Name: isolation of uterine innate lymphoid cells for analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-10-14T13:30:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Agradecemos aos membros anteriores e atuais da equipe que ajudaram a desenvolver esse método, incluindo Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic e Anita Qualls. Esta pesquisa foi financiada pelo fundo Wellcome [Número de subvenção 200841/Z/16/Z ] e pelo Conselho de Pesquisa Médica (MR/P001092/1). Para fins de acesso aberto, o autor solicitou uma licença de direitos autorais pública CC BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão.

Todos os experimentos em animais descritos neste artigo foram conduzidos de acordo com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) de 1986 sob PP2363781 emitida pelo Ministério do Interior do Reino Unido. O protocolo abaixo consiste em várias seções a partir da criação de camundongos e acabamento com coloração para análise FACS. A Figura 3 reflete os principais passos do protocolo. Os materiais utilizados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Pecuária geral de ratos, acasalamento e dissecção
<ol><li>Mantenha camundongos fêmeas de 7 a 14 semanas sob condições específicas sem patógenos (SPF) e agrupados (tipicamente 4-6 fêmeas de acordo com o tamanho da gaiola e peso animal), por 10-14 dias para desencadear o efeito Lee-Boot, que resulta em sincronização estrus17.</li>
	<li>Mantenha os machos de garanhão em condições de FPS, sozinhos, e descansado por pelo menos 48 h entre cada acasalamento (tempo para regeneração de esperma). É preferível usar machos experientes de 3 a 4 meses de idade, pois eles são tipicamente mais performáticos do que os jovens.</li>
	<li>Para aumentar a probabilidade de as fêmeas engravidarem, introduza a roupa de cama suja da gaiola masculina na gaiola feminina 3 dias antes do acasalamento. Isso desencadeia o efeito Whitten18 por exposição a feromônios de urina masculino, e resulta em estrus sincronizados, bem como maior receptividade para acasalamento.</li>
	<li>No dia 0 (D0), configure os ratos para acasalamento usando um macho de garanhão por duas fêmeas; considerar uma taxa de plug de aproximadamente 20%-25%. NOTA: O acasalamento provavelmente ocorrerá à noite, já que os ratos são animais noturnos.</li>
	<li>Pela manhã seguinte ao acasalamento (D0.5), verifique a presença de um plugue vaginal, que é um indicador de cópula (Figura 4). O plugue vaginal é um agregado da ejaculação masculina e normalmente persiste por até 8-24 h após o acasalamento. Verifique os plugues de manhã cedo.</li>
	<li>Consolide as fêmeas plugadas em uma nova gaiola e as destine. Devolva os machos para suas gaiolas para descansar.</li>
	<li>Em D9.5 ou 10,5 após o acasalamento, prepare tubos de 5 mL com HBSS 1x estéreis de 1 mL (com Mg2+ e Ca2+) para coleta de tecidos e coloque-os no gelo.</li>
	<li>Prossiga para a eutanásia animal por deslocamento cervical, seguido de exsanguinação para confirmar a morte.</li>
	<li>Trabalhe em um ambiente estéril se a aplicação a jusante exigir fazê-lo. Logo após a eutanásia, limpe o corpo do rato com 70% de etanol e prossiga para dissecção sob um gabinete de fluxo laminar com instrumentos estéreis.</li>
	<li>Dissecar o útero gestante livre de gordura mesometrial (Figura 5) e colocar todo o útero em um tubo preparado e devidamente rotulado de 5 mL. Mantenha os tubos no gelo.</li>
</ol>2. Digestão mecânica e enzimática do útero
<ol><li>Para preparar a solução de digestão enzimática, misture 3 mL por útero de HBSS estéril 1x com 30 μg/mL de DNAse e 0,1 unidade Wünsch (WU)/mL de Liberase DH ou 0,52 WU/mL de Liberase TM. Coloque a solução em um banho de água a 37 °C. NOTA: Pode-se utilizar o DH Liberase TM e a Liberase DH. A escolha de um sobre o outro deve ser guiada pelo seu potencial efeito sobre os epítopos reconhecidos por anticorpos utilizados para análise subsequente da citometria de fluxo. ATENÇÃO: Se usar enzimas liofilizadas, trabalhe sob o capô.</li>
	<li>Prepare 20 mL de 5 mM EDTA em PBS (sem Ca2+/Mg2+). Coloque metade da solução a 37 °C em um banho de água e a outra metade no gelo.</li>
	<li>Sob um armário de fluxo laminar, remova suavemente a gordura ao redor do útero grávida com instrumentos estéreis em uma placa de Petri estéril. Não deixe o tecido secar.</li>
	<li>Disseque cada local de implantação com instrumentos estéreis para remover os fetos (estrutura translucida em forma de cavalo marinho, cerca de 1 mm de comprimento) (Figura 6A). Descarte os fetos.</li>
	<li>Devolva o útero à sua coleção original de tubo de 5 mL e pique o tecido usando tesouras diretamente no tubo de 5 mL e meio de coleta. Mantenha os tubos no gelo o tempo todo entre os procedimentos.</li>
	<li>Coloque os tubos de 5 mL contendo o tecido picado em um banho de água a 37 °C.</li>
	<li>Adicione 3 mL de mistura de digestão enzimática quente a cada amostra de modo que o volume total de líquido no tubo seja de 4 mL (1 mL de meio de coleta com o útero picado e 3 mL de solução de digestão enzimática). Incubar os tubos de 5 mL por 30 min a 37 °C com agitação para melhorar a atividade de digestão enzimática.</li>
	<li>Vórtice os tubos de 5 mL e colocá-los no gelo para inibir a ação de enzimas. Em seguida, transfira o conteúdo para tubos de centrífugas de 15 mL devidamente rotulados.</li>
	<li>Jogue tudo fora dos tubos de 5 mL nos tubos de centrífugas de 15 mL usando 10 mL de solução EDTA PBS gelada de 5 mM.</li>
	<li>Centrifugar os tubos de centrífugas de 15 mL contendo os tecidos digeridos por 10 minutos a 400 x g.</li>
	<li>Descarte o supernasce, aperte suavemente a pelota e, em seguida, resuspensá-la em 10 mL de solução quente (37 °C) 5 mM EDTA PBS.</li>
	<li>Incubar as amostras nos tubos de centrífugas de 15 mL a 37 °C com agitação por 15 minutos para remover o meio de digestão que sobrou e reduzir a aglomeração celular.</li>
	<li>Vórtice as amostras em alta para 10 s para facilitar ainda mais a dissociação tecidual.</li>
</ol>3. Processamento do útero em uma única suspensão celular
<ol><li>Usando o êmbolo de uma seringa estéril de 1 mL, force o tecido digerido através de um coador de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL devidamente rotulado e estéril para remover os aglomerados celulares e o tecido não dissociado.</li>
	<li>Lave o coador várias vezes com um total de 10 mL de PBS frio para coletar todas as células.</li>
	<li>Gire o tubo de centrífugas de 50 mL por 10 min a 400 x g. NOTA: Execute as etapas adicionais usando a opção A ou a opção B. A opção A permite um melhor enriquecimento dos linfócitos com menos detritos e contaminação celular estrogonicamente do que a Opção B. No entanto, a Opção B dá um maior rendimento das células imunes devido à menor perda celular e menor variabilidade do rendimento celular entre as amostras. A opção B também é mais fácil de executar tecnicamente. Portanto, dependendo da preferência, proceda com a Opção A ou Opção B.<ol>
<li>Os passos para a Opção A são os seguintes.<ol>
<li>Rotule um tubo de centrífugo estéril de 15 mL por amostra contendo 5 mL de 80% (v/v) percoll isotônico diluído em PBS.</li>
			<li>Após o giro, descarte o supernatante do tubo centrífuga de 50 mL. Use um pipet boy para resuspensar cada pelota em 8 mL de 40% (v/v) percoll isotônico na PBS.</li>
			<li>Use um pipet boy em velocidade lenta para sobrepor cuidadosamente a pelota resuspended na solução Percoll de 40% em 80% solução Percoll. Pipeta devagar e continuamente; segure o tubo de 15 mL em um ângulo de 45° (Figura 6B).</li>
			<li>Sem perturbar a sobreposição, centrifugar os tubos de centrífugas de 15 mL por 20 minutos a 850 x g, em temperatura ambiente (aceleração média e quebra mínima).</li>
			<li>Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga sem perturbar as camadas de Percoll (Figura 6C).</li>
			<li>Sem perturbar o anel de leucócitos na interface das duas soluções Percoll, use uma Pipeta Pasteur estéril para descartar tudo, exceto aproximadamente 0,5-1 mL da camada percoll superior.</li>
			<li>Enquanto tenta sugar uma quantidade mínima de solução Percoll (até 4-5 mL total), coletar cuidadosamente o anel de leucócitos e transferir as células para um novo tubo de centrífuga de 15 mL rotulado.</li>
			<li>Cubra cada amostra com 10 mL de meio RMPI-1640 estéril complementado com 10% de FBS inativados pelo calor.</li>
			<li>Centrifugar por 5 min a 500 x g a 4 °C.</li>
			<li>Descarte o supernatante e prossiga para a lise RBC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Os passos para a Opção B são os seguintes.<ol>
<li>Rotule um tubo de centrífugo estéril de 15 mL por amostra.</li>
			<li>Após o giro, descarte o supernatante do tubo centrífuga de 50 mL. Use um pipet boy para resuspend cada pelota com 8 mL de 35% (v/v) percoll isotônico em meio RPMI-1640.</li>
			<li>Transfira as amostras para tubos de centrífugas de 15 mL.</li>
			<li>Centrifugar as amostras a 940 x g por 10 minutos em temperatura ambiente com aceleração média e quebra mínima.</li>
			<li>Aspire o supernatante cuidadosamente usando um aspirador ou pipeta (não invertendo o tubo).</li>
			<li>Resuspenque a pelota em 14 mL de RPMI-1640 médio suplementado com FBS inativado a calor de 10% e, em seguida, centrifugar a amostra a 500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
			<li>Descarte o supernatante por aspiração e prossiga para a lise RBC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4.RBC lysis
<ol><li>Para lise os RBCs, resuspenque as amostras em 3 mL de solução de 1x RBC e incubar por 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 10 mL de PBS nas amostras para parar a reação.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 400 x g por 5 min e descartar o sobrenante.</li>
	<li>Adicione 10 mL de PBS e repita o passo 4.3.</li>
	<li>Resuspenque cada pelota em 1 mL de RPMI-1640 médio suplementado com 10% de FBS inativados pelo calor.</li>
	<li>Passe as amostras através de filtros celulares estéreis de 70 μm.</li>
	<li>Realize a contagem de células usando azul trypan e uma Câmara de Neubauer de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Ajuste a concentração da suspensão celular para 1-2 milhões de células em 100 μL de PBS ou médio.</li>
</ol>5. Estratégia e controles de design de painel
NOTA: O painel descrito neste artigo é adequado para a discriminação de células uILC1, trNK e cNK e foi projetado para ser usado em um BD LSRFortessa de 5 lasers. Pequenas modificações podem ser feitas para estudar diferentes populações celulares e usar fluorocromes alternativos. Recomenda-se verificar a configuração do instrumento, utilizando anticorpos titulados para uma separação ideal, consultando o índice de brilho do fabricante e usando os corantes mais brilhantes para antígenos de baixa expressagem, como nKp46, e seguindo diretrizes gerais19. Recomenda-se incluir um controle de Fluorescência Minus One (FMO) para NKp46.
6. Coloração de células linfoides inatas para fenotipagem FACS
<ol><li>Transfira 1-2 milhões de células por poço em uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Gire a placa a 400 x g por 3 min a 4 °C e descarte o supernatante, sacudindo-a em uma pia.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas celulares em 100 μL de PBS (proteína e sem azida) usando uma pipeta multicanal. NOTA: Certifique-se de que o PBS não contém azida de sódio, nem Tris ou quaisquer proteínas para a etapa subsequente.</li>
	<li>Repita o passo 6.2.</li>
	<li>Células resuspend em 50 μL de corante de viabilidade fixável diluído em PBS (proteína e sem azida) (1:1.000). Incubar as células à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. NOTA: Certifique-se de que o PBS não contém azida de sódio, nem Tris ou quaisquer proteínas como FBS ou BSA, pois isso pode resultar em diminuição da intensidade de coloração de células mortas e/ou aumento da coloração de fundo para as células vivas. ATENÇÃO: Se a viabilidade do corante estiver em pó, use sob o capô.</li>
	<li>Adicione 150 μL de PBS, resuspense as células com uma pipeta multicanal e, em seguida, repita o passo 6.2.</li>
	<li>Resuspense as células em 25 μL de Tampão FACS (PBS complementado com 1% de BSA ou 2% FBS) contendo reagente de bloqueio do receptor Fc. Incubar as células por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 25 μL de um coquetel de anticorpos de superfície. NOTA: Sempre titule anticorpos e otimize o painel de anticorpos antes do experimento.</li>
	<li>Incubar as amostras à temperatura ambiente por 20 minutos no escuro.</li>
	<li>Adicione 150 μL de tampão FACS a cada poço, misture bem e, em seguida, repita o passo 6.2.</li>
	<li>Repita o passo 6.10. NOTA: Execute outras etapas usando a opção A ou a opção B. Use a opção A para colorar as células com marcadores de superfície. Use a opção B para estudar os marcadores intracelulares por citometria de fluxo.<ol>
<li>Os passos para a Opção A são os seguintes.<ol>
<li>Resuspenque as amostras em 100 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) por poço e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente. ATENÇÃO: Use PFA sob o capô. Consulte a folha de segurança para descartar resíduos/objetos PFA que entraram em contato com pfa (por exemplo, pipetas) com segurança.</li>
			<li>Repita o passo 6.2, duas vezes. ATENÇÃO: Não descarte ao mexer na pia aqui, pois contém PFA. Aspire com uma pipeta e descarte os resíduos conforme a folha de segurança.</li>
			<li>Resuspend as amostras em 200 μL de PBS.</li>
			<li>Transfira as amostras para tubos FACS rotulados e cubra com 100 μL de PBS. Mantenha os tubos no gelo ou em uma geladeira até que o processamento com a análise FACS. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo dentro de 24 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Os passos para a Opção B são os seguintes.<ol>
<li>Resuspenque as amostras em 100 μL de solução de fixação/permeabilização por poço (contendo paraformaldeído) e incubar por 20 min a 4 °C. ATENÇÃO: Use PFA sob o capô. Consulte a folha de segurança para descartar resíduos/objetos PFA que entraram em contato com pfa (por exemplo, pipetas) com segurança.</li>
			<li>Repita o passo 6.2. ATENÇÃO: Não descarte ao mexer na pia aqui, pois contém PFA. Aspire com uma pipeta e descarte os resíduos conforme a folha de segurança.</li>
			<li>Adicione 200 μL de 1x de permeabilização / tampão de lavagem, misture bem e, em seguida, repita o passo 6.2.</li>
			<li>Repita o passo 6.11.2.3.</li>
			<li>Resuspenha as células fixas e permeabilizadas em 50 μL de 1x permeabilização/tampão de lavagem contendo mistura de anticorpos para coloração intracelular.</li>
			<li>Incubar as amostras a 4 °C por 30 min no escuro.</li>
			<li>Adicione 200 μL de 1x solução de permeabilização/lavagem, misture bem e, em seguida, repita o passo 6.2.</li>
			<li>Repetia o passo 6.11.2.7.</li>
			<li>Resuspend as amostras em 200 μL de PBS.</li>
			<li>Transfira as amostras para tubos FACS rotulados e cubra com 100 μL de PBS. Mantenha os tubos no gelo ou em uma geladeira até que o processamento com a análise FACS. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo dentro de 24 h. NOTA: Após a execução deste protocolo, a suspensão celular decidetiva está pronta para análise FACS. Recomenda-se registrar o maior número possível de eventos por amostra; pelo menos 1.000-3.000 eventos de uma população parental devem ser obtidos para alcançar resultados confiáveis.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+code+of+pregnancy.">The immunological code of pregnancy.</a> Science. 365 (6456), 862-863 (2019).</li><li>Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+immunological+and+microbial+aspects+of+pregnancy.">The unique immunological and microbial aspects of pregnancy.</a> Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).</li><li>Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , (2014).</li><li>Filipovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definition+of+group+1+innate+lymphoid+cells+in+the+mouse+uterus.">Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus.</a> Nature Communications. 9 (1), 4492 (2018).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DBA-lectin+reactivity+defines+mouse+uterine+natural+killer+cell+subsets+with+biased+gene+expression.">DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression.</a> Biology of Reproduction. 87 (4), 81 (2012).</li><li>Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+NK+cells:+active+regulators+at+the+maternal-fetal+interface.">Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).</li><li>Gaynor, L. M., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells:+Functional+distinctions+and+influence+on+pregnancy+in+humans+and+mice.">Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice.</a> Frontiers in Immunology. 8, 467 (2017).</li><li>Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells.">Uterine natural killer cells.</a> Frontiers in immunology. 10, 960 (2019).</li><li>Wilkens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+NK+cells+regulate+endometrial+bleeding+in+women+and+are+suppressed+by+the+progesterone+receptor+modulator+asoprisnil.">Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil.</a> The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).</li><li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+&#947;+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification,+decidual+integrity,+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy.">Interferon &#947; contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface.">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li><li>Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+direct+hemochorial+placentation+by+regulating+hypoxia-inducible+factor+dependent+trophoblast+lineage+decisions.">Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).</li><li>Crespo, &. #. 1. 9. 4. ;. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+transfer+granulysin+to+selectively+kill+bacteria+in+trophoblasts.">Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts.</a> Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).</li><li>Shmeleva, E. V., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+natural+killer+cells+at+the+intersection+between+reproduction+and+mucosal+immunity.">Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity.</a> Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).</li><li>Kather, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neither+lymphotoxin+alpha+nor+lymphotoxin+beta+receptor+expression+is+required+for+biogenesis+of+lymphoid+aggregates+or+differentiation+of+natural+killer+cells+in+the+pregnant+mouse+uterus.">Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus.</a> Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).</li><li>Croy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 612, 465-503 (2010).</li><li>Vander lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.+II.">Spontaneous pseudopregnancy in mice. II.</a> Acta Physiologica et Pharmacologica Neerlandica. 5 (2), 213-215 (1956).</li><li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male.">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+(second+edition).">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Licensing+of+natural+killer+cells+by+host+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules.</a> Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2009).</li><li>Doisne, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition,+development,+and+function+of+uterine+innate+lymphoid+cells.">Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells.</a> Journal of Immunology. 195 (8), 3937-3945 (2015).</li><li>Peel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+GMG+Cells.">Fate of GMG Cells.</a> Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, (1989).</li><li>Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells:+a+specialized+differentiation+regulated+by+ovarian+hormones.">Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones.</a> Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).</li><li>Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+receptor+repertoire+in+mouse+uterine+NK+cells.">Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells.</a> Journal of Immunology. 181 (9), 6140-6147 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar e nem conflitos de interesse.

O método contém várias etapas críticas discutidas a seguir. O primeiro passo crítico é obter múltiplas gestações síncrocas à medida que a frequência relativa das populações de leucócitos muda durante a gravidez. Ter várias barragens no mesmo dia gestacional permite que as repetições biológicas nos mesmos experimentos ou a junção de linfócitos de barragens individuais obtenham números maiores necessários para aplicações a jusante. O acasalamento cronometrado permite ao pesquisador identificar a concepção dentro de um período de 24h. Embora os camundongos vivam por cerca de 2,5 anos, eles terão idade reprodutiva de 4 a 7 semanas até 6-8 meses de idade. Como camundongos mais jovens geralmente produzem filhotes menores, camundongos fêmeas geralmente não são acasalados até que estejam entre 6-8 semanas, e camundongos machos até que estejam entre 8 e 10 semanas. Dado que estrus dura cerca de 15 h em camundongos e ocorre a cada 4-5 dias, a taxa típica de acasalamento (revelada por um plug vaginal, ver Figura 4) é em torno de 25%. Por isso, é importante usar camundongos em estrus e planejar números suficientes para obter o número necessário de barragens para um determinado experimento. A fase do ciclo estrus pode ser determinada por citologia de difamação vaginal22. A taxa de plugue pode ser melhorada descansando os machos 48 h antes do acasalamento e aproveitando o efeito Whitten18. Alternativamente, pode-se administrar soro de égua grávida, que imita o efeito do hormônio estimulante do folículo endógeno, induzindo a maturação do oócito e, 42-50 h depois, gonadotropina coriônica humana, que imita o efeito do hormônio luteína endógeno, induzindo a ovulação. Este tratamento hormonal ignora a exigência de estrus e torna praticamente todas as fêmeas tratadas receptivas.
Um segundo passo crítico é garantir a qualidade da coloração FACS. Os anticorpos utilizados na citometria de fluxo devem ser sempre titulados e utilizados na concentração ideal, e é necessário verificar se a digestão enzimática não corta epítopos antigênicos cruciais. Para avaliar se uma enzima irá cortar um epítope, pode-se manchar duas frações da mesma amostra em paralelo, uma submetida a digestão enzimática e outra mecânica. Da mesma forma, o uso de controles apropriados e manchas únicas é crucial para obter dados confiáveis. Para eventos raros, as contas podem ser usadas para gerar amostras de uma única mancha. Recomenda-se não usar contas para a instalação de tensões, mas sim uma população de células contendo linfócitos e outros leucócitos, como esplenócitos. Se as contas forem usadas, é necessário titular anticorpos para coloração de contas, de modo que a intensidade de fluorescência das contas manchadas será comparável à intensidade de fluorescência das células. Em caso de dificuldade em separar positivo de células negativas para um determinado marcador, um controle de FMO também pode ser usado para facilitar a gating para um marcador específico. No caso de marcadores intracelulares, um controle isótipo deve ser usado como coloração intracelular pode resultar em anticorpos residuais desvinculados, que ainda podem estar presentes dentro das células após as etapas de lavagem e, portanto, aumentar o sinal de fundo. Recomenda-se executar as amostras dentro de 24 horas de fixação das células para obter os melhores resultados em fenotipagem pela análise FACS, uma vez que a autofluorescência aumenta significativamente ao longo do tempo e a intensidade de fluorescência de alguns anticorpos pode diminuir ao longo do tempo.
Outro fator crucial a considerar é a aplicação a jusante da suspensão unicelular obtida com o protocolo. Para ensaios funcionais, é essencial trabalhar em condições estéreis. Da mesma forma, para estudos de omics subsequentes, é importante trabalhar em estéril e RNase, DNase e sem protease.
O protocolo aqui apresentado se concentra em ILCs do grupo 1 fenotipagem, mas pode ser adaptado para fenotipagem de outros tipos de células modificando o painel de anticorpos. Recomenda-se que todos os anticorpos sejam testados contra suspensão celular digerida e não digerida para detectar a perda/alteração de epítopos superficiais pelo tratamento enzimático. Da mesma forma, diferentes enzimas podem ser usadas para digerir o tecido e aumentar o rendimento celular, mas seu efeito sobre epítopos antigênicos cruciais deve ser cuidadosamente estudado. Enquanto nKp46 é um bom marcador para células NK esplênicas e funciona em todas as cepas de ratos de laboratório, a expressão de NKp46 em células uNK em camundongos C57BL/6 é consideravelmente menor do que em células NK de baço. É melhor manchar para NK1.1 e NKp46 simultaneamente. Se vários órgãos forem comparados diretamente, recomenda-se tratar todas as amostras de forma igual, mesmo que a digestão enzimática não seja necessária para tecidos como o baço ou a medula óssea. Embora o método aqui apresentado seja aplicável ao útero não gestante, o isolamento do anel linfócito por um gradiente percoll de duas fases será desafiador, e o rendimento de células isoladas pode ser muito baixo para análise confiável do FACS e, portanto, exigirá a junção de células isoladas do útero de camundongos individuais e não gestantes23.
Há limitações ao protocolo a considerar para a interpretação dos dados. Como é o caso de todos os tecidos, os linfócitos circulantes provenientes do sangue serão isolados ao lado de células residentes em tecidos. Se a exclusão dos linfócitos circulantes for essencial para a interpretação dos dados, a coloração intravital pode ser realizada para rotular células circulantes. Além disso, uma segunda limitação ao protocolo é que algumas células serão perdidas, pois nem todas as células podem ser extraídas do tecido. Os problemas mais comuns e sua solução de problemas são apresentados na Tabela 2.
Historicamente, o estudo das células nos tecidos tem se apoiado no exame histológico das seções teciduais. A excelente revisão de Sandra Peel24 resume o trabalho feito ao longo de mais de 100 anos até o final dos anos 80. Descrições de células mais tarde conhecidas como células uNK realmente aparecem em manuscritos publicados mais de meio século antes mesmo de linfócitos serem descobertos. Assim, antes da descoberta de células NK em 1975, e as células uNK foram indicadas como células glicogênio maternas ou células de glândulas metrial granuladas. Anne Croy fez grandes contribuições no campo25 e gentilmente ensinou à equipe a dissecção que ela havia otimizado3, e que é usada atualmente. Embora seja fundamental na descrição da morfologia e localização tecidual das células uNK, o exame histológico clássico limita-se à detecção de apenas alguns marcadores nas células de interesse. Em 2008, foi descrito um método baseado em citometria de fluxo para detectar simultaneamente vários marcadores em linfócitos uterinos. Este é essencialmente o método que foi descrito neste artigo. Tecnologias mais recentes, como transcrição espacial e imagem por citometria em massa, combinam o poder da histologia e da citometria de fluxo, permitindo tanto a detecção simultânea de múltiplos genes ou proteínas, respectivamente, quanto a preservação da arquitetura tecidual normal.
As aplicações do método descrito aqui são múltiplas e incluem fenotipagem FACS, ensaio funcional (como ELISPOT, degranulação ou ensaios citotóxicos), classificação celular e transcrição ou proteômica subsequente. Outras aplicações que poderiam ser desenvolvidas com base neste método incluem a cultura e a expansão de células NK deciduais após a classificação celular ou enriquecimento por esgotamento negativo. Atualmente, não há protocolo para cultivar e expandir as células uNK do mouse e preservar sua viabilidade e funcionalidade por um período prolongado, de forma semelhante às células NK humanas que podem ser cultivadas e expandidas por 7-14 dias por adição de IL-2 ou uma combinação IL-12 e IL-15. A otimização de tal método para células uNK do mouse proporcionaria mais flexibilidade ao realizar ensaios funcionais e permitiria que múltiplas condições fossem testadas com um número de células mais alto. Por outro lado, as condições culturais são conhecidas por modificar o fenótipo único de linfócitos e potencialmente sua função também.

Descrito aqui é um método simples para obter um alto rendimento de linfócitos inatos uterinos do útero gestante individual. Este método preserva a expressão e funcionalidade da superfície proteica de linfócitos inatos uterinos e é adequado para aplicações subsequentes como fenotipagem FACS, RNAseq, proteômica ou ensaios funcionais. Aqui, o foco é o fenotipamento dos uILCs do grupo 1 por citometria de fluxo.
O útero é composto de três camadas: o endométrio, o miomerium e o perimétrio (Figura 1). O endométrio é a mucosa, forrando o lúmen do útero. A progesterona, produzida pelo corpus luteum, converte o endométrio em decidua. O miométrio é composto de duas camadas de músculo liso que compõem a parede uterina. O perimétrio é o serosa que envolve o útero e o conecta ao peritônio através do ligamento largo chamado mesometrium. Em uma seção transversal do útero, a parte oposta ao lúmen é chamada de lado mesometrial, enquanto a parte próxima ao lúmen é chamada de lado anti-mesometrial. Uma variedade de leucócitos maternos povoam o endométrio e o decidua, incluindo vários tipos de células, onde as células imunes inatas representam a grande maioria das células. Linfoides inatas (ILCs), macrófagos, células dendríticas (DC), bem como linfócitos T CD4+ e CD8+, células T regulatórias (Tregs) e células B raras, podem desempenhar papéis importantes na regulação do ambiente uterino ao longo da gravidez1,2. ILCs no útero são encontrados não só na mucosa, mas também no miométrio em camundongos. Incluindo todos os três grupos de ILCs, o útero é de fato o órgão mais densamente povoado pelos ILCs do grupo 1. Com a transformação estrutural dos tecidos uterinos ao longo da gestação, o número e a proporção de leucócitos uterinos também mudam (ver Figura 2A para um exemplo de variações no percentual dos subconjuntos do grupo 1 uILC)3,4.
Quando os camundongos são referidos neste artigo, a cepa C57BL/6 de ratos de laboratório de raça é destinada. Camundongos de raça outbr (por exemplo, camundongos NMRI) são frequentemente usados em pesquisas reprodutivas devido à sua alta taxa reprodutiva. No entanto, o uso de cepas de raça é necessário para gerar resultados consistentes, e o fundo genético favorito do imunologista é C57BL/6, também conhecido como B6.
Aproximadamente 30% dos leucócitos uterinos nas barragens B6 na gestação média são g1 uILCs, que são definidas pela citometria de fluxo como células viável CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+ (Figura 2B): NK (trNK) residente em tecido pro-angiogênico, IFN-g produzindo NK convencional (cNK) e uILC14,5. A porcentagem de células uNK é ainda maior em humanos, atingindo cerca de 70% no primeiro trimestre6. Há mais semelhanças do que diferenças entre humanos e mouse uNK e uILC7,8. Embora seja importante ter as diferenças em mente, é útil integrar informações disponíveis sobre as duas espécies. Quando se combina informações obtidas da investigação do ILC em humanos e roedores de laboratório, é claro que as células NK auxiliam em mudanças homeosstáticas essenciais para a biologia do útero, incluindo manutenção da integridade arterial9 e remodelação da artéria espiral10, bem como invasão de trophoblast11,12. Eles também desempenham papéis específicos na defesa contra patógenos13,14. Em camundongos e ratos, além de preencher a decidua em torno do local de implantação, as células NK se acumulam entre as duas camadas musculares do miométrio das barragens em uma estrutura transitória conhecida como Agregado Linfoide Mesometrial da gravidez (MLAp)15 (Figura 1B), também conhecida no passado como a glândula metrial, função da qual ainda está para ser descoberta.
Descrito aqui é um protocolo detalhado do método utilizado em laboratório para isolar linfócitos do útero de camundongos gestantes usando uma combinação de desagregação mecânica e digestão enzimática. Como todo o útero é usado no método, linfócitos isolados do útero durante a gestação são uma mistura de células deciduais e miometriais. Mais dissecção da decidua da parede uterina e seu MLAp é possível, e foi descrita antes de16. O método descrito aqui foi desenvolvido para obter linfócitos uterinos, preservando a expressão da superfície proteica, funcionalidade celular e viabilidade. O resultado é uma suspensão de célula única com detritos celulares residuais mínimos e um rendimento tipicamente variando de 1 a 5 milhões de células na gestação média (10,5 dias) para um útero grávida. As aplicações deste método abrangem fenotítipo por citometria de fluxo, classificação celular para estudos transcriômicos ou proteômicos subsequentes, estudos funcionais como produção de citocinas intracelulares, desgranulação, ELISPOT ou ensaios citotóxicos. O protocolo aqui apresentado se concentra na identificação de ILCs do grupo 1, mas pode ser adaptado para outros tipos de células, como outros ILCs, células T, células B, DC ou macrófagos com pequenas modificações do painel de anticorpos usado para análise FACS. O protocolo também pode ser usado para isolar células de outros tecidos e para uteri não-grávidas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>562701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>562600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49a antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>740262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche (Sigma)</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOMES antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4875-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block Trustain fcx</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10217-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche (Sigma)</td>
			<td>5401089001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer Pharmlyse</td>
			<td>BD</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKp46&#160; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>137608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14030-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 medium + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Violet Fixable Viability dye</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of uterine innate lymphoid cells for analysis by flow cytometry

Descrito aqui é um método simples para isolar e o grupo de camundongos fenótipo 1 células linfoides inatas uterinas (g1 uILCs) do útero gestante individual por citometria de fluxo. O protocolo descreve como configurar o acasalamento de tempo para obter múltiplas barragens síncronas, a digestão mecânica e enzimática do útero gestante, a coloração de suspensões unicelulares e uma estratégia FACS para fenótipo e discriminar g1 uILCs. Embora este método inevitavelmente perca as informações espaciais da distribuição celular dentro do tecido, o protocolo tem sido aplicado com sucesso para determinar a heterogeneidade do IILC, sua resposta a fatores maternos e fetais que afetam a gravidez, seu perfil de expressão genética e suas funções.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Este é um método para isolar células linfoides uterinas de camundongos grávidas e não grávidas. Este método pode ser usado para múltiplas aplicações a jusante, como fenotipagem FACS, classificação celular, ensaios funcionais, RNA-seq e proteômica. O protocolo aqui demonstra como fenótipo grupo 1 células linfoides inatas uterinas por citometria de fluxo.

Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

Nosso método permite a avaliação da composição e características funcionais de diferentes subpopulações de linfócitos presentes no tecido uterino de animais gestantes e não gestantes. Este protocolo permite o isolamento de linfócitos uterinos, preservando a expressão superficial de proteína, viabilidade celular e funcionalidade. Portanto, é adequado para uma série de aplicações subsequentes.A remoção do feto no início do experimento e a coleta de leucócitos são etapas tecnicamente desafiadoras. Como é um experimento demorado, uma atenção e foco particular são necessários uma vez que você tenha alcançado os passos de coloração de anticorpos. Para começar, transfira o tecido uteremado colhido de um c57 preto grávida de seis camundongos em uma placa de petri estéril, em seguida, usando instrumentos estéreis remover suavemente a gordura ao redor do tecido, tomando cuidado para não deixar o tecido secar.Remova os fetos dissecando cada local de implantação com instrumentos estéreis e, em seguida, devolva o útero ao tubo original de coleta de cinco mililitros contendo um mililitro de mídia de coleta. Usando uma tesoura, pique o tecido no tubo de coleta e coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius. Em seguida, adicione três mililitros de mistura de digestão enzimática pré-aquecida ao tubo.Incubar o tubo por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação para melhorar a atividade de digestão enzimática. Depois que a incubação estiver completa, o vórtice do tubo, e mantê-lo no gelo para inibir a atividade enzimática, em seguida, transfira o tecido digestivo para um tubo de centrífuga de 15 mililitros devidamente rotulado. Enxágüe o tubo de coleta de cinco mililitros com um total de 10 mililitros de solução EDTA PBS de gelo de cinco mililitros para coletar todo o tecido restante e transferi-lo para o tubo de centrífugo de 15 mililitros.Centrifugar a amostra de tecido digerido por 10 minutos a 400 vezes G.Descarte o supernante, aperte suavemente a pelota e, em seguida, resuspended em 10 mililitros de solução EDTA PBS pré-aquecida de cinco mililitros. Para reduzir a aglomeração celular, incubar a amostra a 37 graus Celsius com agitação, seguida de vórtice no alto por 10 segundos. Para remover aglomerados celulares em tecido não associado, coloque um coador de 70 micrômetros em cima de um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis, em seguida, usando o êmbolo de uma seringa estéril de um mililitro, forçar o tecido digerido através do coador para dentro do tubo.Lave o coador várias vezes com um total de 10 mililitros de PBS frio para coletar todas as células, em seguida, gaste o tubo de centrífugo de 50 mililitros por 10 minutos a 400 vezes G.Depois de descartar o supernatante, as células linfoides inatas podem ser isoladas usando a opção A ou a opção B.Para a opção A, resuspenque a pelota em cinco mililitros de 80% isotônicos por chamada usando uma pipeta voy. Em seguida, usando a pipeta voy em velocidade lenta, sobreponha cuidadosamente oito mililitros, 40% por solução de chamada, na pelota resuspended em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Pipeta lentamente e continuamente, segurando o mililitro de 15 mililitros para cerca de um ângulo de 45 graus.Sem perturbar a sobreposição, centrifugar o tubo por 20 minutos a 850 vezes G com aceleração média e quebras mínimas à temperatura ambiente. Uma vez que a centrifugação esteja completa, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga sem perturbar as camadas por chamada. Em seguida, sem perturbar o anel de leucócitos na interface das duas soluções por chamada, use uma pipeta pasteur estéril para descartar todos, exceto 0,5 a um mililitro da camada superior por chamada.Enquanto tenta manter a quantidade de solução por chamada sugada para dentro da pipeta ao mínimo, colete cuidadosamente o anel de leucócitos e transfira as células para um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros rotulado. Adicione 10 mililitros de meio RPMI estéril suplementado com 10% de calor e FBS ativado às células, depois centrifugar as células por cinco minutos a 500 vezes G e quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e prossiga para a lise de glóbulos vermelhos.Para isolar as células usando a opção B, depois de passar o tecido digerido através do coador celular e centrifugar o resultado em suspensão celular como demonstrado anteriormente, resuspenque a pelota com oito mililitros de 35% isotônicos por chamada e meio RPMI, e transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 940 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente com aceleração média e quebras mínimas. Em seguida, usando um aspirador ou pipeta voy, aspire o supernatante cuidadosamente antes de reutilizar a pelota em 14 mililitros de meio RPMI complementado com 10% de calor e FBS ativado.Centrifugar a amostra novamente por cinco minutos a 500 vezes G e quatro graus Celsius, em seguida, descartar o sobrenante por aspiração e proceder à lise de glóbulos vermelhos. Para lise os glóbulos vermelhos, resuspenque a amostra em três mililitros de uma solução de lise de glóbulos vermelhos X e incubar por três minutos à temperatura ambiente, em seguida, adicione 10 mililitros de PBS na amostra para parar a reação. Centrifugar o tubo a 400 vezes G durante cinco minutos após descartar o supernaspe, adicione outros 10 mililitros de PBS e repita a centrofugação.Resuspenque a pelota em um mililitro de meio RPMI suplementado com FBS inativado de calor de 10%, em seguida, passe a suspensão em célula através de um coador celular estéril de 70 micrômetros. Após a contagem das células, ajuste a concentração da suspensão celular para uma a 2 milhões de células em 100 microlitres de PBS e prossiga para a análise de coloração e facs. Os ILCs do grupo uterino incluem células NK convencionais, células NK residentes em tecidos e ILCs do grupo um com suas porcentagens variando durante a vida e a gravidez.Esses subconjuntos podem ser discriminados usando citometria de fluxo por células de gating primeiro em sua capacidade de dispersar a luz, em seguida, isolando cd único comprável 45 cd positivo três cd negativo 19 células negativas, e, em seguida, identificando ilCs do grupo um que são NK 1.1 e NKP 46 positivo. Dentro do grupo um, os EMs negativos CD49A positivos são as células NK convencionais. Cd49A células positivas ems positivas são células NK residentes em tecido.E as células negativas do CD49 são ILCs uterinos do grupo um. A coloração de linfócitos esplênicos e uterinos com anticorpos anti NK P46 e anti NK 1.1 mostra que os linfócitos esplênicos expressam maiores quantidades de NKP 46 em sua superfície do que sua contraparte uterina. Na dissociação do tecido enzimático, os epítopos superficiais podem ser alterados dependendo das enzimas utilizadas no meio de digestão.Por exemplo, a coloração para o receptor MHC CD49 NKG2A é ruim quando o TM liberase é usado. No entanto, a digestão com a liberase DH preserva o reconhecimento de NKG2A pelo clone de anticorpos 1611. Cerca de 6,5% dos ILCs do grupo um presentes em amostras de tecido uterino no dia da gestação 8,5 são derivados do sangue.Contaminantes sanguíneos podem ser excluídos através da coloração intravital com anticorpos anti CD45 conjugados com fluorocromo. Ao configurar para reuniões de tempo, você deve levar em consideração que os ratos são noturnos. Portanto, eles devem ser configurado o mais tarde possível no período da tarde, pois o acasalamento ocorrerá durante a noite.Além disso, ao selecionar fêmeas, você deve garantir que elas não tenham um septo vaginal. Normalmente fazemos análises de citometria de fluxo para olhar para muitas proteínas do lado de fora das células e dentro das células. Também fazemos extração de ácido nucleico para estudar a expressão genética, incluindo o sequenciamento do RNA.E também conseguimos em torno de ensaios funcionais para estudar as respostas de células linfoides inatas uterinas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Imunologia e Infecção

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...