रोगी से व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड रोग की बेहतर प्रजनन क्षमता के साथ ट्यूमर ऊतक की वास्तुकला और कार्य को सही ढंग से पुन: रीकैपिटल करते हैं। इसलिए, कैंसर रोधी दवाओं के लिए एक रोगी की प्रतिक्रिया का इस मॉडल का उपयोग करके सही मूल्यांकन किया जा सकता है। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृति में बड़े समूहों के गठन के कारण इन-विट्रो उच्च थ्रूपुट परख प्रणाली या सेल विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त हैं।
इस तकनीक का उपयोग करते हुए आणविक लक्षित दवाओं के मूल्यांकन के लिए सरल और अधिक सटीक एचटीएस विकसित किया गया था। चूंकि ऑर्गेनॉइड संस्कृति 2D संस्कृति से बहुत अलग है, इसलिए कोई पहली बार में संस्कृति के बारे में भ्रमित महसूस कर सकता है, लेकिन ऑर्गेनॉइड के रूपात्मक परिवर्तनों का सावधानीपूर्वक पालन करना महत्वपूर्ण है। तरल नाइट्रोजन भंडारण से जमे हुए नीच को हटाने के बाद, धीरे से एक मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में रोगी से व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड उत्तेजित ।
पानी के स्नान से नीच निकालें और 70% इथेनॉल के साथ पोंछें। इसके बाद शीशी को बायोसेफ्टी कैबिनेट में रखें। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड को ऑर्गेनॉइड के लिए माध्यम युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
ट्यूमर ऑर्गेनॉइड और माध्यम को धीरे-धीरे पांच बार ऊपर और नीचे पिपटिंग करके मिलाने के लिए तीन मिलीलीटर ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें। अपकेंद्रित्र द्वारा ट्यूमर ऑर्गेनॉइड नीचे गोली। सुपरनेट को त्यागें और ट्यूमर ऑर्गेनॉइड गोली को ताजा माध्यम के पांच मिलीलीटर में फिर से खर्च करें।
ट्यूमर ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन को टी-25 फ्लास्क में ट्रांसफर करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। पहले पैसेज के एक हफ्ते के बाद ट्यूमर ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन को दो टी-25 फ्लास्क से दो सेंट्रलाइज ट्यूब्स में ट्रांसफर करें और सेंट्रलाइज करके ट्यूमर ऑर्गेनॉइड को नीचे ले जाएं । ट्यूमर ऑर्गेनॉइड गोली की मात्रा का अनुमान लगाएं और प्रति ट्यूब ताजा माध्यम के 2.5 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।
एक ट्यूब में ट्यूमर ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन पूल करें। पूल्ड सस्पेंशन को T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें 10 मिलीलीटर ताजा माध्यम और इनक्यूबेट ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर होता है । मध्यम परिवर्तन के 24 घंटे के बाद, एक सेल विखंडन और फैलाव एक फिल्टर धारक एक ७० माइक्रोमीटर जाल फिल्टर युक्त से सुसज्जित उपकरण का उपयोग कर ट्यूमर ऑर्गेनॉइड कीमा ।
10 बार ट्यूमर ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन के 15 मिलीलीटर पतला। 384-वेल अल्ट्रा लो अटैचमेंट स्फेरोइड माइक्रोप्लेट में पतला ट्यूमर ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन के 40 माइक्रोलीटर बीज के लिए सेल सस्पेंशन डिस्पेंसर का उपयोग करें। 24 घंटे के बाद, 20 माइक्रोमोलर से 1.0 नैनोमोलर की अंतिम एकाग्रता पर्वतमाला पर 10 सीरियल कमजोर पड़ने से परीक्षण एजेंट समाधान के 0.04 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए एक तरल हैंडलर का उपयोग करें, और छह दिनों के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के अंत में, परीक्षण कुओं में रीएजेंट को मापने वाले इंट्रासेलुलर एटीपी जोड़ें। प्लेट की सामग्री को मिलाने के लिए मिक्सर का उपयोग करें और लगभग 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। ल्यूमिनेसेंस के रूप में इंट्रासेल्युलर एटीपी सामग्री को मापने के लिए प्लेट रीडर का उपयोग करें।
तीसरे मार्ग के 24 घंटे के बाद, एक 384-अच्छी तरह से अल्ट्रा कम अटैचमेंट स्फेरोइड माइक्रोप्लेट रखें, जिसमें मध्यम प्रति मध्यम के 40 माइक्रोलीटर के साथ सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम पर एक गंतव्य प्लेट है। हवा के बुलबुले को हटाने के लिए दो मिनट के लिए 1, 500 बार जी पर संस्कृति माध्यम और अपकेंद्रित्र के छह मिलीलीटर के साथ उठा चैंबर का निर्माण करें। उठा कक्ष में ट्यूमर ऑर्गेनॉइड निलंबन के चार माइक्रोलीटर जोड़ें, और सिस्टम पर उठा चैंबर सेट करें।
सेल क्लस्टर को फैलाव के बाद एक मिनट के लिए कक्ष के तल पर बसने की अनुमति दें और फिर कक्ष स्कैनिंग शुरू करें। सेल क्लस्टर के स्वचालित चयन के लिए सिस्टम पर 140 से 160 माइक्रोमीटर तक पिकिंग आकार सेट करें। इसके बाद, स्कैन की गई छवियों पर चयनित सेल समूहों की गुणवत्ता की जांच करें और गंतव्य प्लेट में चुनने वाले सुझावों का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से 10 सेल क्लस्टर स्थानांतरित करें।
वर्तमान अध्ययन में मरीज से व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड पर कैंसर रोधी एजेंटों के प्रभाव का आकलन किया गया। सभी कैंसर रोधी एजेंटों के लिए उच्च संवेदनशीलता को 282 से कम वक्र मूल्यों के तहत क्षेत्र में दो माइक्रोमोलर से कम आधे अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता मूल्यों द्वारा इंगित किया गया था। एक एंटीबॉडी निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिकिटी मूल्यांकन के लिए, दो अलग एंटीबॉडी की उपस्थिति में ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के प्रतिशत साइटोलिसिस मापा गया था ।
समय के साथ प्रतिशत साइटोलिस बढ़ गया। एक-से-एक के सेल अनुपात को लक्षित करने के लिए प्रभावक के साथ छह घंटे में एंटीबॉडी के बिना, साइटोलिसिस 45% तक पहुंच गया, जबकि दो से एक के अनुपात में, साइटोलिसिस 70% तक पहुंच गया प्राकृतिक हत्यारा सेल मध्यस्थता साइटोलिसिस ट्रास्टुजुमाब का उपयोग करके एक-से-एक के सेल अनुपात को लक्षित करने के लिए प्रभावक पर लगभग 60% था, और 80% छह घंटे में दो के अनुपात में। इसके विपरीत, cetuximab प्राकृतिक हत्यारा सेल मध्यस्थता साइटोलिसिस पर एक खुराक निर्भर प्रभाव था ।
सेटुक्सीमैब की उच्चतम एकाग्रता पर, एक-से-एक के सेल अनुपात को लक्षित करने के लिए प्रभावक पर 90% साइटोलिसिस देखा गया था, और दो से एक के अनुपात में 100% साइटोलिसिस देखा गया था, जो सेटुक्सीब की उच्च प्रभावता को दर्शाता है। रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके एक उच्च थ्रूपुट परख प्रणाली संभावित कैंसर विरोधी एजेंटों का मूल्यांकन करने से बेहतर है और दवा मूल्यांकन और व्यक्तिगत चिकित्सा में प्रगति के अवसर प्रस्तुत करती है।
