Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

تم دعم أجزاء من العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة R01 DK122160 و R01 HL139335 و U24 DK112349

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في البروتوكول المتعلقة بالعينات / الأنسجة الحيوانية أو البشرية من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية والحيوانية واتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية.
1. عينة التجانس / التحلل
<ol><li>عينات الأنسجة المجمدة<ol><li>فرم الأنسجة المجمدة (~ 30 مجم) عل?...

تم استخدام الالتقاط بمساعدة الراتنج عبر مجموعة متنوعة من أنواع العينات والأنظمة البيولوجية للتحقيق في التعديلات التأكسدية لبقايا السيستين25،29،30. تسمح هذه الطريقة بتقييم العينات على مستويات وقراءات متعددة ، بما في ذلك البروتينات والببت...

في ظل ظروف الاستتباب ، تولد الخلايا أنواعا تفاعلية من الأكسجين أو النيتروجين أو الكبريت تساعد على تسهيل العمليات ، مثل التمثيل الغذائي والإشارات1،2،3 ، وتمتد إلى كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى. المستويات الفسيولوجية لهذه الأنواع التفاعلية ضرورية للوظيفة الخلوية المناسبة ، والمعروفة أيضا باسم "eustress"1,4. في المقابل ، يمكن أن تؤدي زيادة المؤكسدات التي تؤدي إلى اختلال التوازن بين المؤكسدات ومضادات الأكسدة إلى الإجهاد التأكسدي ، أو "الضيق"1 ، مما يؤدي إلى تلف الخلايا. تقوم المواد المؤكسدة بتحويل الإشارات إلى مسارات بيولوجية عن طريق تعديل الجزيئات الحيوية المختلفة ، بما في ذلك البروتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي والدهون. على وجه الخصوص ، بقايا السيستين من البروتينات هي مواقع شديدة التفاعل عرضة للأكسدة بسبب مجموعة الثيول على السيستين ، والتي تتفاعل مع أنواع مختلفة من المؤكسدات5. وهذا يؤدي إلى مجموعة متنوعة من التعديلات اللاحقة للترجمة القائمة على الأكسدة والاختزال (PTMs) للسيستين ، بما في ذلك النيتروسيل (SNO) ، والغلوتاثيونيل (SSG) ، والسلفنيل (SOH) ، والكبريت (SSH) ، والكبريت (SSnH) ، والأسيلة ، وثاني كبريتيد. تشمل الأشكال التي لا رجعة فيها من أكسدة السيستين الكبريتنيل (SO2H) والسلفونيل (SO3H).
قد تؤدي التعديلات المؤكسدة القابلة للانعكاس لبقايا السيستين أدوارا وقائية تمنع المزيد من الأكسدة التي لا رجعة فيها أو تعمل كجزيئات إشارات للمسارات الخلوية في اتجاه مجرى النهر 6,7. تسمح قابلية انعكاس بعض PTMs الأكسدة والاختزال ثيول لمواقع السيستين بالعمل ك "مفاتيح أكسدة"8,9 ، حيث تؤدي التغييرات في حالة الأكسدة والاختزال لهذه المواقع إلى تغيير وظيفة البروتين لتنظيم دورها في العمليات العابرة. لوحظت التأثيرات التعديلية ل PTMs10 الأكسدة والاختزال في العديد من جوانب وظيفة البروتين11 ، بما في ذلك الحفز 12 ، تفاعلات البروتين والبروتين13 ، تغيير التشكيل14 ، تنسيق أيون المعادن 15 ، أو ربط المثبط الدوائي16. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك PTMs الأكسدة والاختزال في مواقع السيستين للبروتينات التي تنظم المسارات مثل النسخ17 أو الترجمة 18 أو التمثيل الغذائي19. بالنظر إلى تأثير الأكسدة والاختزال PTMs على وظيفة البروتين والعمليات البيولوجية ، من المهم تحديد مدى الأكسدة التي يخضع لها موقع السيستين استجابة لاضطراب حالة الأكسدة والاختزال.
يركز تحديد مواقع السيستين ذات حالات الأكسدة والاختزال المتغيرة على مقارنة حالة الأكسدة على المستوى الخاص بالموقع بين الظروف الطبيعية والمضطربة. غالبا ما تستخدم قياسات تغيير الطيات لتحديد المواقع التي تم تغييرها بشكل كبير لأن هذا يساعد المستخدمين على تفسير مواقع السيستين التي قد تكون ذات أهمية فسيولوجية للدراسة. بدلا من ذلك ، تعطي القياسات المتكافئة لأكسدة الثيول القابلة للانعكاس عبر نوع معين من العينة صورة عامة للحالة الفسيولوجية فيما يتعلق بالأكسدة الخلوية ، وهو قياس مهم غالبا ما يتم تجاهله وعدم استخدامه. يعتمد القياس الكيميائي للتعديل على تحديد النسبة المئوية للثيول المعدل كنسبة إلى إجمالي ثيول البروتين (المعدل وغير المعدل)20,21. نتيجة لذلك ، توفر القياسات المتكافئة قياسا أكثر دقة من تغيير الطي ، خاصة عند استخدام مطياف الكتلة. يمكن التحقق من أهمية الزيادة في الأكسدة بسهولة أكبر باستخدام القياس المتكافئ لتحديد إشغال PTM لموقع سيستين معين. على سبيل المثال ، يمكن أن تنتج زيادة 3 أضعاف في أكسدة الثيول عن انتقال أقل من 1٪ إلى 3٪ أو ما يصل إلى 30٪ إلى 90٪. قد يكون لزيادة الأكسدة بمقدار 3 أضعاف لموقع بنسبة إشغال 1٪ فقط تأثير ضئيل على وظيفة البروتين. ومع ذلك ، فإن زيادة 3 أضعاف لموقع مع إشغال 30 ٪ في حالة الراحة قد تتأثر بشكل كبير. يمكن أن تكشف القياسات المتكافئة ، عند إجراؤها بين إجمالي الثيول المؤكسد والتعديلات المؤكسدة المحددة ، بما في ذلك الجلوتاثيونيل البروتيني (SSG) والنيتروسيل (SNO) ، عن النسب والمعلومات الكمية فيما يتعلق بأنواع تعديل محددة.
نظرا لأن أكسدة الثيول العكسية عادة ما تكون تعديلا ما بعد الترجمة منخفض الوفرة ، فقد تم تطوير طرق متعددة لإثراء البروتينات التي تحتوي على هذه التعديلات من العينات البيولوجية. يتضمن النهج المبكر الذي ابتكره جافري وآخرون ، المسمى تقنية تبديل البيوتين (BST)22 ، خطوات متعددة حيث يتم حظر الثيول غير المعدل من خلال الألكلة ، ويتم تقليل الثيول المعدل بشكل عكسي إلى ثيول حر ناشئ ، ويتم تمييز الثيول الحر الناشئ بالبيوتين ، ويتم إثراء البروتينات الموسومة عن طريق سحب تقارب الستربتافيدين إلى أسفل. تم استخدام هذه التقنية لتحديد SNO و SSG في العديد من الدراسات ويمكن تكييفها للتحقيق في أشكال أخرى من أكسدة الثيول القابلة للانعكاس23,24. بينما تم استخدام BST للتحقيق في أشكال مختلفة من أكسدة الثيول القابلة للانعكاس ، فإن أحد المخاوف في هذا النهج هو أن التخصيب يتأثر بالارتباط غير المحدد للبروتينات غير الحيوية بالستربتافيدين. نهج بديل تم تطويره في مختبرنا ، يسمى الالتقاط بمساعدة الراتنج (RAC) 25،26 (الشكل 1) ، يتحايل على مسألة إثراء مجموعات الثيول عبر نظام البيوتين ستربتافيدين.
بعد الحد من الثيول المؤكسد عكسيا ، يتم إثراء البروتينات ذات الثيول الحرة الوليدة بواسطة راتنج تقارب الثيول ، الذي يلتقط تساهميا مجموعات الثيول الحرة ، مما يسمح بتخصيب أكثر تحديدا للبروتينات المحتوية على السيستين من BST. إن اقتران RAC مع قوة تعدد الإرسال للتطورات الحديثة في وضع العلامات متساوية الضغط وقياس الطيف الكتلي يخلق سير عمل قويا وحساسا لإثراء وتحديد وقياس بقايا السيستين المؤكسدة بشكل عكسي على مستوى البروتين. مكنت التطورات الحديثة في قياس الطيف الكتلي من التنميط الأعمق بكثير لبروتين الأكسدة والاختزال الثيول ، مما زاد من فهم كل من سبب وتأثير أكسدة ثيول البروتين27. تسمح المعلومات المكتسبة من البيانات الكمية الخاصة بالموقع بإجراء مزيد من الدراسات للتأثيرات الميكانيكية والآثار النهائية للتعديلات المؤكسدة العكسية28. وقد وفر استخدام سير العمل هذا نظرة ثاقبة للتأثيرات الفسيولوجية لأكسدة السيستين القابلة للانعكاس فيما يتعلق بالأحداث الفسيولوجية الطبيعية مثل الشيخوخة ، حيث اختلفت مستويات SSG فيما يتعلق بالعمر. تم عكس تأثيرات الشيخوخة على SSG جزئيا باستخدام SS-31 (elamipretide) ، وهو ببتيد جديد يعزز وظيفة الميتوكوندريا ويقلل من مستويات SSG في الفئران المسنة ، مما يتسبب في أن يكون لديهم ملف تعريف SSG أكثر تشابها مع الفئران الصغيرة29.
وقد تبين أن الظروف الفيزيولوجية المرضية المنسوبة إلى التعرض للجسيمات النانوية تنطوي على SSG في نموذج البلاعم الفئرانية. باستخدام RAC إلى جانب قياس الطيف الكتلي ، أظهر المؤلفون أن مستويات SSG كانت مرتبطة ارتباطا مباشرا بدرجة الإجهاد التأكسدي وضعف وظيفة البلعمة البلاعمية. كشفت البيانات أيضا عن اختلافات خاصة بالمسار استجابة للمواد النانوية الهندسية المختلفة التي تحفز درجات مختلفة من الإجهاد التأكسدي30. أثبتت الطريقة أيضا فائدتها في الأنواع بدائية النواة ، حيث تم تطبيقها لدراسة تأثيرات الدورات النهارية في البكتيريا الزرقاء الضوئية فيما يتعلق بأكسدة الثيول. لوحظت تغيرات واسعة في أكسدة الثيول عبر العديد من العمليات البيولوجية الرئيسية ، بما في ذلك نقل الإلكترون ، وتثبيت الكربون ، وتحلل السكر. علاوة على ذلك ، من خلال التحقق المتعامد ، تم تأكيد تعديل العديد من المواقع الوظيفية الرئيسية ، مما يشير إلى الأدوار التنظيمية لهذه التعديلات المؤكسدة6.
هنا ، نصف تفاصيل سير العمل الموحد (الشكل 1) ، مما يدل على فائدة نهج RAC لإثراء إجمالي ثيول السيستين المؤكسد للبروتينات ووضع العلامات اللاحقة والقياس الكمي المتكافئ. تم تنفيذ سير العمل هذا في دراسات حالة الأكسدة والاختزال في أنواع مختلفة من العينات ، بما في ذلك مزارع الخلايا27،30 والأنسجة الكاملة (على سبيل المثال ، العضلات الهيكلية والقلب والرئة)29،31،32،33. على الرغم من عدم تضمينه هنا ، إلا أن بروتوكول RAC يمكن تكييفه بسهولة للتحقيق في أشكال محددة من تعديلات الأكسدة والاختزال القابلة للانعكاس ، بما في ذلك SSG و SNO و S-acylation ، كما ذكرنا سابقا25،29،34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

ظهرت مؤخرا تعديلات مؤكسدة عكسية على ثيول البروتين كوسطاء مهمين للوظيفة الخلوية. فيما يلي وصف الإجراء التفصيلي لطريقة البروتينات الكمية للأكسدة والاختزال التي تستخدم الالتقاط بمساعدة الراتنج (RAC) بالاشتراك مع وضع العلامات متساوية الضغط لعلامة الكتلة الترادفية (TMT) وقياس الطيف الكتلي الترادفي اللوني السائل (LC-MS / MS) للسماح بالقياس الكمي العشوائي المتعدد لثيول البروتين المؤكسد على مستوى البروتين. توفر المعلومات الكمية الخاصة بالموقع حول بقايا السيستين المؤكسدة نظرة ثاقبة إضافية للتأثيرات الوظيفية لهذه التعديلات. 
سير العمل قابل للتكيف عبر العديد من أنواع العينات ، بما في ذلك الخلايا المستزرعة (على سبيل المثال ، الثدييات ، بدائية النواة) والأنسجة الكاملة (مثل القلب والرئة والعضلات) ، والتي يتم تحللها / تجانسها في البداية ومع ألكيلات الثيول الحرة لمنع الأكسدة الاصطناعية. ثم يتم تقليل ثيول البروتين المؤكسد والتقاطه بواسطة راتنج تقارب الثيول ، والذي يبسط ويبسط خطوات سير العمل من خلال السماح بإجراء إجراءات الهضم ووضع العلامات والغسيل دون نقل إضافي للبروتينات / الببتيدات. أخيرا ، يتم استخلاص الببتيدات الموسومة وتحليلها بواسطة LC-MS / MS للكشف عن التغيرات المتكافئة الشاملة المتعلقة بأكسدة الثيول عبر البروتين بأكمله. تعمل هذه الطريقة على تحسين فهم دور التنظيم المعتمد على الأكسدة والاختزال بشكل كبير في ظل الحالات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية المتعلقة بأكسدة ثيول البروتين.

سيؤدي إكمال البروتوكول إلى إثراء محدد للغاية للببتيدات المحتوية على السيستين المؤكسدة سابقا ، غالبا مع خصوصية >95٪27،35،36. ومع ذلك، تتطلب عدة خطوات رئيسية للبروتوكول اهتماما خاصا، على سبيل المثال، الحجب الأولي للثيول الحر قبل تحلل العينة/?...

Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

أكسدة ثيول البروتين لها آثار كبيرة في ظل الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية الطبيعية الطبيعية. وصفنا تفاصيل طريقة البروتينات الأكسدة والاختزال الكمية ، والتي تستخدم الالتقاط بمساعدة الراتنج ، ووضع العلامات متساوية الضغط ، وقياس الطيف الكتلي ، مما يتيح التحديد والقياس الكمي لبقايا السيستين المؤكسدة عكسيا من البروتينات.

الالتقاط بمساعدة الراتنج إلى جانب وضع علامات الكتلة الترادفية متساوية الضغط من أجل القياس الكمي المضاعف لأكسدة ثيول البروتين

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

يصف هذا البروتوكول طريقة تمكن من تحديد موقع معين لبقايا السيستين المؤكسدة للبروتينات. تسمح هذه الطريقة بتوليد بيانات كمية ومحددة الموقع لبقايا السيستين المؤكسدة من أنواع مختلفة من العينات. لبدء إجراء الالتقاط المساعد ، اغسل كريات البروتين المترسبة مرتين باستخدام الأسيتون عن طريق الطرد المركزي عند 20،500 جم ، في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.ثم صب الأسيتون وإزالة الأسيتون المتبقي مع ماصة صغيرة. باستخدام ماصة مصلية زجاجية ، أضف ثلاثة ملليلتر من الأسيتون البارد المثلج الطازج إلى الأنبوب واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. بعد الغسيل الثاني ، اترك الكريات تجف في الهواء لمدة دقيقة إلى دقيقتين دون تركها تجف.أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت B إلى حبيبات البروتين المجففة. لإذابة البروتين ، صوتنة الحبيبات بشكل متكرر في سونيكاتور الحمام بإخراج 250 واط لمدة 15 إلى 30 ثانية في المرة الواحدة ، جنبا إلى جنب مع دوامة قصيرة. قم بإجراء فحص حمض Bicinchoninic أو BCA لقياس تركيز البروتين.لتوحيد تركيزات البروتين ، انقل 500 ميكروغرام من عينة البروتين إلى مرشح طرد مركزي 0.5 ملليلتر ، 10 كيلودالتون ، وقم بزيادة حجم العينة إلى 500 ميكرولتر مع مخزن مؤقت لإعادة التعليق. الطرد المركزي خليط عازلة البروتين في 14،000 غرام في درجة حرارة الغرفة ، حتى الحجم في مرشح الطرد المركزي أقل من 100 ميكرولتر. اجمع العينة عن طريق قلب المرشح في أنبوب تجميع.قم بالطرد المركزي للعينة عند 1000 G لمدة دقيقتين وأضف المخزن المؤقت C للحصول على حجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر. لتقليل ثيول البروتين ، أضف 20 ميكرولتر من 500 ملليمولار ديثيوثريتول أو DTT ، إلى العينة للحصول على تركيز نهائي قدره 20 ملي مولار ، واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة. بعد التخفيض ، يتم الطرد المركزي للعينات إلى مرشحات طرد مركزي 0.5 ملليلتر 10 كيلودالتون عند 14،000 G في درجة حرارة الغرفة ، حتى يكون الحجم في مرشح الطرد المركزي أقل من 100 ميكرولتر.أضف المخزن المؤقت D لتعويض الحجم إلى 500 ميكرولتر وكرر الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي الرابع ، اجمع العينات عن طريق قلب المرشح في أنبوب تجميع إلى جهاز طرد مركزي عند 1000 جم لمدة دقيقتين. ثم قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة BCA.بعد ذلك ، ضع أعمدة الدوران على مشعب فراغ ، وباستخدام ماصة صغيرة ، قم بنقل 500 ميكرولتر من ملاط راتنج تقارب الثيول الطازج إلى كل عمود. تطبيق فراغ لإزالة الماء. كرر الإجراء مرة واحدة للحصول على 30 ملليغرام من الراتنج لكل عمود.اغسل الراتنج خمس مرات ب 500 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، عن طريق وضع فراغ لإزالة الماء ثم خمس مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت E.In أنبوب جديد ، أضف المخزن المؤقت C إلى 150 ميكروغرام من عينة البروتين المختزلة حتى يصبح الحجم النهائي 120 ميكرولتر. انقل محلول البروتين إلى عمود دوران موصول يحتوي على الراتنج. ضع الغطاء على العمود واحتضانه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.اغسل الراتنج كما هو موضح في المخطوطة. استبدل القابس. لإجراء عملية الهضم التربتيك على الراتنج ، أضف 120 ميكرولترا من محلول التربسين الطازج إلى العينات ، واحتضن العمود طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.في اليوم التالي ، اغسل الراتنج عدة مرات كما هو موضح في المخطوطة واستبدل القابس. باستخدام ماصة صغيرة ، أضف 40 ميكرولتر من 100 مليمولار ثلاثي إيثيل أمونيوم بيكربونات عازلة إلى الراتنج المغسول. ثم أضف 70 ميكرولتر من علامة الكتلة الترادفية الذائبة أو كاشف وضع العلامات TMT ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.قم بتخزين أي كاشف TMT متبقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. اغسل الراتنج واستبدل القابس. قم بتخفيف الببتيدات المسماة TMT بإضافة 100 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم 100 مللي مولار عند الرقم الهيدروجيني 8.0 ، الذي يحتوي على 20 ملليمولار DTT ، إلى العمود ، واحتضان العمود على خلاط حراري في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة عند 850 دورة في الدقيقة.بعد الحضانة ، قم بإجراء الشطف عن طريق وضع العمود على مشعب فراغ ، وتطبيق الفراغ وتفريغ العينات في أنبوب طرد مركزي صغير سعة خمسة ملليلتر. كرر الخطوة مرة واحدة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من 80٪ أسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك إلى العمود. بعد احتضان العمود لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بإخراج العينة في نفس أنبوب الطرد المركزي سعة خمسة ملليلتر.ضع العينات المستخلصة في مكثف فراغ حتى تجف. ثم قم بتخزين الببتيدات الجافة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم استخدامها مرة أخرى. تم إجراء التحليل النوعي لعينات الببتيد من خلايا RAW 264.7 باستخدام SDS-PAGE ، حيث تمت مقارنة العينات من خلال تحديد مستويات مختلفة من الأكسدة بسبب العلاجات.تم فحص البروتينات المنفصلة لاحقا بواسطة Western Blot لمزيد من التحقيق في مستويات أكسدة البروتينات الفردية. تم تحليل كثافة الأيونات المبلغ عنها للسيستين المحتوي على الببتيدات بواسطة مطياف الكتلة الترادفي اللوني السائل. تم تحديد القياس الكيميائي لأكسدة الثيول ل iTRAQ ، المسمى الببتيدات المخصبة والمؤكسدة على مستويات موقع السيستين الفردية.قم بإزالة الأسيتون بعناية دون إزعاج حبيبات البروتين. تأكد من أن حبيبات البروتين قابلة للذوبان تماما ومحددة كميا بدقة, وأن الراتنج مخصص بدقة لأعمدة الدوران. تأكد من إعادة تعليق الراتنج أثناء خطوات الغسيل.يمكن إجراء مزيد من التقييم للبروتينات والببتيدات المخصبة بواسطة SDS-PAGE والتلوين والنشاف الغربي وقياس الطيف الكتلي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...