Name: isolation of uterine innate lymphoid cells for analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-10-14T13:30:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

نشكر أعضاء الفريق السابقين والحاليين الذين ساعدوا في تطوير هذه الطريقة، بما في ذلك جان مارك دوسين ونورمان شريف وإيفا فيليبوفيتش وأنيتا كوالس. تم تمويل هذا البحث من قبل صندوق ويلكوم الاستئماني [رقم المنحة 200841/Z/16/Z] ومجلس البحوث الطبية (MR/P001092/1). ولغرض النفاذ المفتوح، طبق المؤلف ترخيصا عاما لحق المؤلف CC BY على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف ناشئة عن هذا التقديم.

<ol>
	<li>Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+code+of+pregnancy.">The immunological code of pregnancy.</a> Science. 365 (6456), 862-863 (2019).</li><li>Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+immunological+and+microbial+aspects+of+pregnancy.">The unique immunological and microbial aspects of pregnancy.</a> Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).</li><li>Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , (2014).</li><li>Filipovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definition+of+group+1+innate+lymphoid+cells+in+the+mouse+uterus.">Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus.</a> Nature Communications. 9 (1), 4492 (2018).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DBA-lectin+reactivity+defines+mouse+uterine+natural+killer+cell+subsets+with+biased+gene+expression.">DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression.</a> Biology of Reproduction. 87 (4), 81 (2012).</li><li>Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+NK+cells:+active+regulators+at+the+maternal-fetal+interface.">Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).</li><li>Gaynor, L. M., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells:+Functional+distinctions+and+influence+on+pregnancy+in+humans+and+mice.">Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice.</a> Frontiers in Immunology. 8, 467 (2017).</li><li>Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells.">Uterine natural killer cells.</a> Frontiers in immunology. 10, 960 (2019).</li><li>Wilkens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+NK+cells+regulate+endometrial+bleeding+in+women+and+are+suppressed+by+the+progesterone+receptor+modulator+asoprisnil.">Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil.</a> The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).</li><li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+&#947;+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification,+decidual+integrity,+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy.">Interferon &#947; contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface.">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li><li>Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+direct+hemochorial+placentation+by+regulating+hypoxia-inducible+factor+dependent+trophoblast+lineage+decisions.">Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).</li><li>Crespo, &. #. 1. 9. 4. ;. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+transfer+granulysin+to+selectively+kill+bacteria+in+trophoblasts.">Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts.</a> Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).</li><li>Shmeleva, E. V., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+natural+killer+cells+at+the+intersection+between+reproduction+and+mucosal+immunity.">Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity.</a> Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).</li><li>Kather, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neither+lymphotoxin+alpha+nor+lymphotoxin+beta+receptor+expression+is+required+for+biogenesis+of+lymphoid+aggregates+or+differentiation+of+natural+killer+cells+in+the+pregnant+mouse+uterus.">Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus.</a> Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).</li><li>Croy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 612, 465-503 (2010).</li><li>Vander lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.+II.">Spontaneous pseudopregnancy in mice. II.</a> Acta Physiologica et Pharmacologica Neerlandica. 5 (2), 213-215 (1956).</li><li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male.">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+(second+edition).">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Licensing+of+natural+killer+cells+by+host+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules.</a> Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2009).</li><li>Doisne, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition,+development,+and+function+of+uterine+innate+lymphoid+cells.">Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells.</a> Journal of Immunology. 195 (8), 3937-3945 (2015).</li><li>Peel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+GMG+Cells.">Fate of GMG Cells.</a> Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, (1989).</li><li>Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells:+a+specialized+differentiation+regulated+by+ovarian+hormones.">Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones.</a> Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).</li><li>Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+receptor+repertoire+in+mouse+uterine+NK+cells.">Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells.</a> Journal of Immunology. 181 (9), 6140-6147 (2008).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه ولا تضارب في المصالح.

يحتوي الأسلوب على عدة خطوات هامة تمت مناقشتها فيما بعد. الخطوة الحرجة الأولى هي الحصول على حالات حمل متزامنة متعددة مع تغير التردد النسبي لتجمعات الكريات البيض من خلال الحمل. وجود سدود متعددة في نفس اليوم الحملي يسمح إما بتكرار البيولوجية في نفس التجارب أو تجميع الخلايا الليمفاوية من السدود الفردية للحصول على أعداد أكبر المطلوبة لتطبيقات المصب. يسمح التزاوج الميزن للباحث بتحديد الحمل في غضون فترة 24 ساعة. على الرغم من أن الفئران تعيش لمدة 2.5 سنة تقريبا ، إلا أنها ستكون في سن الإنجاب من 4-7 أسابيع حتى 6-8 أشهر. وبما أن الفئران الأصغر سنا تنتج عادة جروا أصغر ، فإن الفئران الأنثوية لا تتزاوج بشكل عام حتى تتراوح بين 6-8 أسابيع ، والفئران الذكور حتى تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع. وبالنظر إلى أن estrus يستمر حوالي 15 ساعة في الفئران ويحدث كل 4-5 أيام، ومعدل التزاوج نموذجية (كشفت عن طريق المكونات المهبلية، انظر الشكل 4) حوالي 25٪. ولذلك من المهم استخدام الفئران في estrus والتخطيط لأعداد كافية للحصول على العدد المطلوب من السدود لتجربة معينة. يمكن تحديد مرحلة دورة استروس عن طريق مسحة المهبل cytology22. يمكن تحسين معدل التوصيل عن طريق راحة الذكور 48 ساعة قبل التزاوج والاستفادة من تأثير وايتن18. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يدير مصل الفرس الحوامل، الذي يحاكي تأثير هرمون تحفيز الجريبات الذاتية، مما يؤدي إلى نضوج البويضات، وبعد 42-50 ساعة، gonadotropin المشيمي البشري، الذي يحاكي تأثير هرمون اللوتين الذاتية، مما أدى إلى الإباضة. هذا العلاج الهرموني يتجاوز شرط استروس ويجعل تقريبا جميع الإناث المعالجة تقبلا.
وخطوة حاسمة ثانية هي ضمان جودة تلطيخ FACS. يجب دائما أن يتم تهزيم الأجسام المضادة المستخدمة في قياس التدفق الخلوي واستخدامها في التركيز الأمثل ، ومن الضروري التحقق من أن الهضم الأنزيمي لا يشق الأسطح المضادة الحيوية. لتقييم ما إذا كان الإنزيم سيلتصق بسطح الظهارة ، يمكن للمرء أن يلطخ جزأين من نفس العينة بالتوازي ، أحدهما يخضع للهضم الأنزيمي والآخر ميكانيكي. وبالمثل، فإن استخدام الضوابط المناسبة والبقع المفردة أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات موثوقة. بالنسبة للأحداث النادرة ، يمكن استخدام الخرز لتوليد عينات وصمة عار واحدة. من المستحسن عدم استخدام الخرز لإعداد الفولتية ولكن بدلا من ذلك مجموعة من الخلايا التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية وغيرها من الكريات البيض، مثل الخلايا الطحال. إذا تم استخدام الخرز ، فمن الضروري إعادة تنقية الأجسام المضادة لتلطيخ الخرز ، وبالتالي فإن كثافة الفلورية من الخرز الملون ستكون مماثلة لكثافة الفلورية للخلايا. في حالة وجود صعوبة في فصل الخلايا الإيجابية عن الخلايا السلبية لعلامة معينة ، يمكن أيضا استخدام عنصر تحكم FMO لتسهيل الإصابة بعلامة محددة. في حالة العلامات داخل الخلايا ، يجب استخدام عنصر تحكم متساوي النمط حيث قد يؤدي التلطيخ داخل الخلايا إلى أجسام مضادة متبقية غير منضمة ، والتي قد تكون موجودة داخل الخلايا بعد خطوات الغسيل وبالتالي تزيد من إشارة الخلفية. فمن المستحسن لتشغيل العينات في غضون 24 ساعة من تحديد الخلايا للحصول على أفضل النتائج في phenotyping بواسطة تحليل FACS، كما autofluorescence يزيد بشكل ملحوظ مع مرور الوقت وكثافة الفلورية لبعض الأجسام المضادة قد تنخفض مع مرور الوقت.
وثمة عامل حاسم آخر ينبغي النظر فيه هو التطبيق النهائي لتعليق الخلية الواحدة الذي تم الحصول عليه مع البروتوكول. بالنسبة للمقاايسات الوظيفية ، من الضروري العمل في ظروف معقمة. وبالمثل، لدراسات omics اللاحقة، من المهم أن تعمل في العقيمة وRNase، DNase وخالية من البروتياز.
البروتوكول المعروض هنا يركز على مجموعة phenotyping 1 ILCs ولكن يمكن تكييفها لphenotyping أنواع الخلايا الأخرى عن طريق تعديل لوحة الأجسام المضادة. من المستحسن أن يتم اختبار جميع الأجسام المضادة ضد هضم وتعليق الخلايا غير المهضومة للكشف عن فقدان / تغيير epitopes السطح عن طريق العلاج الأنزيمي. وبالمثل، يمكن استخدام إنزيمات مختلفة لهضم الأنسجة وزيادة إنتاجية الخلايا، ولكن يجب دراسة تأثيرها على الأسطح المضادة للجينات الحاسمة بعناية. في حين أن NKp46 هو علامة جيدة لخلايا NK الجنبي ويعمل في جميع سلالات الفئران المختبرية ، فإن التعبير عن NKp46 على خلايا uNK في فئران C57BL/6 أقل بكثير من خلايا NK الطحال. فمن الأفضل أن وصمة عار لكل من NK1.1 و NKp46 في وقت واحد. إذا كان يجب مقارنة أعضاء متعددة مباشرة ، فمن المستحسن علاج جميع العينات على قدم المساواة ، حتى لو لم يكن الهضم الأنزيمي مطلوبا للأنسجة مثل الطحال أو نخاع العظم. على الرغم من أن الطريقة المعروضة هنا تنطبق على الرحم غير الحامل ، فإن عزل حلقة الخلايا الليمفاوية بواسطة تدرج Percoll على مرحلتين سيكون صعبا ، وقد يكون عائد الخلايا المعزولة منخفضا جدا لتحليل FACS الموثوق به ، وبالتالي سيتطلب تجميع الخلايا المعزولة عن رحم الفئران الفردية غير الحامل23.
هناك قيود على البروتوكول للنظر في تفسير البيانات. كما هو الحال بالنسبة لجميع الأنسجة ، سيتم عزل الخلايا الليمفاوية المتداولة القادمة من الدم إلى جانب الخلايا المقيمة في الأنسجة. إذا كان استبعاد الخلايا الليمفاوية المتداولة ضروريا لتفسير البيانات ، فيمكن إجراء تلطيخ داخل الفيتية لتسمية الخلايا المتداولة. وعلاوة على ذلك، فإن القيد الثاني على البروتوكول هو أن بعض الخلايا سوف تضيع حيث لا يمكن استخراج جميع الخلايا من الأنسجة. يتم عرض المشاكل الأكثر شيوعا واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 2.
تاريخيا، اعتمدت دراسة الخلايا في الأنسجة على الفحص النسيجي لأقسام الأنسجة. يلخص استعراض ساندرا بيل الممتاز24 العمل المنجز على مدى أكثر من 100 عام حتى أواخر الثمانينيات. تظهر أوصاف الخلايا المعروفة فيما بعد باسم خلايا UNK في المخطوطات المنشورة قبل أكثر من نصف قرن من اكتشاف الخلايا الليمفاوية. لذلك، قبل اكتشاف خلايا NK في عام 1975، وقد أشير إلى خلايا UNK كخلايا الجليكوجين الأم أو خلايا الغدة الأذينية الحبيبية. قدمت آن كروي مساهمات كبيرة في هذا المجال25 وتكرمت بتعليم الفريق التشريح الذي قامت بتحسينه3 ، ويستخدم حاليا. على الرغم من أنه مفيد في وصف مورفولوجيا وموقع الأنسجة لخلايا UNK ، إلا أن الفحص النسيجي الكلاسيكي يقتصر على اكتشاف عدد قليل فقط من العلامات على الخلايا ذات الاهتمام. في عام 2008، وصفت طريقة تعتمد على قياس التدفق الخلوي للكشف في وقت واحد علامات متعددة على الخلايا الليمفاوية الرحمية26. هذا هو أساسا الأسلوب الذي تم وصفه في هذه الورقة. التكنولوجيات الحديثة مثل علم النسخ المكاني والتصوير عن طريق القياس الخلوي الشامل تجمع بين قوة علم الأنسجة وقياس التدفق الخلوي ، مما يسمح بالكشف المتزامن عن جينات أو بروتينات متعددة ، على التوالي ، والحفاظ على بنية الأنسجة الطبيعية.
تطبيقات الطريقة الموصوفة هنا متعددة وتشمل PHCS phenotyping ، المقايسة الوظيفية (مثل ELISPOT ، إزالة الرعي أو المقايسات السامة للخلايا) ، وفرز الخلايا ، وstoteomics اللاحقة أو البروتيوميات. وتشمل التطبيقات الأخرى التي يمكن تطويرها على أساس هذه الطريقة ثقافة وتوسيع خلايا NK البتية بعد فرز الخلايا أو التخصيب عن طريق الاستنفاد السلبي. حاليا، لا يوجد بروتوكول لثقافة وتوسيع خلايا UNK الماوس والحفاظ على صلاحيتها ووظائفها لفترة طويلة، بطريقة مماثلة لخلايا NK الإنسان التي يمكن زراعتها وتوسيعها لمدة 7-14 يوما بإضافة IL-2 أو مزيج IL-12 و IL-15. ومن شأن تحسين طريقة من هذا القبيل لخلايا uNK الماوس توفير المزيد من المرونة عند إجراء المقايسات الوظيفية والسماح لظروف متعددة لاختبار مع عدد أكبر من الخلايا. من ناحية أخرى ، من المعروف أن ظروف الثقافة تعدل النمط الظاهري الفريد من الخلايا الليمفاوية وربما وظيفتها أيضا.

وصف هنا هو وسيلة بسيطة للحصول على غلة عالية من الخلايا الليمفاوية الفطرية الرحم من الرحم الحامل الفردية. تحافظ هذه الطريقة على التعبير السطحي البروتيني ووظائف الخلايا الليمفاوية الفطرية الرحمية وهي مناسبة للتطبيقات اللاحقة مثل PHCS phenotyping أو RNAseq أو proteomics أو المقايسات الوظيفية. هنا ، يتم التركيز على phenotyping من uILCs المجموعة 1 عن طريق قياس التدفق الخلوي.
يتكون الرحم من ثلاث طبقات: بطانة الرحم، والميوميتريوم، والقبة المحيطة (الشكل 1). بطانة الرحم هي الغشاء المخاطي ، بطانة تجويف الرحم. البروجسترون، التي تنتجها اللوتيوم كوربوس، يحول بطانة الرحم إلى decidua. ويتكون الميومتريوم من طبقتين من العضلات الملساء التي تشكل جدار الرحم. وperpermetrium هو serosa الذي يلف الرحم ويربطه إلى الصفاق من خلال الرباط العريض يسمى mesometrium. في مقطع عرضي من الرحم ، يسمى الجزء المقابل للتشحيم الجانب الماوسومي ، في حين يسمى الجزء القريب من التجويف الجانب المضاد للسموم الصناعي. مجموعة متنوعة من الكريات البيض الأمومية تملأ بطانة الرحم والبت، بما في ذلك عدة أنواع من الخلايا، حيث تمثل الخلايا المناعية الفطرية الغالبية العظمى من الخلايا. الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILCs) ، الضامة ، الخلايا التشعبية (DC) ، وكذلك الخلايا الليمفاوية CD4 + و CD8 + T ، الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ، والخلايا B النادرة ، قد تلعب جميعها أدوارا مهمة في تنظيم بيئة الرحم طوال فترة الحمل1،2. توجد ILCs في الرحم ليس فقط في الغشاء المخاطي ، ولكن أيضا في الميوميتريوم في الفئران. بما في ذلك جميع المجموعات الثلاث من ILCs ، الرحم هو في الواقع الجهاز الأكثر كثافة سكانية من قبل المجموعة 1 ILCs. ومع التحول الهيكلي لأنسجة الرحم طوال فترة الحمل، يتغير أيضا عدد ونسبة الكريات البيض الرحمية (انظر الشكل 2 ألف للحصول على مثال على الاختلافات في النسبة المئوية للمجموعة 1 من مجموعات UILC الفرعية)3،4.
عندما يشار إلى الفئران في هذه الورقة ، فإن سلالة C57BL/6 من فئران المختبر الأصيلة مقصودة. وغالبا ما تستخدم الفئران الأصيلة (مثل فئران NMRI) في البحوث الإنجابية بسبب ارتفاع معدل الإنجاب. ومع ذلك ، فإن استخدام السلالات الأصيلة ضروري لتوليد نتائج متسقة ، والخلفية الوراثية المفضلة لدى أخصائي المناعة هي C57BL /6 ، المعروفة أيضا باسم B6.
ما يقرب من 30٪ من الكريات البيض الرحمية في سدود B6 في منتصف الحمل هي g1 uILCs، والتي يتم تعريفها عن طريق قياس التدفق الخلوي على أنها قابلة للحياة CD45 + CD3-CD19-NK1.1 + NKp46 + الخلايا (الشكل 2B): NK المؤيدة للأنسجة الوعائية (trNK)، IFN-g المنتجة التقليدية NK (cNK)، وuILC14،5. النسبة المئوية لخلايا uNK أعلى من ذلك في البشر ، لتصل إلى حوالي 70٪ في الثلث الأول من الحمل6. هناك أوجه تشابه أكثر من الاختلافات بين uNK الإنسان والفأر وuILC7،8. على الرغم من أنه من المهم أن نضع الاختلافات في الاعتبار، فمن المفيد دمج المعلومات المتاحة عن هذين النوعين. عندما يجمع المرء بين المعلومات التي تم الحصول عليها من التحقيق uILC في البشر والقوارض المختبرية، فمن الواضح أن خلايا NK تساعد في التغيرات الهلوسة ضرورية لبيولوجيا الرحم، بما في ذلك الحفاظ على سلامة الشرايين9 وإعادة عرض الشرايين الحلزونية10، فضلا عن غزو الأرومة التروبوست11،12. كما أنها تلعب أدوارا محددة في الدفاع ضد مسببات الأمراض13,14. في الفئران والجرذان ، إلى جانب ملء decidua حول موقع الزرع ، تتراكم خلايا NK بين طبقتي العضلات في عضلة السدود في بنية عابرة تعرف باسم مجموع الليمفاوية الميكومياضية للحمل (MLAp)15 (الشكل 1B) ، المعروف أيضا في الماضي باسم الغدة الأذينية ، والتي لم يتم اكتشاف وظيفتها بعد.
وصف هنا هو بروتوكول مفصل للطريقة المستخدمة في المختبر لعزل الخلايا الليمفاوية من رحم الفئران الحامل باستخدام مزيج من التصنيف الميكانيكي والهضم الأنزيمي. كما يتم استخدام الرحم كله في هذه الطريقة، الخلايا الليمفاوية معزولة عن الرحم أثناء الحمل هي مزيج من الخلايا العضلية والبتية. مزيد من تشريح decidua من جدار الرحم وMLAp لها من الممكن، وقد وصفت قبل16. تم تطوير الطريقة الموصوفة هنا للحصول على الخلايا الليمفاوية الرحمية مع الحفاظ على التعبير السطحي البروتيني ، والوظائف الخلوية ، والجدوى. والنتيجة هي تعليق خلية واحدة مع الحد الأدنى من الحطام الخلوي المتبقي وعائد يتراوح عادة بين 1-5 ملايين خلية في منتصف الحمل (10.5 أيام) للرحم الحامل. وتشمل تطبيقات هذه الطريقة phenotyping عن طريق قياس التدفق الخلوي، وفرز الخلايا للدراسات النسخية اللاحقة أو البروتيوميك، والدراسات الوظيفية مثل إنتاج السيتوكين داخل الخلايا، والتخلص من التخثر، ELISPOT أو المقايسات السامة للخلايا. ويركز البروتوكول المعروض هنا على تحديد مجموعات 1 ILCs ولكن يمكن تكييفها لأنواع الخلايا الأخرى مثل ILCs الأخرى، والخلايا التائية، والخلايا B، والعاصمة، أو الضامة مع تعديلات طفيفة على لوحة الأجسام المضادة المستخدمة لتحليل FACS. ويمكن أيضا أن يستخدم البروتوكول لعزل الخلايا من الأنسجة الأخرى وتجمع الرحم غير الحوامل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>562701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>562600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49a antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>740262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche (Sigma)</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOMES antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4875-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block Trustain fcx</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10217-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche (Sigma)</td>
			<td>5401089001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer Pharmlyse</td>
			<td>BD</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKp46&#160; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>137608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14030-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 medium + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Violet Fixable Viability dye</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of uterine innate lymphoid cells for analysis by flow cytometry

وصف هنا هو وسيلة بسيطة لعزل والنمط الظاهري مجموعة الماوس 1 الرحم الخلايا اللمفاوية الفطرية (g1 uILCs) من الرحم الحامل الفردية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يصف البروتوكول كيفية إعداد التزاوج الزمني للحصول على سدود متزامنة متعددة ، والهضم الميكانيكي والإنزيمي للرحم الحامل ، وتلطيخ تعليق الخلية الواحدة ، واستراتيجية FACS لظاهرة والتمييز g1 uILCs. على الرغم من أن هذه الطريقة تفقد حتما المعلومات المكانية للتوزيع الخلوي داخل الأنسجة ، فقد تم تطبيق البروتوكول بنجاح لتحديد عدم التجانس uILC ، واستجابتها لعوامل الأم والجنين التي تؤثر على الحمل ، وملف التعبير الجيني ، ووظائفها.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

هذه طريقة لعزل الخلايا اللمفاوية الرحمية عن الفئران الحامل وغير الحامل على حد سواء. يمكن استخدام هذه الطريقة لتطبيقات المصب متعددة مثل phenotyping FACS، وفرز الخلايا، والمقاايسات الوظيفية، RNA-seq، وبروتيوميكس. يوضح البروتوكول هنا كيفية النمط الظاهري للمجموعة 1 خلايا الرحم اللمفاوية الفطرية عن طريق قياس التدفق الخلوي.

عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية الرحمية للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

تمكن طريقتنا من تقييم تكوين الخلايا الليمفاوية المختلفة والخصائص الوظيفية لها الموجودة في نسيج الرحم للحيوانات الحامل وغير الحامل. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا الليمفاوية الرحمية مع الحفاظ على التعبير السطحي عن البروتين وقابلية الخلية للحياة والوظائف. ولذلك فهي مناسبة لمجموعة من التطبيقات اللاحقة.إزالة الجنين في بداية التجربة وجمع الكريات البيض هي خطوات صعبة من الناحية الفنية. نظرا لأنها تجربة طويلة ، ف هناك حاجة إلى اهتمام وتركيز خاصين بمجرد وصولك إلى خطوات تلطيخ الجسم المضاد. للبدء، نقل أنسجة الرحم حصادها من حامل C57 أسود ستة فأر أنثى في طبق بتري عقيمة، ثم باستخدام أدوات معقمة إزالة بلطف الدهون المحيطة الأنسجة، مع الحرص على عدم السماح للأنسجة الجافة.قم بإزالة الأجنة عن طريق تشريح كل موقع زرع بأدوات معقمة، ثم أعد الرحم إلى أنبوب جمعه الأصلي الذي يحتوي على ملليلتر واحد من وسائط التجميع. باستخدام مقص، فرم الأنسجة في أنبوب جمع، ثم وضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية. إضافة ثلاثة ملليلترات من مزيج الهضم الأنزيمي قبل تسخينها إلى الأنبوب.احتضان الأنبوب لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية مع التحريض لتعزيز نشاط الهضم الأنزيمي. بعد اكتمال الحضانة ، دوامة الأنبوب ، وإبقائه على الجليد لمنع النشاط الأنزيمي ، ثم نقل الأنسجة الهضمية إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر المسمى بشكل صحيح. شطف أنبوب جمع خمسة ملليلتر مع ما مجموعه 10 ملليلتر من الجليد الباردة خمسة ملليمولار EDTA PBS الحل لجمع جميع الأنسجة المتبقية ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.الطرد المركزي عينة الأنسجة المهضومة لمدة 10 دقائق في 400 مرة G.Discard العملاقة، نفض الغبار بلطف بيليه، ومن ثم إعادة إنفاقها في 10 ملليلتر من قبل تسخينها خمسة ملليمولار EDTA PBS الحل. للحد من تكتل الخلايا، واحتضان العينة في 37 درجة مئوية مع التحريض، تليها دوامة على ارتفاع لمدة 10 ثانية. لإزالة كتل الخلايا في الأنسجة غير المرتبطة، ضع مصفاة 70 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي معقم 50 ملليلتر، ثم باستخدام المكبس من حقنة معقمة ملليلتر واحد، يجبر الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة في الأنبوب.غسل مصفاة عدة مرات مع ما مجموعه 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة لجمع جميع الخلايا، ثم قضاء أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر لمدة 10 دقائق في 400 مرة G.After التخلص من supernatant، قد يتم عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية باستخدام الخيار A أو الخيار B.For A، resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من 80٪ متساوي التوتر لكل مكالمة باستخدام صوت ماصة. ثم باستخدام المصصة voy على سرعة بطيئة، تراكب بعناية ثمانية ملليلتر، 40٪ لكل حل الدعوة، على بيليه resuspended في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. ماصة ببطء وباستمرار، عقد 15 ملليلتر إلى حوالي زاوية 45 درجة.دون إزعاج التراكب ، طارد مركزي الأنبوب لمدة 20 دقيقة بمعدل 850 مرة G مع تسارع متوسط وفواصل دنيا في درجة حرارة الغرفة. بمجرد اكتمال الطرد المركزي، قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي دون إزعاج طبقات كل مكالمة. المقبل دون إزعاج حلقة من الكريات البيض في واجهة اثنين لكل حل الدعوة، واستخدام ماصة البستر العقيمة لتجاهل جميع ما عدا 0.5 إلى ملليلتر واحد من أعلى لكل طبقة الدعوة.أثناء محاولة الحفاظ على كمية محلول كل مكالمة امتص في ماصة إلى أدنى حد ممكن، وجمع بعناية حلقة الكريات البيض، ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي جديد المسمى 15 ملليلتر. إضافة 10 ملليلتر من المتوسط RPMI المعقمة تكملها 10٪ الحرارة وتنشيط FBS إلى الخلايا، ثم الطرد المركزي الخلايا لمدة خمس دقائق في 500 مرة G وأربع درجات مئوية. تجاهل supernatant والمضي قدما في تحلل خلايا الدم الحمراء.لعزل الخلايا باستخدام الخيار B، بعد تمرير الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة الخلية والطرد المركزي النتيجة في تعليق الخلية كما هو موضح سابقا، إعادة إنفاق بيليه مع ثمانية ملليلتر من 35٪ متساوي التوتر لكل مكالمة والمتوسطة RPMI، ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر. طرد مركزي الأنبوب في 940 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تسارع متوسط والحد الأدنى من فترات الراحة. ثم باستخدام aspirator أو مصصة فوي، يستنشق supernatant بعناية قبل إعادة تعليق بيليه في 14 ملليلتر من المتوسط RPMI تكملها مع 10٪ الحرارة وتنشيط FBS.طرد مركزي العينة مرة أخرى لمدة خمس دقائق في 500 مرة G وأربع درجات مئوية، ثم تجاهل supernatant عن طريق الطموح والمضي قدما في تحلل خلايا الدم الحمراء. لإحليل خلايا الدم الحمراء، وإعادة إنفاق العينة في ثلاثة ملليلترات من محلول واحد س خلايا الدم الحمراء الليسينج واحتضان لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في العينة لوقف رد الفعل. الطرد المركزي الأنبوب في 400 مرة G لمدة خمس دقائق بعد التخلص من supernatant، إضافة 10 ملليلتر آخر من برنامج تلفزيوني وتكرار المركزية.Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من المتوسطة RPMI تكملها مع 10٪ الحرارة تعطيل FBS، ثم تمرير تعليق في الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر معقمة. بعد عد الخلايا ضبط تركيز تعليق الخلية إلى 1-2 مليون خلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني والمضي قدما في تلطيخ وتحليل الفاكس. وتشمل مجموعة الرحم واحدة ILCs خلايا NK التقليدية، خلايا NK المقيمين في الأنسجة، ومجموعة واحدة ILCs مع نسبها المئوية متفاوتة خلال الحياة والحمل.يمكن التمييز بين هذه المجموعات الفرعية باستخدام قياس التدفق الخلوي عن طريق الخلايا الأولى على قدرتها على تشتت الضوء ، ثم عزل قرص مضغوط واحد قابل للشراء 45 CD إيجابي ثلاث خلايا سلبية CD 19 سلبية ، ومن ثم تحديد المجموعة الأولى ILCs التي هي NK 1.1 و NKP 46 إيجابية. ضمن المجموعة الأولى ILCs، CD49A EMs سالبة إيجابية هي خلايا NK التقليدية. CD49A إيجابي Ems الخلايا الإيجابية هي خلايا NK المقيمين في الأنسجة.وCD49 إيجابي Ems الخلايا السلبية هي مجموعة واحدة ILCs الرحم. تلطيخ الخلايا الليمفاوية الجنبية والرحمية مع المضادة NK P46 والأجسام المضادة NK 1.1 يظهر أن الخلايا الليمفاوية الجنبية التعبير عن كميات أعلى من NKP 46 على سطحها من نظيرتها الرحمية. في فص الأنسجة الأنزيمية، يمكن تغيير الأسطح السطحية اعتمادا على الإنزيمات المستخدمة في وسيط الهضم.على سبيل المثال، تلطيخ لمستقبلات MHC CD49 NKG2A ضعيف عند استخدام liberase TM. ومع ذلك الهضم مع liberase DH يحافظ على الاعتراف NKG2A من قبل استنساخ الأجسام المضادة 1611. حوالي 6.5٪ من المجموعة الأولى ILCs الموجودة في عينات أنسجة الرحم في يوم الحمل 8.5 هي مشتقة من الدم.يمكن استبعاد ملوثات الدم من خلال تلطيخ داخل الجسم مع الأجسام المضادة CD45 المقترنة بالفلوروشروم. عند الإعداد للاجتماعات الزمنية، يجب أن تأخذ بعين الاعتبار أن الفئران ليلية. ولذلك ينبغي إعدادها في وقت متأخر قدر الإمكان في فترة ما بعد الظهر كما سيحدث التزاوج خلال الليل.أيضا عند اختيار الإناث، يجب التأكد من أنها لم يكن لديك الحاجز المهبلي. نحن عادة ما نقوم بتحليل قياس التدفق الخلوي للنظر في العديد من البروتينات على السطح الخارجي للخلايا وداخل الخلايا. نقوم أيضا باستخراج الحمض النووي لدراسة التعبير الجيني، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي.ونحن أيضا لا يتمكن من حول المقايسات الوظيفية لدراسة استجابات الخلايا الليمفاوية الفطرية الرحم.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

عزل الخلايا أحادية النوى اللوزتين لدراسة استجابات المناعة الفطرية Ex Vivo في الأنسجة اللمفاوية المخاطية البشرية

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

عزل الماوس الكلى المقيم CD8+ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...