Patienten-härledda tumör organoider rekapitulera arkitekturen och funktionen av tumör vävnad exakt med bättre reproducerbarhet av sjukdom. Därför kan en patients svar på läkemedel mot cancer utvärderas noggrant med hjälp av denna modell. Tumör organoider är olämpliga för en in vitro hög genomströmning analys system eller cell analys på grund av stora kluster bildas i kultur.
Med hjälp av denna teknik utvecklades enkel och mer exakt HTS för utvärdering av molekylära riktade läkemedel. Eftersom den organoida kulturen skiljer sig mycket från 2D-kulturen kan man känna sig förvirrad över kulturen först, men det är viktigt att noggrant observera de morfologiska förändringarna av organoiderna. Efter att ha tagit bort den frusna avskyn från flytande kväve lagring, försiktigt agitera patienten-härledda tumör organoider i ett vattenbad vid 37 grader Celsius i en minut.
Ta bort avskyn från vattenbadet och torka av med 70% etanol. Placera sedan injektionsflaskan i biosäkerhetsskåpet. Överför tumörorganoiderna i ett 15 milliliter rör som innehåller mediet för organoider.
Använd en tre milliliter överföringspipette för att försiktigt blanda tumörorganoiderna och mediet genom att pipettera upp och ner fem gånger. Pellet ner tumör organoider genom centrifugering. Kassera supernatanten och återanvända tumör organoid pellet i fem milliliter färskt medium.
Överför tumörorganoid suspensionen till en T25-kolv och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Efter en vecka av den första passagen, överföra tumör organoid suspension från två T25 kolvar till två centrifugrör och pellet ner tumör organoider genom centrifugering. Uppskatta tumör organoid pellet volym och återanvända pelleten i 2,5 milliliter färskt medium per rör.
Poola tumörorganoid suspensionen i ett rör. Överför den poolade suspensionen till en T75-kolv som innehåller 10 ml färskt medium och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Efter 24 timmars medium förändring, färs tumör organoider med hjälp av en cellfragmentering och dispersion instrument utrustad med en filterhållare som innehåller ett 70 mikrometer mesh filter.
Späd 15 milliliter tumörorganoid suspension 10 gånger. Använd cellupphängningsdispensern för att så 40 mikroliter utspädd tumörorganoid suspension i en 384-well ultra låg fastsättning sfäroid mikroplatta. Efter 24 timmar, använd en vätskehanterare för att tillsätta 0,04 mikroliter testagentlösningar från 10 seriella utspädningar vid slutliga koncentrationsområden på 20 mikromolar till 1,0 nanomolar i brunnarna och inkubera plattan i sex dagar.
Tillsätt intracellulärt ATP-mätreagens i testbrunnarna i slutet av inkubationen. Använd en mixer för att blanda innehållet i plattan och inkubera plattan i 10 minuter vid cirka 25 grader Celsius. Använd en plattläsare för att mäta det intracellulära ATP-innehållet som luminiscens.
Efter 24 timmar av den tredje passagen, placera en 384-brunn ultralåg fastsättning sfäroid mikroplatta med 40 mikroliter medium per samt en destinationsplatta på cellplocknings- och bildsystemet. Bygg plockkammaren med sex milliliter odlingsmedium och centrifugera vid 1 500 gånger G i två minuter för att avlägsna luftbubblorna. Tillsätt fyra mikroliter av tumörorganoid suspension i plockkammaren och ställ in plockkammaren på systemet.
Låt cellklustren sätta sig längst ner i kammaren i en minut efter dispersion och starta sedan kammarskanningen. Ställ in plockstorleken på 140 till 160 mikrometer i systemet för automatisk val av cellkluster. Kontrollera sedan kvaliteten på de markerade cellklustren på de skannade bilderna och överför 10 cellkluster per brunn med hjälp av plocktips till målplattan.
I den aktuella studien bedömdes effekten av anti-cancermedel på den patient-härledda tumörorganoiden. Den höga känsligheten för alla cancerläkemedel indikerades av de halv maximala hämmande koncentrationsvärdena mindre än två mikromolar i området under kurvvärdena mindre än 282. För en antikroppsberoende cellulär cytotoxicitetsbedömning mättes procent cytolys av tumörorganoider i närvaro av två olika antikroppar.
Procenten cytolys ökade med tiden. Utan antikropparna vid sex timmar med effektor till mål cellförhållandet 1-till-1, cytolysen nådde 45%Medan i förhållandet mellan två och en, cytolysen nådde 70%Den naturliga killer cell medierad cytolys med trastuzumab var cirka 60%på effektor till mål cell förhållandet mellan en-till-en, och 80%på förhållandet mellan två och en vid sex timmar. Cetuximab hade däremot en dosberoende inverkan på den naturliga mördarcellen medierad cytolys.
Vid den högsta koncentrationen av cetuximab observerades 90% cytolys vid effektor till mål cellförhållandet 1-till-1, och 100% cytolys observerades i förhållandet mellan två och en, vilket indikerar hög effekt av cetuximab. Ett högt genomströmningsanalyssystem med patient-härledda tumörorganoider är överlägsen att utvärdera potentiella anti-cancermedel och presenterar möjligheter för läkemedelsbedömning och framsteg inom personlig medicin.