Name: isolation of uterine innate lymphoid cells for analysis by flow cytometry
Uploaded: 2021-10-14T13:30:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipoviç ve Anita Qualls da dahil olmak üzere bu yöntemin geliştirilmesine yardımcı olan önceki ve mevcut ekip üyelerine teşekkür ederiz. Bu araştırma Wellcome trust [Grant number 200841/Z/16/Z] ve Medical Research Council (MR/P001092/1) tarafından finanse edildi. Açık erişim amacıyla, yazar bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale sürümüne CC BY kamu telif hakkı lisansı uygulamıştır.

Bu makalede açıklanan tüm hayvan deneyleri, İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından yayınlanan PP2363781 uyarınca 1986 tarihli Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası'na göre gerçekleştirilmiştir. Aşağıdaki protokol, fare hayvanlığından başlayarak facs analizi için boyama ile biten birkaç bölümden oluşmaktadır. Şekil 3 , protokolün ana adımlarını yansıtır. Protokolde kullanılan malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Genel fareler hayvancılık, çiftleşme ve diseksiyon
<ol><li>7-14 haftalık dişi fareleri belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında ve grup halinde (kafes büyüklüğüne ve hayvan ağırlığına göre tipik olarak 4-6 dişi) 10-14 gün boyunca saklayın, bu da östrus senkronizasyonu ile sonuçlanır17.</li>
	<li>Damızlık erkekleri SPF koşullarında, tek kişilik ve her çiftleşme arasında en az 48 saat dinlendirin (sperm yenilenme zamanı). Kanıtlanmış 3-4 aylık damızlık erkeklerin kullanılması tercih edilir, çünkü tipik olarak gençlerden daha performanslıdırlar.</li>
	<li>Dişilerin hamile kalma olasılığını artırmak için, çiftleşmeden 3 gün önce dişi kafeste bir erkeğin kafesinden kirli yatak takımı tanıtın. Bu, erkek idrar feromonlarına maruz kalarak Whitten etkisini18 tetikler ve senkronize östrusun yanı sıra çiftleşme için gelişmiş duyarlılıkla sonuçlanır.</li>
	<li>0. Günde (D0), fareleri iki dişi başına bir damızlık erkek kullanarak çiftleşme için ayarlayın; yaklaşık % 20-25'lik bir fiş oranı düşünün. NOT: Fareler gece hayvanları olduğu için çiftleşme muhtemelen geceleri gerçekleşecektir.</li>
	<li>Çiftleşmeyi takip eden sabahları (D0.5), çiftleşmenin bir göstergesi olan vajinal tıkacın varlığını kontrol edin (Şekil 4). Vajinal tıkaç, erkek boşalmasının bir toplamıdır ve genellikle çiftleşmeden sonra 8-24 saate kadar devam eder. Sabahın erken saatlerinde fişleri kontrol et.</li>
	<li>Takılı dişileri yeni bir kafeste birleştirin ve onları ayırın. Erkekleri dinlenmek için kafeslerine geri koyun.</li>
	<li>D9.5 veya 10.5-after çiftleşmede, doku toplanması için 1 mL steril HBSS 1x (Mg2+ ve Ca2+ ile) ile 5 mL tüpler hazırlayın ve buza yerleştirin.</li>
	<li>Servikal çıkık ile hayvan ötanazisine devam edin, ardından ölümü doğrulamak için exsanguination.</li>
	<li>Aşağı akış uygulaması gerektiriyorsa steril bir ortamda çalışın. Ötanaziden hemen sonra, fare gövdesini% 70 etanol ile silin ve steril aletlerle laminer akı dolabının altında diseksiyona devam edin.</li>
	<li>Hamile uterusun mesometrial yağ içermeden diseksiyonunun yapılması (Şekil 5) ve tüm uterusun tamamını hazırlanmış ve uygun şekilde etiketlenmiş 5 mL tüpe yerleştirin. Tüpleri buzda tut.</li>
</ol>2. Uterusun mekanik ve enzymatic sindirimi
<ol><li>Enzimyasal sindirim çözeltisini hazırlamak için, steril HBSS 1x'in uterus başına 3 mL'yi 30 μg/mL DNAse ve 0,1 Wünsch ünitesi (WU)/mL Liberase DH veya 0,52 WU/mL Liberase TM ile karıştırın. Çözeltiyi 37 °C'de bir su banyosuna koyun. NOT: Hem Liberase TM hem de Liberase DH kullanılabilir. Birinin diğerine tercih edilmesi, sonraki akış sitometri analizi için kullanılan antikorlar tarafından tanınan epitoplar üzerindeki potansiyel etkileri ile yönlendirilmelidir. DİkKAT: Liyofilize enzimler kullanıyorsanız, kaputun altında çalışın.</li>
	<li>PBS'de 5 mM EDTA'nın 20 mL'liğini hazırlayın (Ca2+/Mg2+ yok). Çözeltinin yarısını 37 °C'de bir su banyosuna, diğer yarısını da buza yerleştirin.</li>
	<li>Laminar bir akı dolabı altında, hamile uterusu çevreleyen yağı steril bir Petri kabındaki steril aletlerle hafifçe çıkarın. Dokunun kurumasına izin vermeyin.</li>
	<li>Fetüsleri çıkarmak için her implantasyon bölgesini steril aletlerle parçalara çıkarın (denizatı şeklindeki yarı saydam yapı, yaklaşık 1 mm uzunluğunda) (Şekil 6A). Fetüsleri atın.</li>
	<li>Uterusun orijinal koleksiyonuna geri dönün 5 mL tüp ve dokuyu doğrudan 5 mL tüp ve toplama ortamında makas kullanarak kıyma. Prosedürler arasında tüpleri sürekli buzda tutun.</li>
	<li>Kıyılmış dokuyu içeren 5 mL tüpleri 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>Her numuneye 3 mL sıcak enzimmatik sindirim karışımı ekleyin, böylece tüpteki toplam sıvı hacmi 4 mL (kıyılmış uteruslu 1 mL toplama ortamı ve 3 mL enzymatic sindirim çözeltisi). Enzymatic sindirim aktivitesini geliştirmek için 5 mL tüpleri 37 °C'de 30 dakika boyunca ajitasyonla kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>5 mL tüpleri girdaplayın ve enzimlerin etkisini engellemek için buza yerleştirin. Daha sonra, içeriği düzgün etiketlenmiş 15 mL santrifüj tüplere aktarın.</li>
	<li>5 mL'lik tüplerdeki her şeyi 10 mL buz gibi 5 mM EDTA PBS çözeltisi kullanarak 15 mL santrifüj tüplerine yıkayın.</li>
	<li>Sindirilmiş dokuları içeren 15 mL santrifüj tüplerini 400 x g'da 10 dakika santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı atın, peleti hafifçe hafifçe hafifçe vurun ve ardından 10 mL sıcak (37 °C) 5 mM EDTA PBS çözeltisinde yeniden kullanın.</li>
	<li>Numuneleri 37 °C'de 15 mL santrifüj tüplerinde 15 dakika boyunca ajitasyonla kuluçkaya yatırarak sol sindirim ortamını çıkarın ve hücre topaklanmasını azaltın.</li>
	<li>Doku ayrışmasını daha da kolaylaştırmak için örnekleri 10 s boyunca yüksekte vorteks edin.</li>
</ol>3. Uterusun tek bir hücre süspansiyonuna işlenmesi
<ol><li>Steril 1 mL şırıngın pistonunu kullanarak, hücre kümelerini ve bozulmamış dokuyu çıkarmak için sindirilen dokuyu 70 μm'lik bir süzgeçten düzgün etiketlenmiş ve steril 50 mL santrifüj tüpüne zorlayın.</li>
	<li>Tüm hücreleri toplamak için süzgeci toplam 10 mL soğuk PBS ile birkaç kez yıkayın.</li>
	<li>50 mL santrifüj tüpünü 400 x g'da 10 dakika döndürün. NOT: A Seçeneği veya B Seçeneği'ni kullanarak diğer adımları uygulayın. Bununla birlikte, B Seçeneği, daha az hücre kaybı ve numuneler arasında hücre veriminin daha az değişkenliği nedeniyle daha yüksek bir bağışıklık hücresi verimi sağlar. B seçeneğinin teknik olarak gerçekleştirilmesi de daha kolaydır. Bu nedenle, tercihe bağlı olarak, A Seçeneği veya B Seçeneği ile devam edin.<ol>
<li>A Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.<ol>
<li>PBS ile seyreltilmiş % 80 (v/v) izotonik Perkol'un 5 mL'sini içeren numune başına bir steril 15 mL santrifüj tüpü etiketle.</li>
			<li>Dönüşten sonra, süpernatantı 50 mL santrifüj tüpünden atın. PBS'de her peleti % 40 (v/v) izotonik Perkol'un 8 mL'sinde yeniden kullanmak için bir pipet çocuğu kullanın.</li>
			<li>%40 Percoll çözeltisinde yeniden kullanılan peleti %80 Percoll çözeltisine dikkatlice kaplamak için yavaş hızda bir pipet çocuğu kullanın. Pipet yavaş ve sürekli; 15 mL'lik tüpü 45° açıyla tutun (Şekil 6B).</li>
			<li>Kaplamayı bozmadan, 15 mL santrifüj tüplerini oda sıcaklığında (orta hızlanma ve minimum mola) 850 x g'da 20 dakika santrifüj edin.</li>
			<li>Percoll katmanlarını bozmadan tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın (Şekil 6C).</li>
			<li>İki Percoll çözeltisinin arayüzünde lökosit halkasını bozmadan, üst Percoll tabakasının yaklaşık 0,5-1 mL'si hariç hepsini atmak için steril bir Pasteur Pipet kullanın.</li>
			<li>Minimum miktarda Percoll çözeltisini emmeye çalışırken (toplam 4-5 mL'ye kadar), lökosit halkasını dikkatlice toplayın ve hücreleri yeni etiketli 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.</li>
			<li>Her numuneyi, ısı inaktive FBS'nin % 10'u ile desteklenmiş 10 mL steril RMPI-1640 ortamı ile toplar.</li>
			<li>4 °C'de 500 x g'da 5 dakika santrifüj.</li>
			<li>Üstnatant atın ve RBC lizizine devam edin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>B Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.<ol>
<li>Numune başına bir steril 15 mL santrifüj tüpü etiketle.</li>
			<li>Dönüşten sonra, süpernatantı 50 mL santrifüj tüpünden atın. RPMI-1640 ortamında %35 (v/v) izotonik Perkol'un 8 mL'si ile her peleti yeniden kullanmak için bir pipet çocuk kullanın.</li>
			<li>Numuneleri 15 mL santrifüj tüplerine aktarın.</li>
			<li>Numuneleri orta hızlanma ve minimum mola ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 940 x g'da santrifüj edin.</li>
			<li>Bir aspiratör veya pipet çocuğu kullanarak (tüpü ters çevirerek değil) süpernatantı dikkatlice aspire edin.</li>
			<li>Peleti % 10 ısı inaktive FBS ile desteklenmiş 14 mL RPMI-1640 ortamında yeniden sakla ve ardından numuneyi 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjle.</li>
			<li>Aspirasyon tarafından üstnatant atın ve RBC liziz devam edin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4.RBC lizisi
<ol><li>RBC'leri sulandırmak için, numuneleri 3 mL 1x RBC liz çözeltisinde yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Reaksiyonun durdurulması için numunelere 10 mL PBS ekleyin.</li>
	<li>Tüpleri 400 x g'da 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın.</li>
	<li>10 mL PBS ekleyin ve 4.3 adımını yineleyin.</li>
	<li>Her peleti, ısıya neden olan FBS'nin% 10'u ile desteklenmiş 1 mL RPMI-1640 ortamında yeniden sunun.</li>
	<li>Numuneleri steril 70 μm hücre süzgeçlerinden geçirin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre trypan mavisi ve neubauer odası kullanarak hücre sayısını gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun konsantrasyonu 100 μL PBS veya ortamda 1-2 milyon hücreye ayarlayın.</li>
</ol>5. Panel tasarım stratejisi ve kontrolleri
NOT: Bu makalede açıklanan panel uILC1, trNK ve cNK hücrelerinin ayrımcılığına uygundur ve 5 lazerli BD LSRFortessa'da kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Farklı hücre popülasyonlarını incelemek ve alternatif florokromlar kullanmak için küçük değişiklikler yapılabilir. Cihazın konfigürasyonunun kontrol etmesi, optimal ayırma için titred antikorlar kullanılması, üreticinin parlaklık indeksine danışılması ve NKp46 gibi düşük eksprese edici antijenler için en parlak boyaların kullanılması ve genel yönergelere uyun19 önerilir. NKp46 için Floresan Eksi Bir (FMO) denetiminin dahil edilmesi önerilir.
6. FACS fenotipleme için doğuştan gelen lenfoid hücre lekelenmesi
<ol><li>Kuyu başına 1-2 milyon hücreyi yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakasına aktarın.</li>
	<li>Plakayı 4 °C'de 3 dakika boyunca 400 x g'da döndürün ve bir lavaboya vurarak süpernatantı atın.</li>
	<li>Hücre peletlerini çok kanallı bir pipet kullanarak 100 μL PBS 'ye (protein ve azit içermeyen) yeniden harcayın. NOT: PBS'nin sonraki adım için sodyum azid, Tris veya protein içermediğine emin olun.</li>
	<li>6.2. adımı yineleyin.</li>
	<li>PBS (protein ve azit içermeyen) (1:1.000) ile seyreltilmiş 50 μL sabitlenebilir canlılık boyasında hücreleri yeniden biriktirin. Hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. NOT: PBS'nin sodyum azit, Tris veya FBS veya BSA gibi protein içermemesini sağlayın, çünkü bu, ölü hücrelerin lekelenme yoğunluğunun azalmasına ve/veya canlı hücreler için arka plan boyamasının artmasına neden olabilir. DİkKAT: Canlılık boyası toz haline getirilmişse, kaputun altında kullanın.</li>
	<li>150 μL PBS ekleyin, hücreleri çok kanallı bir pipetle yeniden biriktirin ve ardından 6.2 adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri, Fc reseptör blokaj reaktifi içeren 25 μL FACS Tamponunda (%1 BSA veya %2 FBS ile desteklenmiş PBS) yeniden kullanın. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>25 μL yüzey antikor kokteyli ekleyin. NOT: Deneyden önce her zaman antikorları titratın ve antikor panelini optimize edin.</li>
	<li>Numuneleri karanlıkta 20 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Her kuyuya 150 μL FACS Tampon ekleyin, iyice karıştırın ve ardından 6.2 adımını tekrarlayın.</li>
	<li>6.10. NOT: A Seçeneği veya B Seçeneği'ni kullanarak daha fazla adım uygulayın. Hücre içi belirteçleri akış sitometrisine göre incelemek için B seçeneğini kullanın.<ol>
<li>A Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.<ol>
<li>Numuneleri kuyu başına %4 paraformaldehit (PFA) 100 μL'de yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. DİkKAT: Kaputun altında PFA kullanın. PFA ile temas eden PFA atıklarını/nesnelerini (örneğin pipetler) güvenli bir şekilde atmak için lütfen güvenlik sayfasına bakın.</li>
			<li>6.2 adımlarını iki kez yineleyin. DİkKAT: PFA içerdiğinden buradaki lavaboya dokunarak atmayın. Bir pipetle aspire edin ve atıkları güvenlik levhasına göre atın.</li>
			<li>Numuneleri 200 μL PBS'de yeniden diri çekin.</li>
			<li>Numuneleri etiketli FACS tüplerine aktarın ve 100 μL PBS ile topunun. FACS analizi ile işlenene kadar tüpleri buzda veya buzdolabında saklayın. Numuneleri 24 saat içinde bir akış sitometresi üzerinde alın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>B Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.<ol>
<li>Numuneleri kuyu başına 100 μL fiksasyon / permeabilizasyon çözeltisinde (paraformaldehit içeren) yeniden kullanın ve 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. DİkKAT: Kaputun altında PFA kullanın. PFA ile temas eden PFA atıklarını/nesnelerini (örneğin pipetler) güvenli bir şekilde atmak için lütfen güvenlik sayfasına bakın.</li>
			<li>6.2. adımı yineleyin. DİkKAT: PFA içerdiğinden buradaki lavaboya dokunarak atmayın. Bir pipetle aspire edin ve atıkları güvenlik levhasına göre atın.</li>
			<li>200 μL 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve ardından 6.2 adımını tekrarlayın.</li>
			<li>6.11.2.3 adımlarını yineleyin.</li>
			<li>Sabit ve permeabilize hücreleri hücre içi boyama için antikor karışımı içeren 50 μL 1x permeabilizasyon/yıkama tamponunda yeniden biriktirin.</li>
			<li>Örnekleri karanlıkta 30 dakika boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>200 μL 1x permeabilizasyon / yıkama çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve ardından 6.2 adımını tekrarlayın.</li>
			<li>6.11.2.7 adımlarını yineleyin.</li>
			<li>Numuneleri 200 μL PBS'de yeniden diri çekin.</li>
			<li>Numuneleri etiketli FACS tüplerine aktarın ve 100 μL PBS ile topunun. FACS analizi ile işlenene kadar tüpleri buzda veya buzdolabında saklayın. Numuneleri 24 saat içinde bir akış sitometresi üzerinde alın. NOT: Bu protokolü gerçekleştirdikten sonra, desidual hücre süspansiyonu FACS analizi için hazırdır. Örnek başına mümkün olduğunca çok olay kaydedilmeniz önerilir; güvenilir sonuçlar elde etmek için ebeveyn nüfusunun en az 1.000-3.000 olayı elde edilmelidir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+code+of+pregnancy.">The immunological code of pregnancy.</a> Science. 365 (6456), 862-863 (2019).</li><li>Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+immunological+and+microbial+aspects+of+pregnancy.">The unique immunological and microbial aspects of pregnancy.</a> Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).</li><li>Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , (2014).</li><li>Filipovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+definition+of+group+1+innate+lymphoid+cells+in+the+mouse+uterus.">Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus.</a> Nature Communications. 9 (1), 4492 (2018).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DBA-lectin+reactivity+defines+mouse+uterine+natural+killer+cell+subsets+with+biased+gene+expression.">DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression.</a> Biology of Reproduction. 87 (4), 81 (2012).</li><li>Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+NK+cells:+active+regulators+at+the+maternal-fetal+interface.">Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).</li><li>Gaynor, L. M., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells:+Functional+distinctions+and+influence+on+pregnancy+in+humans+and+mice.">Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice.</a> Frontiers in Immunology. 8, 467 (2017).</li><li>Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells.">Uterine natural killer cells.</a> Frontiers in immunology. 10, 960 (2019).</li><li>Wilkens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+NK+cells+regulate+endometrial+bleeding+in+women+and+are+suppressed+by+the+progesterone+receptor+modulator+asoprisnil.">Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil.</a> The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).</li><li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+&#947;+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification,+decidual+integrity,+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy.">Interferon &#947; contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface.">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li><li>Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+direct+hemochorial+placentation+by+regulating+hypoxia-inducible+factor+dependent+trophoblast+lineage+decisions.">Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).</li><li>Crespo, &. #. 1. 9. 4. ;. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+transfer+granulysin+to+selectively+kill+bacteria+in+trophoblasts.">Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts.</a> Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).</li><li>Shmeleva, E. V., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+natural+killer+cells+at+the+intersection+between+reproduction+and+mucosal+immunity.">Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity.</a> Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).</li><li>Kather, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neither+lymphotoxin+alpha+nor+lymphotoxin+beta+receptor+expression+is+required+for+biogenesis+of+lymphoid+aggregates+or+differentiation+of+natural+killer+cells+in+the+pregnant+mouse+uterus.">Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus.</a> Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).</li><li>Croy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 612, 465-503 (2010).</li><li>Vander lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.+II.">Spontaneous pseudopregnancy in mice. II.</a> Acta Physiologica et Pharmacologica Neerlandica. 5 (2), 213-215 (1956).</li><li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male.">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+(second+edition).">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Licensing+of+natural+killer+cells+by+host+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules.</a> Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2009).</li><li>Doisne, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition,+development,+and+function+of+uterine+innate+lymphoid+cells.">Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells.</a> Journal of Immunology. 195 (8), 3937-3945 (2015).</li><li>Peel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+GMG+Cells.">Fate of GMG Cells.</a> Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, (1989).</li><li>Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells:+a+specialized+differentiation+regulated+by+ovarian+hormones.">Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones.</a> Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).</li><li>Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+receptor+repertoire+in+mouse+uterine+NK+cells.">Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells.</a> Journal of Immunology. 181 (9), 6140-6147 (2008).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi ve çıkar çatışması yok.

Yöntem, bundan sonra açıklanan birkaç kritik adım içerir. İlk kritik adım, lökosit popülasyonlarının göreceli sıklığı hamilelik yoluyla değiştiği için birden fazla senkron gebelik elde etmektir. Aynı gebelik gününde birden fazla baraja sahip olmak, aynı deneylerde biyolojik tekrarlara veya aşağı akış uygulamaları için gerekli daha büyük sayılar elde etmek için bireysel barajlardan lenfositlerin birikmesine izin verir. Süreli çiftleşme, araştırmacının gebe kalma süresini 24 saat içinde tam olarak belirlemesini sağlar. Fareler yaklaşık 2,5 yıl yaşamasına rağmen, 4-7 haftadan 6-8 aylık olana kadar üreme çağında olacaktır. Genç fareler genellikle daha küçük yavrular ürettiğinden, dişi fareler genellikle 6-8 hafta arasında olana kadar çiftleşmez ve erkek fareler 8-10 hafta arasında olana kadar çiftleşmez. Östrusun farelerde yaklaşık 15 saat sürdüğü ve her 4-5 günde bir meydana geldiği göz önüne alındığında, tipik çiftleşme oranı (vajinal bir tıkaçla ortaya çıkar, bkz. Şekil 4) yaklaşık% 25'tir. Bu nedenle, östrusta fare kullanmak ve belirli bir deney için gerekli sayıda baraj elde etmek için yeterli sayıda planlamak önemlidir. Östrus döngüsü evresi vajinal smear sitolojisi ile belirlenebilir22. Fiş oranı, çiftleşmeden önce 48 saat dinlenen erkekler ve Whitten etkisinden yararlanılarak geliştirilebilir18. Alternatif olarak, endojen folikül uyarıcı hormonun etkisini taklit eden, oosit olgunlaşmasını indükleyen ve 42-50 saat sonra, endojen luteinize edici hormonun etkisini taklit eden insan koryonik gonadotropin yumurtlamayı indükleyen hamile kısrak serumu uygulanabilir. Bu hormonal tedavi östrus gereksinimini atlar ve hemen hemen tüm tedavi edilen kadınları alıcı hale getirir.
İkinci bir kritik adım, FACS boyama kalitesini sağlamaktır. Akış sitometrisinde kullanılan antikorlar her zaman titratlandırılmalı ve en uygun konsantrasyonda kullanılmalıdır ve enzimatik sindirimin önemli antijenik epitopları ayırmadığını kontrol etmek gerekir. Bir enzimin bir epitopu ayırıp ayırmayacağını değerlendirmek için, biri aynı numunenin iki fraksiyonunu paralel olarak lekeleyebilir, biri enzymatic ve diğeri mekanik sindirime tabi tutulabilir. Benzer şekilde, güvenilir veri elde etmek için uygun kontrollerin ve tek lekelerin kullanılması çok önemlidir. Nadir olaylar için, boncuklar tek leke örnekleri oluşturmak için kullanılabilir. Voltajları kurmak için boncukların değil, lenfositler ve splenositler gibi diğer lökositleri içeren bir hücre popülasyonu kullanılması önerilir. Boncuklar kullanılırsa, boncuk boyama için antikorları titratlamak gerekir, bu nedenle lekeli boncukların floresan yoğunluğu hücrelerin floresan yoğunluğu ile karşılaştırılabilir olacaktır. Belirli bir işaretleyici için pozitifi negatif hücrelerden ayırmakta zorluk çekerse, belirli bir işaretleyici için gating'i kolaylaştırmak için bir FDO kontrolü de kullanılabilir. Hücre içi belirteçler durumunda, hücre içi lekelenme artık ilişkisiz antikorlara neden olabileceğinden, izotip kontrolü kullanılmalıdır, bu da yıkama adımlarından sonra hücrelerde hala bulunabilir ve bu nedenle arka plan sinyalini artırabilir. Mikropluoresans zamanla önemli ölçüde arttığı ve bazı antikorların floresan yoğunluğu zamanla azalabileceğinden, FACS analizi ile fenotiplemede en iyi sonuçları elde etmek için hücrelerin sabitlenerek 24 saat içinde örneklerin çalıştırması önerilir.
Dikkate alınması gereken bir diğer önemli faktör, protokolle elde edilen tek hücreli süspansiyonun aşağı akış uygulamasıdır. Fonksiyonel tahliller için steril koşullarda çalışmak esastır. Benzer şekilde, sonraki omik çalışmaları için steril ve RNaz, DNaz ve proteaz içermeyen çalışmalarda çalışmak önemlidir.
Burada sunulan protokol fenotipleme grubu 1 IC'lere odaklanır, ancak antikor panelini değiştirerek diğer hücre tiplerini fenotipleme için uyarlanabilir. Enzymatik tedavi ile yüzey epitoplarının kaybını/değişimini tespit etmek için tüm antikorların sindirilmiş ve sindirilmemiş hücre süspansiyonlarına karşı test edilmesi önerilir. Benzer şekilde, dokuyu sindirmek ve hücre verimini artırmak için farklı enzimler kullanılabilir, ancak önemli antijenik epitoplar üzerindeki etkisi dikkatlice incelenmelidir. NKp46 dalak NK hücreleri için iyi bir belirteçtir ve laboratuvar farelerinin tüm suşlarında çalışır, C57BL / 6 farelerdeki uNK hücrelerinde NKp46 ifadesi dalak NK hücrelerinden önemli ölçüde daha düşüktür. Aynı anda hem NK1.1 hem de NKp46 için leke yapmak en iyisidir. Birden fazla organ doğrudan karşılaştırılacaksa, dalak veya kemik iliği gibi dokular için enzimematik sindirim gerekli olmasa bile tüm örneklerin eşit şekilde tedavi edilmesi önerilir. Burada sunulan yöntem gebe olmayan rahim için geçerli olsa da, iki fazlı Percoll gradyanı ile lenfosit halka izolasyonu zor olacaktır ve izole edilmiş hücrelerin verimi güvenilir FACS analizi için çok düşük olabilir ve bu nedenle bireysel, hamile olmayan farelerin uterusundan izole edilmiş hücrelerin bir araya toplanmış olmasını gerektirecektir23.
Verilerin yorumlanması için dikkate alınması gereken protokol sınırlamaları vardır. Tüm dokularda olduğu gibi, kandan gelen dolaşımdaki lenfositler doku yerleşik hücrelerin yanında izole edilecektir. Dolaşımdaki lenfositlerin dışlanması veri yorumlama için gerekliyse, dolaşımdaki hücreleri etiketlemek için intravital boyama yapılabilir. Ayrıca, protokole ikinci bir sınırlama, tüm hücreler dokudan çıkarılamayacağı için bazı hücrelerin kaybedileceğidir. En sık karşılaşılan sorunlar ve sorun gidermeleri Tablo 2'de sunulmuştur.
Tarihsel olarak, dokulardaki hücrelerin incelenmesi doku bölümlerinin histolojik incelemesine dayanmıştır. Sandra Peel'in mükemmel incelemesi24 , 80'lerin sonuna kadar 100 yıldan fazla bir süre boyunca yapılan çalışmaları özetliyor. Daha sonra uNK hücreleri olarak bilinen hücrelerin tanımları, lenfositler keşfedilmeden yarım yüzyıldan daha önce yayınlanan el yazmalarında ortaya çıkar. Yani, 1975'te NK hücrelerinin keşfinden önce ve uNK hücreleri maternal glikojen hücreleri veya granül metrial bez hücreleri olarak belirtilmiştir. Anne Croy sahada büyük katkılarda bulundu25 ve nazikça takıma optimize ettiği diseksiyonu öğretti3 ve bu şu anda kullanılıyor. UNK hücrelerinin morfoloji ve doku konumunun tarifinde etkili olmakla birlikte, klasik histolojik inceleme, ilgi çekici hücreler üzerinde sadece birkaç belirteç tespiti ile sınırlıdır. 2008 yılında, rahim lenfositleri üzerinde aynı anda birden fazla belirteci tespit etmek için akış sitometri tabanlı bir yöntem tanımlanmıştır26. Bu esasen bu makalede açıklanan yöntemdir. Mekansal transkriptomi ve kütle sitometrisi ile görüntüleme gibi daha yeni teknolojiler histoloji ve akış-sitometrinin gücünü birleştirerek hem sırasıyla birden fazla gen veya proteinin aynı anda tespit edilmesine hem de normal doku mimarisinin korunmasına olanak sağlar.
Burada açıklanan yöntemin uygulamaları birden fazladır ve FACS fenotipleme, fonksiyonel tahlil (ELISPOT, degranülasyon veya sitotoksik tahliller gibi), hücre sıralama ve sonraki transkriptomik veya proteomikleri içerir. Bu yönteme dayalı olarak geliştirilebilen diğer uygulamalar, hücre sıralama veya negatif tükenme ile zenginleştirmeden sonra desiduel NK hücrelerinin kültürünü ve genişlemesini içerir. Şu anda, IL-2 veya IL-12 ve IL-15 kombinasyonu eklenerek 7-14 gün boyunca geliştirilebilen ve genişletilebilen insan NK hücrelerine benzer şekilde, fare uNK hücrelerini kültürlü ve genişletmek ve canlılıklarını ve işlevlerini uzun bir süre korumak için bir protokol yoktur. Fare uNK hücreleri için böyle bir yöntemin optimizasyonu, fonksiyonel tahliller gerçekleştirirken daha fazla esneklik sağlayacak ve daha yüksek bir hücre numarasıyla birden fazla koşulun test edilmesine izin verecektir. Öte yandan, kültür koşullarının lenfositlerin benzersiz fenotipini ve potansiyel olarak işlevlerini değiştirdiği bilinmektedir.

Burada açıklanan, bireysel gebe uterustan yüksek miktarda uterus doğuştan gelen lenfosit verimi elde etmek için basit bir yöntemdir. Bu yöntem, uterus doğuştan gelen lenfositlerin protein yüzey ekspresyonunu ve işlevselliğini korur ve FACS fenotipleme, RNAseq, proteomik veya fonksiyonel tahliller gibi sonraki uygulamalar için uygundur. Burada, grup 1 uILC'lerin akış sitometrisi ile fenotiplemasına odaklanılma vardır.
Rahim üç katmandan oluşur: endometriyum, miyometriyum ve perimetriyum (Şekil 1). Endometrium, uterusun lümenini kaplayan mukozadır. Corpus luteum tarafından üretilen progesteron, endometriumu yaprak dökenlere dönüştürür. Miyometrium, rahim duvarını oluşturan iki düz kas tabakasından oluşur. Perimetrium, uterusun sarılıp mesometrium adı verilen geniş bağ yoluyla peritona bağlayan serosadır. Uterusun bir kesitinde, lümenin karşısındaki kısma mesometrial taraf, lümene yakın olan kısma ise anti-mesometrial taraf denir. Çeşitli maternal lökositler, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin hücrelerin büyük çoğunluğunu temsil ettiği çeşitli hücre türleri de dahil olmak üzere endometrium ve yaprak dökenleri doldurur. Doğuştan gelen lenfoid hücreler (IC'ler), makrofajlar, dendritik hücreler (DC), CD4+ ve CD8+ T lenfositleri, düzenleyici T hücreleri (Tregs) ve nadir B hücreleri, gebelik boyunca rahim ortamının düzenlenmesinde önemli roller oynayabilir1,2. Rahimdeki IC'ler sadece mukozada değil, farelerdeki miyometriyumda da bulunur. Üç IC grubu da dahil olmak üzere, rahim gerçekten de grup 1 IC'lerin en yoğun yaşadığı organdır. Gebelik boyunca rahim dokularının yapısal dönüşümü ile rahim lökositlerinin sayısı ve oranı da değişmektedir (bkz. Şekil 2A grup 1 uILC alt kümelerinin yüzdeslerindeki farklılıklara bir örnek için)3,4.
Bu makalede farelere atıfta bulunulduğunda, cins laboratuvar farelerinin C57BL/6 suşu kastedilmektedir. Dışlanmış fareler (örneğin, NMRI fareleri) yüksek üreme oranları nedeniyle üreme araştırmalarında sıklıkla kullanılır. Bununla birlikte, tutarlı sonuçlar üretmek için inbred suşlarının kullanılması gereklidir ve immünoloğun en sevdiği genetik arka plan B6 olarak da bilinen C57BL/6'dır.
Orta gebelikteki B6 barajlarındaki rahim lökositlerinin yaklaşık %30'u g1 uILC'lerdir, akış sitometrisi ile uygulanabilir CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+ hücreleri (Şekil 2B): pro-anjiyojenik doku bazlı NK (trNK), geleneksel NK (cNK) üreten IFN-g ve uILC14,5 olarak tanımlanır. UNK hücrelerinin yüzdesi insanlarda daha da yüksektir ve ilk trimester6'da yaklaşık% 70'e ulaşır. İnsan ve fare uNK ve uILC7,8 arasındaki farklılıklardan daha fazla benzerlik vardır. Farklılıkları akılda tutmak önemli olsa da, iki tür üzerinde mevcut bilgileri entegre etmek yararlıdır. İnsanlarda ve laboratuvar kemirgenlerinde uILC'nin araştırılmasından elde edilen bilgileri bir araya getiren NK hücrelerinin, arteriyel integrity9 ve spiral arter tadilatının bakımı da dahil olmak üzere uterusun biyolojisi için gerekli olan homeostatik değişikliklere yardımcı olduğu açıktır11,12 trophoblast istilası. Ayrıca patojenlere karşı savunmada belirli roller oynarlar13,14. Farelerde ve sıçanlarda, implantasyon bölgesinin etrafındaki yaprak döküntünü doldurmanın yanı sıra, NK hücreleri, geçmişte işlevi henüz keşfedilmemiş olan metrial bez olarak da bilinen gebeliğin Mesometrial Lenfoid Agregası (MLAp)15 (Şekil 1B) olarak bilinen geçici bir yapıda barajların miyometriyumunun iki kas tabakası arasında birikir.
Burada açıklanan, mekanik disaggregasyon ve enzimatik sindirim kombinasyonu kullanarak gebe farelerin uterusundan lenfositleri izole etmek için laboratuvarda kullanılan yöntemin ayrıntılı bir protokolüdür. Yöntemde tüm rahim kullanıldığından, gebelik sırasında rahimden izole edilen lenfositler, desidual ve miyometriyal hücrelerin bir karışımıdır. Yaprak döken yaprak döken şeyin rahim duvarından ve MLAp'ından daha fazla diseksiyonu mümkündür ve daha önce tanımlanmıştır16. Burada açıklanan yöntem, protein yüzey ekspresyonini, hücresel işlevselliği ve canlılığı korurken uterus lenfositleri elde etmek için geliştirilmiştir. Sonuç, minimal artık hücresel döküntüye sahip tek bir hücre süspansiyonu ve hamile bir rahim için gebelik ortasında (10,5 gün) tipik olarak 1-5 milyon hücre arasında değişen bir verimdir. Bu yöntemin uygulamaları akış sitometrisi ile fenotiplemi, sonraki transkriptomik veya proteomik çalışmalar için hücre sıralama, hücre içi sitokin üretimi, degranülasyon, ELISPOT veya sitotoksik tahliller gibi fonksiyonel çalışmaları kapsar. Burada sunulan protokol grup 1 IC'leri tanımlamaya odaklanır, ancak FACS analizi için kullanılan antikor panelinde küçük değişikliklerle diğer IRC'ler, T hücreleri, B hücreleri, DC veya makrofajlar gibi diğer hücre tipleri için uyarlanabilir. Protokol ayrıca hücreleri diğer dokulardan izole etmek ve havuza alınan hamile olmayan uteriler için de kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>562701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>562600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49a antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>740262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche (Sigma)</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOMES antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4875-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block Trustain fcx</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10217-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche (Sigma)</td>
			<td>5401089001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer Pharmlyse</td>
			<td>BD</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKp46&#160; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>137608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14030-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 medium + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Violet Fixable Viability dye</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of uterine innate lymphoid cells for analysis by flow cytometry

Burada açıklanan, fare grubu 1 rahim doğuştan gelen lenfoid hücreleri (g1 uLC' ler) akış sitometrisi ile bireysel gebe uterustan izole etmek ve fenotip etmek için basit bir yöntemdir. Protokol, birden fazla senkron baraj elde etmek için zaman çiftleşmesinin nasıl kurulacağını, hamile uterusun mekanik ve enzimatik sindirimini, tek hücreli süspansiyonların lekelenmesini ve g1 UILC'leri fenotip ve ayrımcılık yapmak için bir FACS stratejisini açıklar. Bu yöntem kaçınılmaz olarak doku içindeki hücresel dağılımın mekansal bilgilerini kaybetse de, uILC heterojenliğini, gebeliği etkileyen anne ve foetal faktörlere yanıtlarını, gen ekspresyon profillerini ve işlevlerini belirlemek için protokol başarıyla uygulanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry at JoVE.com

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

Yöntemimiz, hamile ve hamile olmayan hayvanların rahim dokusunda bulunan farklı lenfosit alt nüfuslarının bileşiminin ve fonksiyonel özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar. Bu protokol, proteinin yüzey ekspresyonunun, hücre canlılığının ve işlevselliğinin korunmasını sağlarken uterus lenfositlerinin izolasyonu için izin verir. Bu nedenle, sonraki uygulamalar için uygundur.Deneyin başındaki fetüs çıkarma ve lökosit toplama teknik olarak zorlu adımlardır. Uzun bir deney olduğundan, antikor boyama adımlarına ulaştığınızda özellikle dikkat ve odaklanmaya ihtiyaç vardır. Başlamak için, hamile bir C57 siyah altı dişi fareden elde edilen rahim dokusunu steril bir petri kabına aktarın, daha sonra steril aletler kullanarak dokuyu çevreleyen yağı hafifçe çıkarın ve dokunun kurumasına izin vermemeye dikkat edin.Her implantasyon bölgesini steril aletlerle parçalayarak fetüsleri çıkarın, ardından uterusun bir mililitre toplama ortamı içeren orijinal beş mililitrelik toplama tüpüne geri dönün. Makas kullanarak, toplama tüpündeki dokuyu kıyma, ardından tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra tüpe önceden ısıtılmış üç mililitre önceden ısıtılmış enzymatic sindirim karışımı ekleyin.Enzimatik sindirim aktivitesini geliştirmek için tüpü 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Kuluçka tamamlandıktan sonra, tüpü girdaplayın ve enzymatic aktiviteyi inhibe etmek için buzda tutun, ardından sindirim dokusunu düzgün etiketlenmiş 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Kalan tüm dokuyu toplamak ve 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarmak için beş mililitrelik toplama tüpünü toplam 10 mililitre buz soğuğu beş milimolar EDTA PBS çözeltisi ile durulayın.Sindirilen doku örneğini 400 kez 10 dakika santrifüjleyin G.Süpernatantı atın, peleti hafifçe hareket ettirin ve daha sonra önceden ısıtılmış beş milimoler EDTA PBS çözeltisinin 10 mililitresinde yeniden dürttü. Hücre topaklanmasını azaltmak için, numuneyi ajitasyonla 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından 10 saniye boyunca yüksekte girdaplayın. İlişkisiz dokudaki hücre kümelerini çıkarmak için, steril 50 mililitre santrifüj tüpünün üzerine 70 mikrometrelik bir süzgeç yerleştirin, ardından steril bir mililitre şırınganın pistonunu kullanarak sindirilen dokuyu süzgeçten geçirerek tüpe zorlayın.Tüm hücreleri toplamak için süzgeci toplam 10 mililitre soğuk PBS ile birkaç kez yıkayın, daha sonra 50 mililitre santrifüj tüpünü 400 kez 10 dakika boyunca harcayın G.Süpernatantı attıktan sonra, doğuştan gelen lenfoid hücreler A seçeneği veya B seçeneği kullanılarak izole edilebilir.A seçeneği için, peleti bir pipet voy kullanarak çağrı başına% 80 izotonik beş mililitrede yeniden depolayın. Daha sonra pipet voy'u yavaş hızda kullanarak, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde yeniden dürtilen peletin üzerine çağrı çözeltisi başına% 40 olmak üzere sekiz mililitreyi dikkatlice kaplayın. Pipet yavaşça ve sürekli olarak, 15 mililitreyi yaklaşık 45 derecelik bir açıyla tutar.Kaplamayı bozmadan, tüpü orta hızlanma ve oda sıcaklığında minimum molalarla 850 kat G'de 20 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, çağrı başına katmanları rahatsız etmeden tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın. Daha sonra, çağrı başına iki çözeltinin arayonundaki lökosit halkasını bozmadan, çağrı katmanı başına üst kısmın 0,5 ila bir mililitresi hariç hepsini atmak için steril bir pastör pipet kullanın.Pipete emilen çağrı başına çözelti miktarını minimumda tutmaya çalışırken, lökosit halkasını dikkatlice toplayın ve hücreleri yeni etiketli 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Hücrelere% 10 ısı ve aktif FBS ile desteklenmiş 10 mililitre steril RPMI ortamı ekleyin, ardından hücreleri 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatant atın ve kırmızı kan hücresi lizizine devam edin.B seçeneğini kullanarak hücreleri izole etmek için, sindirilen dokuyu hücre süzgecinden geçirdikten ve sonucu daha önce gösterildiği gibi hücre süspansiyonunda santrifüjledikten sonra, peleni çağrı başına sekiz mililitre % 35 izotonik ve RPMI ortamı ile yeniden biriktirin ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü orta hızlanma ve minimum molalarla oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 940 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra bir aspiratör veya pipet voy kullanarak, peleti% 10 ısı ve aktif FBS ile desteklenmiş 14 mililitre RPMI ortamında yeniden canlandırmadan önce süpernatantı dikkatlice epire edin.Örneği 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin, ardından aspirasyonla süpernatantı atın ve kırmızı kan hücresi lizizine ilerleyin. Kırmızı kan hücrelerini iz bırakmak için, numuneyi bir X kırmızı kan hücresi liz çözeltisinin üç mililitresinde yeniden depolayın ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yayalım, ardından reaksiyonu durdurmak için numuneye 10 mililitre PBS ekleyin. Süpernatantı attıktan sonra tüpü beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin, 10 mililitre pbs daha ekleyin ve santrifüjü tekrarlayın.Peleti% 10 ısı inaktive FBS ile desteklenmiş bir mililitre RPMI ortamında yeniden kaydedin, ardından hücre süspansiyonunu steril bir 70 mikrometre hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri saydıktan sonra hücre süspansiyonunun konsantrasyonu 100 mikrolitre PBS'de bir ila 2 milyon hücreye ayarlanır ve lekeleme ve faks analizine devam eder. Uterus grubu bir LC'ler geleneksel NK hücrelerini, doku yerleşik NK hücrelerini ve yaşam ve hamilelik sırasında değişen yüzdeleriyle grup bir LC'leri içerir.Bu alt kümeler, akış sitometrisi kullanılarak, önce hücreleri ışığı dağıtma yeteneklerine göre gating, daha sonra tek satın alınabilir CD 45 pozitif CD üç negatif CD 19 negatif hücreyi yalıtarak ve ardından NK 1.1 ve NKP 46 pozitif olan birinci grup IC'leri tanımlayarak ayırt edilebilir. Grup bir IRC'lerde, CD49A negatif EM'ler pozitif geleneksel NK hücreleridir. CD49A pozitif Ems pozitif hücreler doku yerleşik NK hücreleridir.Ve CD49 pozitif Ems negatif hücreleri grup bir rahim ICC'leridir. Dalak ve rahim lenfositlerinin anti NK P46 ve anti NK 1.1 antikorları ile lekelenmesi, dalak lenfositlerinin yüzeylerinde uterus meslektaşlarından daha yüksek miktarda NKP 46 ifade ettiğini göstermektedir. Enzimmatik doku ayrışmasında, sindirim ortamında kullanılan enzimlere bağlı olarak yüzey epitopları değiştirilebilir.Örneğin, liberaz TM kullanıldığında MHC CD49 NKG2A reseptörü için boyama zayıftır. Ancak liberaz DH ile sindirim, 1611 antikor klonu tarafından NKG2A tanımayı korur. Gebelik günü 8.5'te rahim dokusu örneklerinde bulunan birinci grup IC'lerin yaklaşık %6.5'i kan türemiştir.Kan kirleticiler, florokrom ile konjuge edilen anti CD45 antikorları ile intravital lekeleme yoluyla dışlanabilir. Zaman toplantıları için ayarlarken, farelerin gece olduğunu göz önünde bulundurmalısınız. Bu nedenle, gece boyunca çiftleşme meydana geldiğinden öğleden sonra mümkün olduğunca geç kurulmalıdırlar.Ayrıca dişileri seçerken, vajinal septuma sahip olmadıklarına emin olmalısınız. Hücrelerin dışındaki ve içindeki birçok proteine bakmak için tipik olarak akış sitometrisi analizi yaparız. Ayrıca RNA dizilimi de dahil olmak üzere gen ekspresyonını incelemek için nükleik asit ekstraksiyonu yapıyoruz.Ayrıca rahim doğuştan gelen lenfoid hücrelerin yanıtlarını incelemek için fonksiyonel tahlilleri de yapıyoruz.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Bademcikler Mononükleer Hücrelerin İzolasyon Ex Vivo Doğuştan Gelen Bağışıklık Yanıtları Bir İnsan Mukozal Lenfoid Doku Çalışma

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...