1 (איור 5A, C) או 2:1 ( איור5B, D) ללא הנוגדנים. ציטוליזיס בתיווך תא NK באמצעות trastuzumab היה כ 60% ו 90% ביחס של 1:1 (איור 5A, 1 מיקרוגרם / מ"ל) ו 2:1 (איור 5B, 1 מיקרוגרם / מ"ל), בהתאמה, ב 6 שעות. לעומת זאת, cetuximab הייתה השפעה תלוית מינון על NK בתיווך תא ציטוליזה (איור 5C,D). בריכוז הגבוה ביותר של cetuximab, RLUN007 נהרסו ב 90% ו 100% ביחס של 1:1 ו 2:1, בהתאמה (איור 5C,D). ההשפעה של trastuzumab היה חלש יותר מזה של cetuximab, עם רק 60% ציטוטוקסיות. תוצאות אלה מצביעות על כך שמערכת בדיקת ה-PDO יכולה להעריך את פעילות ADCC באמצעות טכנולוגיה מבוססת עכום בזמן אמת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig1v5.jpg"> איור 1: נקודות קריטיות לתרבות PDO. (A)שינוי צבע במדיום. (B)מדידת כמות PDOs מגודל הכדור על ידי רירית צינור צנטריפוגה המכיל PDOs עם צינורות מסומנים ברמות עבור 50-200 μL. (C) צפיפות PDO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig1v5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig02.jpg"> איור 2: סיכום הפרוטוקול המשמש ליצירת מערכת בדיקת תפוקה גבוהה באמצעות מיקרו-לוחות בעלי 384 באר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig03.jpg"> איור 3: סיכום הפרוטוקול לבדיקה בתפוקה גבוהה של פעילות ADCC. ADCC, ציטוקסיה תאית תלוית נוגדנים; נ.ק. רוצח טבעי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig04.jpg"> איור 4: מערכת בדיקת תפוקה גבוהה לעיכוב גדילה עם סוכני נגד נגד. עקומת תגובת מינון של RLUN007 לסוכני נגד. PDOs טחון נזרעו 384-צלחות היטב. אלה טופלו במשך 6 ימים עם עשרה ריכוזים שונים של סוכני נגד נגדים (בין 10 μM ו 1.5 nM). הנתונים מייצגים את סטיית התקן ± הממוצעת של ניסויים משולשים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig05.jpg"> איור 5: תפוקה גבוהה של פעילות ADCC. (א,ב) טרסטוזומאב. (C,D) צ'טוקסימאב. (A,C) יחס של 1:1 של RLUN007 לתאי אפקט. (B,D) ציטוליזיס עם יחס של RLUN007: תאים אפקט של 1:2. הפעילות נמדדה 12 שעות לאחר הוספת התאים האפקטורטור. הנתונים מוצגים כסטיית התקן הממוצעת ± של שלוש דגימות שכפול. ADCC, ציטוקסיה תאית תלוית נוגדנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids at JoVE.com

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

מערכת בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה פותחה להערכת תרופות נגד סרטן באמצעות אורגנוידים של גידול שמקורם במטופל (PDOs), בדומה לרקמות סרטן אך אינן מתאימות למערכות במבחנה עם 96-well ו-384-well.

תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

אורגנוידים גידול נגזר המטופל לשחזר את הארכיטקטורה והתפקוד של רקמת הגידול במדויק עם רבייה טובה יותר של המחלה. לכן, ניתן להעריך במדויק את תגובת המטופל לתרופות נגד סרטן באמצעות מודל זה. organoids הגידול אינם מתאימים עבור מערכת בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה או ניתוח תאים בגלל היווצרות אשכולות גדולים בתרבות.באמצעות טכניקה זו, HTS פשוט ומדויק יותר להערכה של תרופות ממוקדות מולקולריות פותח. מאז התרבות האורגנויד שונה מאוד מתרבות 2D, אפשר להרגיש מבולבל על התרבות בהתחלה, אבל חשוב להתבונן בזהירות את השינויים המורפולוגיים של organoids. לאחר הסרת הנתעבות הקפואה מאחסון חנקן נוזלי, תסעיר בעדינות את האורגנוידים הגידוליים שמקורם בחולה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.מוציאים את הנתעב מאמבט המים ומנגבים עם 70% אתנול. ואז למקם את הקרבון בארון הבטיחות הביולוגית. העבר את organoids הגידול בצינור 15 מיליליטר המכיל את המדיום עבור organoids.השתמש בפיפטה העברת שלושה מיליליטר לערבב בעדינות את organoids הגידול ובינוני על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים. תפיל את האורגנוידים של הגידול על ידי צנטריפוגה. השלך את supernatant ו resuspend הכדור organoid הגידול בחמישה מיליליטר של מדיום טרי.מעבירים את ההשעיה האורגנוידית של הגידול לבקבוק T25 ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר שבוע של המעבר הראשון, להעביר את ההשעיה organoid הגידול משני צלוחיות T25 לתוך שני צינורות צנטריפוגה ולכדור את organoids הגידול על ידי צנטריפוגה. להעריך את נפח הכדור האורגנויד הגידול ולרסן מחדש את הכדור ב 2.5 מיליליטר של בינוני טרי לכל צינור.תבריכה את ההשעיה האורגנויד הגידולית בצינור אחד. מעבירים את המתלים המרופדים לבקבוק T75 המכיל 10 מיליליטר של מדיום טרי ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר 24 שעות של שינוי בינוני, טחון organoids הגידול באמצעות תא פיצול מכשיר פיזור מצויד מחזיק מסנן המכיל מסנן רשת 70 מיקרומטר.לדלל 15 מיליליטר של השעיית organoid הגידול 10 פעמים. השתמש במתקן השעיית התא כדי לזרוע 40 מיקרוליטרים של השעיית אורנואיד גידול מדולל במיקרו-לוחית מיקרו-ספירואידית בעלת חיבור נמוך במיוחד של 384. לאחר 24 שעות, השתמש במפעיל נוזלי כדי להוסיף 0.04 מיקרוליטרים של פתרונות סוכן בדיקה מ -10 דילולים סדרתיים בטווחי ריכוז סופיים של 20 מיקרומולר עד 1.0 ננומולר בבארות, ולדגירה על הצלחת במשך שישה ימים.בסוף הדגירה, להוסיף ATP תאי מדידת ריאגנט בבארות הבדיקה. השתמש במיקסר כדי לערבב את התוכן של הצלחת ודגורת הצלחת במשך 10 דקות בערך 25 מעלות צלזיוס. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את תוכן ה- ATP התאי כלומינציה.לאחר 24 שעות של המעבר השלישי, למקם 384-טוב סופרואיד חיבור מיקרו-plate עם 40 microliters של בינוני לכל טוב, צלחת יעד על מערכת לקטוף התא והדמיה. לבנות את תא הקטיף עם שישה מיליליטר של בינוני תרבות צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים G במשך שתי דקות כדי להסיר את בועות האוויר. מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של השעיית אורגנויד הגידול בתא הקטיף, ומניחים את תא הקטיף על המערכת.אפשר לאשכולות התאים להתיישב בתחתית התא למשך דקה אחת לאחר הפיזור ולאחר מכן ליזום את סריקת התא. הגדר את גודל האיסוף ל- 140 עד 160 מיקרומטר במערכת לבחירה אוטומטית של אשכולות תאים. לאחר מכן, בדוק את האיכות של אשכולות התאים שנבחרו בתמונות הסרוקות והעבר 10 אשכולות תאים לבאר באמצעות עצות איסוף ללוח היעד.במחקר הנוכחי, ההשפעה של סוכנים אנטי סרטניים על organoid הגידול נגזר המטופל הוערך. הרגישות הגבוהה עבור כל סוכני נגדי הסרט צוין על ידי ערכי ריכוז מעכבי מקסימליים למחצה פחות משני מיקרומולר באזור מתחת לערכי העקומה פחות מ 282. להערכת ציטוטוקסיות תאית תלויה נוגדנים, נמדדה ציטוליזיס אחוז של אורגנוידים סרטניים בנוכחות שני נוגדנים שונים.אחוז הציטוליזה גדל עם הזמן. ללא הנוגדנים בשש שעות עם המשפיע ליחס תא היעד של אחד לאחד, הציטוליזה הגיעה ל -45%בעוד שביחס של שתיים לאחד, הציטוליזה הגיעה ל -70% התא הקטלני הטבעי מתווך ציטוליזיס באמצעות trastuzumab היה כ 60% במשפיע ליחס תא היעד של אחד לאחד, ו 80% ביחס של שניים לאחד בשש שעות. לעומת זאת, cetuximab היה מינון תלוי השפעה על תא הרוצח הטבעי בתיווך ציטוליזה.בריכוז הגבוה ביותר של cetuximab, 90%ציטוליזה נצפתה במשפיע ליחס תא היעד של אחד לאחד, ו 100%ציטוליזה נצפתה ביחס של שניים לאחד, המציין השפעה גבוהה של cetuximab. מערכת בדיקת תפוקה גבוהה המשתמשת באורגנוידים של גידול שמקורם במטופל עדיפה על הערכת סוכנים פוטנציאליים נגד סרטן ומציגה הזדמנויות להערכת תרופות והתקדמות ברפואה מותאמת אישית.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

רגישות גבוהה זיהוי של Micrometastases שנוצרו על-ידי Organoids Lentivirus transduced GFP תרבותי מגידול נגזר המטופל הגס

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

הקמה ואפיון של המעי הקטן נוירואנדוקרינים הגידול האנדוקרינית

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research

יצירת זוגות מודלים תואמים של PDX ו-PDX לחקר פרמקולוגיה של סרטן

Patient-derived tumor xenografts (PDXs) are considered the most predictive preclinical models, largely believed to be driven by cancer stem cells (CSC) ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

הקמה ותרבות של אורגנואידי שד שמקורם במטופל

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...