Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

部分工作得到了NIH资助R01 DK122160，R01 HL139335和U24 DK112349的支持。

协议中描述的与动物或人类样本/组织有关的所有程序均由人类和动物研究伦理委员会的批准并遵循其机构指南。
1. 样品均质/裂解
<ol><li>冷冻组织样本<ol><li>使用预冷的剃须刀片和镊子在干冰上的玻璃显微镜载玻片上切碎冷冻组织（~30毫克）。将切碎的组织转移到含有 700 μL 缓冲液 A 的预冷 5 mL 圆底聚苯乙烯管中（参见 表 1），并在冰上孵育 30 分钟，避光。</li>...

树脂辅助捕获已用于各种样品类型和生物系统，用于研究半胱氨酸残基的氧化修饰25，29，30。该方法允许在多个水平和读数下评估样品，包括使用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析的蛋白质和肽，以及使用质谱法评估单个半胱氨酸位点。无论样品类型或最终终点如何，该方法最终都能高效、特异性地富集含半胱氨酸的蛋白质和肽<sup class...

在稳态条件下，细胞产生活性氧、氮或硫物质，有助于促进代谢和信号传导等过程1，2，3，延伸到原核生物和真核生物。这些反应性物质的生理水平是正常细胞功能所必需的，也称为“良性应激”1，4。相反，氧化剂的增加导致氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡会导致氧化应激或“痛苦”1，从而导致细胞损伤。氧化剂通过修饰不同的生物分子（包括蛋白质、DNA、RNA 和脂质）将信号转导到生物途径。特别是，蛋白质的半胱氨酸残基是高反应性位点，由于半胱氨酸上的硫醇基团而容易氧化，其对不同类型的氧化剂具有反应性5。这产生了多种基于半胱氨酸的可逆氧化还原翻译后修饰（PTM），包括亚硝基化（SNO），谷硫酰化（SSG），亚磺酰化（SOH），过硫化（SSH），多硫化（SSNH），酰化和二硫化物。半胱氨酸氧化的不可逆形式包括亚磺酰化（SO2H）和磺酰化（SO3H）。
半胱氨酸残基的可逆氧化修饰可以起到保护作用，防止进一步不可逆氧化，或作为下游细胞途径的信号分子6，7。一些硫醇氧化还原PTM的可逆性允许半胱氨酸位点作为“氧化还原开关”8，9，其中这些位点的氧化还原状态的变化会改变蛋白质功能以调节它们在瞬时过程中的作用。氧化还原PTMs 10的调节作用已在蛋白质功能11的许多方面观察到，包括催化12，蛋白质 - 蛋白质相互作用13，构象变化14，金属离子配位15或药理抑制剂结合16。此外，氧化还原PTM参与调节转录17、翻译18或代谢19等途径的蛋白质的半胱氨酸位点。鉴于氧化还原PTM对蛋白质功能和生物过程的影响，量化半胱氨酸位点响应氧化还原状态扰动而经历的氧化程度非常重要。
具有氧化还原状态改变的半胱氨酸位点的鉴定侧重于正常和扰动条件之间位点特异性水平的氧化态比较。倍数变化测量通常用于确定哪些位点发生显着改变，因为这有助于用户解释哪些半胱氨酸位点可能对研究具有生理意义。或者，对特定样品类型的可逆硫醇氧化进行化学计量测量，可以大致了解细胞氧化的生理状态，这是一项经常被忽视和未充分利用的重要测量。修饰化学计量法基于量化修饰硫醇的百分比与总蛋白硫醇（修饰和未修饰）的比率20，21。因此，化学计量测量提供了比倍数变化更精确的测量，尤其是在使用质谱时。通过使用化学计量法来确定特定半胱氨酸位点的PTM占用率，可以更容易地确定氧化增加的意义。例如，硫醇氧化增加3倍可能是由于低至1%至3%或大至30%至90%的转变所致。对于仅占1%的位点，氧化增加3倍可能对蛋白质的功能几乎没有影响;然而，对于处于休息状态的占用率为 30% 的站点，增加 3 倍可能会受到更大的影响。在总氧化硫醇和特定氧化修饰（包括蛋白质谷硫酰化 （SSG） 和亚硝基化 （SNO））之间进行化学计量测量时，可以揭示有关特定修饰类型的比率和定量信息。
由于可逆硫醇氧化通常是一种低丰度的翻译后修饰，因此已经开发了多种方法来富集生物样品中含有这些修饰的蛋白质。Jaffrey和其他人设计的一种早期方法，称为生物素转换技术（BST）22，涉及多个步骤，其中未修饰的硫醇通过烷基化被阻断，可逆修饰的硫醇被还原为新生的游离硫醇，新生的游离硫醇被生物素标记，标记的蛋白质通过链霉亲和素亲和力下拉富集。该技术已在许多研究中用于分析SNO和SSG，并且可以适应于探测其他形式的可逆硫醇氧化23，24。虽然BST已被用于探测不同形式的可逆硫醇氧化，但这种方法的一个问题是富集受到未生物素化蛋白质与链霉亲和素的非特异性结合的影响。我们实验室开发的另一种方法称为树脂辅助捕获（RAC）25，26 （图1），它避免了通过生物素 - 链霉亲和素系统富集硫醇基团的问题。
在可逆氧化的硫醇还原后，具有新生游离硫醇的蛋白质被硫醇亲和树脂富集，该树脂共价捕获游离硫醇基团，允许比BST更特异性地富集含半胱氨酸的蛋白质。将RAC与同量异位标记和质谱分析的最新进展的多重功能相结合，为蛋白质组范围内可逆氧化的半胱氨酸残基的富集、鉴定和定量创造了一个强大而灵敏的工作流程。质谱技术的最新进展使得能够对硫醇氧化还原蛋白质组进行更深入的分析，从而增加了对蛋白质硫醇氧化的原因和影响的理解27。从特定地点的定量数据中获得的信息可以进一步研究可逆氧化修饰的机理影响和下游影响28.利用该工作流程可以深入了解可逆半胱氨酸氧化对正常生理事件（如衰老）的生理影响，其中SSG水平随年龄而不同。使用SS-31（elamipretide）部分逆转了对SSG的衰老影响，SS-31是一种新型肽，可增强老年小鼠的线粒体功能并降低SSG水平，使它们具有与年轻小鼠更相似的SSG谱29。
归因于纳米颗粒暴露的病理生理条件已被证明涉及小鼠巨噬细胞模型中的SSG。使用RAC与质谱联用，作者表明SSG水平与氧化应激程度和巨噬细胞吞噬功能受损直接相关。数据还揭示了对诱导不同程度氧化应激的不同工程纳米材料响应的途径特异性差异30。该方法还证明了其在原核物种中的实用性，用于研究光合蓝藻中昼夜循环对硫醇氧化的影响。观察到硫醇氧化在几个关键生物过程中的广泛变化，包括电子传递、碳固定和糖酵解。此外，通过正交验证，确认了几个关键功能位点被修饰，表明这些氧化修饰的调节作用6。
在本文中，我们描述了标准化工作流程（图1）的细节，展示了RAC方法富集蛋白质总氧化半胱氨酸硫醇及其随后标记和化学计量定量的实用性。该工作流程已在不同样品类型的氧化还原状态研究中实施，包括细胞培养物27，30和整个组织（例如骨骼肌，心脏，肺）29，31，32，33。虽然此处未包括，但RAC方案也很容易适用于研究特定形式的可逆氧化还原修饰，包括SSG，SNO和S-酰化，如前所述25，29，34。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

蛋白质硫醇的可逆氧化修饰最近已成为细胞功能的重要介质。本文描述了定量氧化还原蛋白质组学方法的详细程序，该方法利用树脂辅助捕获（RAC）与串联质量标签（TMT）同量异位标记和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）相结合，允许在蛋白质组水平上对氧化蛋白硫醇进行多重随机定量。关于氧化半胱氨酸残基的位点特异性定量信息为这种修饰的功能影响提供了额外的见解。 
该工作流程适用于多种样品类型，包括培养细胞（例如，哺乳动物，原核生物）和整个组织（例如，心脏，肺，肌肉），它们最初被裂解/匀浆化，游离硫醇被烷基化以防止人工氧化。然后，氧化的蛋白质硫醇被硫醇亲和树脂还原和捕获，通过允许在不额外转移蛋白质/肽的情况下执行正在进行的消化、标记和洗涤程序，从而简化和简化工作流程步骤。最后，通过LC-MS/MS洗脱和分析标记的肽，以揭示整个蛋白质组中与硫醇氧化相关的全面化学计量变化。该方法大大提高了对氧化还原依赖性调节在与蛋白硫醇氧化相关的生理和病理生理状态下的作用的理解。

该方案的完成将导致以前氧化的含半胱氨酸肽的高度特异性富集，通常具有>95%的特异性27，35，36。然而，该方案的几个关键步骤需要特别注意，例如，在样品裂解/均质化之前对游离硫醇进行初始封闭，这禁止人工氧化和人工氧化硫醇的非特异性富集25。样品可以在方案的几个阶段和不同的方法进行分析，包?...

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Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

蛋白硫醇氧化在正常的生理和病理生理条件下具有显著意义。我们描述了定量氧化还原蛋白质组学方法的细节，该方法利用树脂辅助捕获，同量异位标记和质谱，能够对蛋白质的可逆氧化半胱氨酸残基进行位点特异性鉴定和定量。

树脂辅助捕获与同量异位串联质量标签标记相结合，用于蛋白质硫醇氧化的多重定量

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

该协议描述了一种能够对蛋白质的氧化胱氨酸残基进行位点特异性鉴定的方法。该方法允许从各种样品类型中生成氧化胱氨酸残基的定量和位点特异性数据。要开始辅助捕获程序，用丙酮在4摄氏度下以20，500G离心10分钟，用丙酮洗涤沉淀的蛋白质沉淀两次。然后倒出丙酮并用微量移液管除去剩余的丙酮。使用玻璃血清移液管向试管中加入三毫升新鲜冰冷的丙酮，并通过将试管倒置几次来充分混合。第二次洗涤后，让颗粒风干一到两分钟，不要让它们过度干燥。向干燥的蛋白质沉淀中加入一毫升缓冲液B。为了溶解蛋白质，在输出为250瓦的浴超声仪中重复超声处理沉淀，一次15至30秒，同时进行短暂的涡旋。进行二辛可宁酸或BCA测定以测量蛋白质浓度。为了标准化蛋白质浓度，将500微克蛋白质样品转移到0.5毫升，10千道尔顿离心过滤器中，并用重悬缓冲液将样品体积增加到500微升。在室温下以14， 000g离心蛋白质缓冲混合物，直到离心过滤器中的体积小于100微升。通过在收集管中反转过滤器来收集样品。将样品以 1000 G 离心两分钟，然后加入缓冲液 C 以获得 500 微升的最终体积。为了减少蛋白质硫醇，向样品中加入20微升500毫摩尔二硫苏糖醇或DTT，以获得20毫摩尔的终浓度，并将样品在37摄氏度下孵育30分钟，并以850RPM振荡。还原后，将样品在室温下以14， 000 G离心至0.5毫升10千道尔顿离心过滤器中，直到离心过滤器中的体积小于100微升。加入缓冲液D以将体积补足至500微升并重复离心。第四次离心后，通过将过滤器倒置在收集管中以 1000 G 离心两分钟来收集样品。然后使用BCA测定法测量蛋白质浓度。接下来，将离心柱放在真空歧管上，并使用微量移液器将500微升新鲜制备的硫醇亲和树脂浆液转移到每根色谱柱上。应用真空去除水分。重复该过程一次，每根色谱柱获得30毫克树脂。用500微升超纯水洗涤树脂五次，通过施加真空除去水，然后用500微升缓冲液 E.In 新管中洗涤树脂五次，将缓冲液C添加到150微克还原的蛋白质样品中，直到最终体积为120微升。将蛋白质溶液转移到含有树脂的堵塞离心柱中。将盖子放在色谱柱上，在室温下以850rpm振荡孵育两小时。按照手稿中的说明清洗树脂。更换插头。为了进行树脂上的胰蛋白酶消化，向样品中加入120微升新鲜制备的胰蛋白酶溶液，并将色谱柱在37摄氏度下孵育过夜，并以850RPM振荡。第二天，按照手稿中的说明多次清洗树脂并更换塞子。使用微量移液器，向洗涤的树脂中加入40微升100毫摩尔三乙基碳酸氢铵缓冲液。然后加入70微升溶解的串联质量标签或TMT标记试剂，并在室温下以850RPM振荡孵育一小时。将任何剩余的TMT试剂储存在零下80摄氏度。清洗树脂并更换插头。通过向色谱柱中加入100 μL pH 8.0的100毫摩尔碳酸氢铵缓冲液（含有20毫摩尔DTT），并将色谱柱在室温下以850 RPM孵育30分钟，洗脱TMT标记的肽。孵育后，通过将色谱柱放在真空歧管上，施加真空并将样品洗脱到5毫升微量离心管中进行洗脱。重复该步骤一次，然后向色谱柱中加入100微升含有0.1%三氟乙酸的80%乙腈。在室温下孵育色谱柱10分钟后，将样品洗脱在相同的5毫升离心管中。将洗脱的样品放入真空浓缩器中直至干燥。然后将干肽储存在零下80摄氏度，直到进一步使用。使用SDS-PAGE对来自RAW 264.7细胞的肽样品进行定性分析，其中通过确定处理引起的不同氧化水平来比较样品。随后通过蛋白质印迹探测分离的蛋白质，以进一步研究单个蛋白质的氧化水平。报道的含胱氨酸肽的离子强度通过液相色谱串联质谱分析。对iTRAQ的硫醇氧化化学计量，在单个胱氨酸位点水平标记的富集和氧化肽进行定量。小心地去除丙酮，不要干扰蛋白质沉淀。确保蛋白质沉淀完全溶解和精确定量，并将树脂准确分配到离心柱。确保在洗涤步骤中重悬树脂。可通过SDS-PAGE和染色、蛋白质印迹和质谱法对富集蛋白质和肽进行进一步评估。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

科研

生物化学

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通过反相液相-质谱法对无细胞蛋白合成代谢的绝对定量

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

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Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...