환자 유래 종양 오르가노이드는 질병의 더 나은 재현성으로 종양 조직의 아키텍처와 기능을 정확하게 재구성합니다. 따라서, 항암제에 대한 환자의 반응은 이 모형을 사용하여 정확하게 평가될 수 있다. 종양 오르가노이드는 배양에서 큰 클러스터 형성으로 인해 체외 내 높은 처리량 분석 시스템 또는 세포 분석에 적합하지 않습니다.
이 기술을 사용하여 분자 표적 약물의 평가를 위해 간단하고 정확한 HTS가 개발되었습니다. 오르가노이드 배양은 2D 배양과 매우 다르기 때문에 처음에는 문화에 대해 혼란스러워할 수 있지만 오르가노이드의 형태학적 변화를 주의 깊게 관찰하는 것이 중요합니다. 액체 질소 저장에서 냉동 된 사악한 제거 한 후, 부드럽게 1 분 동안 섭씨 37도에서 수조에 환자 유래 종양 오르가노이드를 교반.
수조에서 사악한 것을 제거하고 70 %에탄올로 닦아냅니다. 그런 다음 바이알을 생물 안전 캐비닛에 놓습니다. 오가노이드에 대한 배지를 포함하는 15 밀리리터 튜브에서 종양 오르가노이드를 전달한다.
3 밀리 리터 전달 파이펫을 사용하여 종양 오르가노이드와 중간을 5 번 위아래로 피펫하여 부드럽게 혼합하십시오. 원심분리에 의한 종양 오르가노이드를 펠릿. 상체를 버리고 종양 오르가노이드 펠릿을 신선한 배지의 5 밀리리터에 재보냅니다.
종양 오르가노이드 현탁액을 T25 플라스크로 옮기고 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 첫 번째 통과 의 1 주일 후에, 2개의 T25 플라스크에서 종양 오르가노이드 현탁액을 2개의 원심분리관으로 옮기고 원심분리에 의하여 종양 오르가노이드아래로 펠릿을 전송합니다. 종양 오르가노이드 펠릿 볼륨을 추정하고 튜브 당 신선한 배지의 2.5 밀리리터에서 펠릿을 재중단합니다.
종양 오르가노이드 현탁액을 하나의 튜브에 풀. 풀링된 서스펜션을 10밀리리터의 신선한 매체를 포함하는 T75 플라스크로 옮기고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 24시간 중간 변화 후, 70마이크로미터 메쉬 필터를 함유한 필터 홀더가 장착된 세포 단편화 및 분산 기기를 사용하여 종양 오르가노이드를 다진다.
종양 오르가노이드 현탁액 15 밀리리터를 10회 희석시. 384웰 초저 부착 스페로이드 마이크로플레이트에서 희석종양 오르간형 현탁액의 40 마이크로리터를 종자하기 위해 세포 현탁액 디스펜서를 사용한다. 24시간 후, 액체 처리기를 사용하여 최종 농도 범위에서 10개의 시리얼 희석제에서 우물내 1.0 나노몰러에 1.0 나노몰러의 테스트 에이전트 용액0.04 마이크로리터를 추가하고 6일 동안 플레이트를 배양한다.
인큐베이션이 끝나면 시험 우물에 세포 내 ATP 측정 시약을 추가합니다. 믹서를 사용하여 접시의 내용을 혼합하고 약 섭씨 25도에서 10 분 동안 접시를 배양하십시오. 플레이트 판독기를 사용하여 세포내 ATP 콘텐츠를 발광으로 측정합니다.
제3통로24시간 후, 세포 피킹 및 이미징 시스템에 대상 플레이트뿐만 아니라 중간 크기의 마이크로리터 40마이크로리터가 있는 384웰 의 초저 부착 스페로이드 마이크로플레이트를 배치한다. 기포를 제거하기 위해 2 분 동안 1, 500 배 G에서 배양 배지 및 원심 분리기의 6 밀리리터와 따기 챔버를 구축 할 수 있습니다. 피킹 챔버에 종양 오르가노이드 서스펜션의 4 개의 마이크로 리터를 추가하고 시스템에 피킹 챔버를 설정합니다.
세포 클러스터가 분산 후 1분 동안 챔버 바닥에 정착한 다음 챔버 스캐닝을 시작할 수 있도록 합니다. 셀 클러스터의 자동 선택을 위해 시스템에서 피킹 크기를 140 내지 160 마이크로미터로 설정합니다. 다음으로, 스캔된 이미지에서 선택한 셀 클러스터의 품질을 확인하고 선택된 이미지를 선택판으로 따로 따로 사용하여 웰당 10개의 셀 클러스터를 전송합니다.
현재 연구에서는, 환자 유래 종양 오르가노이드에 대한 항암제의 효과를 평가했다. 모든 항암제에 대한 높은 민감도는 282 미만의 곡선 값 하에서 영역에서 2마이크로몰라 미만의 반 최대 억제 농도 값으로 나타났다. 항체 의존성 세포 세포 독성 평가를 위해, 2개의 상이한 항체의 존재에 종양 기관로이드의 % 세포용해를 측정했습니다.
백분율 세포는 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 1대1의 표적 세포비율을 대상으로 6시간 동안 항체가 없으면, 세포분석은 45%에 이르렀지만, 세포정수는 70%에 이르렀지만, 트라스투주맙을 이용한 세포세포를 매개한 세포세포는 1대 1, 80%의 세포비율을 표적으로 삼는 이펙터에서 약 60%였다. 대조적으로, cetuximab는 세포세포를 중재하는 자연적인 살인자 세포에 복용량 의존적인 충격이 있었습니다.
cetuximab의 가장 높은 농도에서, 90%세포분석은 1대 1의 표적 세포 비율을 대상으로 이펙터에서 관찰되었고, 100%세포분석은 2 대 1의 비율로 관찰되었고, 이는 cetuximab의 높은 효과성을 나타낸다. 환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하는 높은 처리량 분석 시스템은 잠재적인 항암제를 평가하는 데 우수하며 개인화된 의학에서 약물 평가 및 발전기회를 제공합니다.
