Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Dele af arbejdet blev støttet af NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 og U24 DK112349

Alle procedurer, der er beskrevet i protokollen, vedrørende prøver fra dyr eller mennesker/væv blev godkendt af og fulgte de institutionelle retningslinjer fra den etiske komité for human- og dyreforsøg.
1. Prøvehomogenisering/lysis
<ol><li>Frosne vævsprøver<ol><li>Hakket frossent væv (~ 30 mg) på et glasmikroskopglas på tøris ved hjælp af et forkølet barberblad og tang. Hakket væv overføres til et forskjeldet 5 ml rundbundet polystyrenrør indeholdende 700 μL buffer A (se <...

Harpiksassisteret indfangning er blevet anvendt på tværs af en række prøvetyper og biologiske systemer til undersøgelse af oxidative modifikationer af cysteinrester25,29,30. Denne metode gør det muligt at evaluere prøver på flere niveauer og aflæsninger, herunder proteiner og peptider ved hjælp af SDS-PAGE og western blot-analyse samt individuelle cysteinsteder ved hjælp af massespektrometri. Uanset prøvetypen eller ...

Under homeostatiske forhold genererer celler reaktive ilt-, nitrogen- eller svovlarter, der hjælper med at lette processer, såsom metabolisme og signalering 1,2,3, der strækker sig til både prokaryoter og eukaryoter. Fysiologiske niveauer af disse reaktive arter er nødvendige for korrekt cellulær funktion, også kendt som 'eustress'1,4. I modsætning hertil kan en stigning i oxidanter, der fører til en ubalance mellem oxidanter og antioxidanter, forårsage oxidativ stress eller 'nød'1, hvilket fører til cellulær skade. Oxidanter transducerer signaler til biologiske veje ved at ændre forskellige biomolekyler, herunder protein, DNA, RNA og lipider. Især er cysteinrester af proteiner stærkt reaktive steder, der er tilbøjelige til oxidation på grund af thiolgruppen på cystein, som er reaktiv over for forskellige typer oxidanter5. Dette giver anledning til en bred vifte af reversible redoxbaserede posttranslationelle modifikationer (PTM'er) for cystein, herunder nitrosylering (SNO), glutathionylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidering (SSH), polysulfidering (SSnH), acylation og disulfider. Irreversible former for cysteinoxidation omfatter sulfinylering (SO2H) og sulfonylering (SO3H).
Reversible oxidative modifikationer af cysteinrester kan tjene beskyttende roller, der forhindrer yderligere irreversibel oxidation eller tjener som signalmolekyler til nedstrøms cellulære veje 6,7. Reversibiliteten af nogle thiol redox PTM'er gør det muligt for cysteinsteder at fungere som "redox-switche"8,9, hvor ændringer i redoxtilstanden på disse steder ændrer proteinfunktionen for at regulere deres rolle i forbigående processer. De modulerende virkninger af redox PTM'er10 er blevet observeret i mange aspekter af proteinfunktion11, herunder katalyse 12, protein-proteininteraktioner 13, konformationsændring14, metalionkoordinering15 eller farmakologisk hæmmerbinding16. Derudover er redox-PTM'er involveret i cysteinsteder af proteiner, der regulerer veje såsom transkription17, oversættelse18 eller metabolisme19. I betragtning af den indvirkning, som redox-PTM'er har på proteinfunktion og biologiske processer, er det vigtigt at kvantificere omfanget af oxidation, som et cysteinsted gennemgår som reaktion på en forstyrrelse af redoxtilstanden.
Identifikationen af cysteinsteder med ændrede redoxtilstande er fokuseret på sammenligningen af oxidationstilstanden på det stedspecifikke niveau mellem normale og forstyrrede forhold. Foldændringsmålinger bruges ofte til at bestemme, hvilke steder der ændres væsentligt, da dette hjælper brugerne med at fortolke, hvilke cysteinsteder der kan være fysiologisk signifikante for undersøgelsen. Alternativt giver støkiometriske målinger af reversibel thioloxidation på tværs af en bestemt prøvetype et generelt billede af den fysiologiske tilstand med hensyn til cellulær oxidation, en vigtig måling, der ofte overses og underudnyttes. Modifikationsstøkiometri er baseret på kvantificering af procentdelen af modificeret thiol som et forhold til total proteinthiol (modificeret og umodificeret)20,21. Som et resultat tilbyder støkiometriske målinger en mere præcis måling end foldændring, især når der anvendes massespektrometri. Betydningen af stigningen i oxidation kan lettere fastslås ved hjælp af støkiometri til at bestemme PTM-belægningen af et bestemt cysteinsted. For eksempel kan en 3 gange stigning i thioloxidation skyldes en overgang på så lidt som 1% til 3% eller så stor som 30% til 90%. En 3 gange stigning i oxidation for et sted, der kun er ved 1% belægning, kan have ringe indflydelse på et proteins funktion; En 3-dobling for et sted med 30% belægning i hviletilstand kan dog blive mere væsentligt påvirket. Støkiometriske målinger, når de udføres mellem totale oxiderede thioler og specifikke oxidative modifikationer, herunder protein glutathionylation (SSG) og nitrosylering (SNO), kan afsløre forhold og kvantitativ information med hensyn til specifikke modifikationstyper.
Fordi reversibel thioloxidation typisk er en posttranslationel modifikation med lav forekomst, er der udviklet flere tilgange til berigelse af proteiner, der indeholder disse modifikationer ud af biologiske prøver. En tidlig tilgang udtænkt af Jaffrey og andre, kaldet biotinkontaktteknikken (BST)22, involverer flere trin, hvor umodificerede thioler blokeres gennem alkylering, reversibelt modificerede thioler reduceres til spirende frie thioler, spirende frie thioler mærkes med biotin, og de mærkede proteiner beriges med streptavidin-affinitetspulldown. Denne teknik er blevet brugt til at profilere SNO og SSG i mange undersøgelser og kan tilpasses til sonde for andre former for reversibel thioloxidation23,24. Mens BST er blevet brugt til at sondere for forskellige former for reversibel thioloxidation, er en bekymring med denne tilgang, at berigelse påvirkes af den ikke-specifikke binding af ubiotinylerede proteiner til streptavidin. En alternativ tilgang udviklet i vores laboratorium, kaldet harpiksassisteret indfangning (RAC)25,26 (figur 1), omgår spørgsmålet om berigelse af thiolgrupper via biotin-streptavidin-systemet.
Efter reduktionen af reversibelt oxiderede thioler beriges proteiner med spirende frie thioler af thiol-affinitetsharpiksen, som kovalent fanger frie thiolgrupper, hvilket muliggør mere specifik berigelse af cysteinholdige proteiner end BST. Kobling af RAC med multiplexingkraften i de seneste fremskridt inden for isobarisk mærkning og massespektrometri skaber en robust og følsom arbejdsgang til berigelse, identifikation og kvantificering af reversibelt oxiderede cysteinrester på proteom-dækkende niveau. Nylige fremskridt inden for massespektrometri har muliggjort meget dybere profilering af thiolredoxproteomet, hvilket øger forståelsen af både årsagen og virkningen af proteinthioloxidation27. Oplysningerne fra stedsspecifikke kvantitative data giver mulighed for yderligere undersøgelser af de mekanistiske virkninger og nedstrømseffekter af reversible oxidative modifikationer28. Brug af denne arbejdsgang har givet indsigt i de fysiologiske virkninger af reversibel cysteinoxidation med hensyn til normale fysiologiske hændelser såsom aldring, hvor niveauet af SSG varierede med hensyn til alder. De aldrende virkninger på SSG blev delvist vendt ved hjælp af SS-31 (elamipretid), et nyt peptid, der forbedrer mitokondriefunktionen og reducerer SSG-niveauer hos ældre mus, hvilket får dem til at have en SSG-profil, der ligner unge musmere 29.
Patofysiologiske tilstande, der tilskrives nanopartikeleksponering, har vist sig at involvere SSG i en musemakrofagmodel. Ved hjælp af RAC kombineret med massespektrometri viste forfatterne, at SSG-niveauer var direkte korreleret med graden af oxidativ stress og svækkelse af makrofagfagocytisk funktion. Dataene afslørede også vejspecifikke forskelle i respons på forskellige konstruerede nanomaterialer, der inducerer forskellige grader af oxidativ stress30. Metoden har også vist sin anvendelighed i prokaryote arter, hvor den blev anvendt til at studere virkningerne af daglige cyklusser i fotosyntetiske cyanobakterier med hensyn til thioloxidation. Brede ændringer i thioloxidation på tværs af flere vigtige biologiske processer blev observeret, herunder elektrontransport, kulstoffiksering og glykolyse. Desuden blev det gennem ortogonal validering bekræftet, at flere vigtige funktionelle steder blev ændret, hvilket tyder på regulatoriske roller for disse oxidative ændringer6.
Heri beskriver vi detaljerne i en standardiseret arbejdsgang (figur 1), der demonstrerer nytten af RAC-tilgangen til berigelse af total oxideret cysteinthioler af proteiner og deres efterfølgende mærkning og støkiometriske kvantificering. Denne arbejdsgang er blevet implementeret i undersøgelser af redoxtilstanden i forskellige prøvetyper, herunder cellekulturer27,30 og hele væv (f.eks. Skeletmuskulatur, hjerte, lunge)29,31,32,33. Selvom RAC ikke er inkluderet her, er RAC-protokollen også let tilpasset til undersøgelse af specifikke former for reversible redoxmodifikationer, herunder SSG, SNO og S-acylation, som tidligere nævnt25,29,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

Reversible oxidative modifikationer på proteinthioler har for nylig vist sig som vigtige mediatorer for cellulær funktion. Heri beskriver vi den detaljerede procedure for en kvantitativ redoxproteomics-metode, der anvender harpiksassisteret indfangning (RAC) i kombination med tandem mass tag (TMT) isobarisk mærkning og væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) for at muliggøre multiplekset støkmetrisk kvantificering af oxiderede proteinthioler på proteomniveau. De stedsspecifikke kvantitative oplysninger om oxiderede cysteinrester giver yderligere indsigt i de funktionelle virkninger af sådanne ændringer. 
Arbejdsgangen kan tilpasses på tværs af mange prøvetyper, herunder dyrkede celler (f.eks. pattedyr, prokaryote) og hele væv (f.eks. hjerte, lunge, muskel), som oprindeligt lyseres / homogeniseres og med frie thioler, der alkyleres for at forhindre kunstig oxidation. De oxiderede proteinthioler reduceres derefter og fanges af en thiol-affinitetsharpiks, som strømliner og forenkler arbejdsgangstrinnene ved at tillade, at de fortsatte fordøjelses-, mærknings- og vaskeprocedurer udføres uden yderligere overførsel af proteiner / peptider. Endelig eluteres og analyseres de mærkede peptider af LC-MS / MS for at afsløre omfattende støkiometriske ændringer relateret til thioloxidation over hele proteomet. Denne metode forbedrer i høj grad forståelsen af rollen som redoxafhængig regulering under fysiologiske og patofysiologiske tilstande relateret til protein thioloxidation.

Afslutning af protokollen vil resultere i meget specifik berigelse af tidligere oxiderede cysteinholdige peptider, ofte med >95% specificitet 27,35,36. Imidlertid kræver flere vigtige trin i protokollen særlig opmærksomhed, f.eks. den indledende blokering af frie thioler før prøvelysis / homogenisering, hvilket forbyder kunstig oxidation og ikke-specifik berigelse af kunstigt oxiderede thioler25. Pr?...

Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Protein thiol oxidation har betydelige konsekvenser under normale fysiologiske og patofysiologiske forhold. Vi beskriver detaljerne i en kvantitativ redoxproteomics-metode, der anvender harpiksassisteret indfangning, isobarisk mærkning og massespektrometri, hvilket muliggør stedsspecifik identifikation og kvantificering af reversibelt oxiderede cysteinrester af proteiner.

Harpiksassisteret indfangning kombineret med isobarisk tandemmassemærkemærkning til multiplekset kvantificering af protein thioloxidation

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Denne protokol beskriver en metode, der muliggør stedsspecifik identifikation af oxiderede cystinrester af proteiner. Metoden gør det muligt at generere kvantitative og stedsspecifikke data om oxiderede cystinrester fra forskellige prøvetyper. For at starte den assisterede indfangningsprocedure skal du vaske de udfældede proteinpiller to gange med acetone ved centrifugering ved 20.500 G i fire grader Celsius i 10 minutter.Dekanter derefter acetonen og fjern den resterende acetone med en mikropipette. Ved hjælp af en glas serologisk pipette tilsættes tre milliliter frisk iskold acetone til røret og blandes godt ved at vende røret flere gange. Efter den anden vask skal pellets lufttørre i et til to minutter uden at lade dem tørre.Tilsæt en milliliter buffer B til den tørrede proteinpille. For at opløse proteinet sonikeres pelleten gentagne gange i en badesonikator med en effekt på 250 watt i 15 til 30 sekunder ad gangen sammen med kort hvirvel. Udfør Bicinchonininsyre- eller BCA-analysen for at måle proteinkoncentrationen.For at standardisere proteinkoncentrationerne overføres 500 mikrogram proteinprøve til et 0,5 milliliter, 10 kilodalton centrifugalfilter, og prøven forbindes til 500 mikroliter med resuspensionbuffer. Centrifuger proteinbufferblandingen ved 14.000 G ved stuetemperatur, indtil volumenet i centrifugalfilteret er mindre end 100 mikroliter. Prøven indsamles ved at invertere filteret i et opsamlingsrør.Prøven centrifugeres ved 1000 G i to minutter, og buffer C tilsættes for at få et endeligt volumen på 500 mikroliter. For at reducere proteinthiolerne tilsættes 20 mikroliter 500 millimolar dithiothreitol eller DTT til prøven for at få en endelig koncentration på 20 millimolar og inkuberer prøverne i 30 minutter ved 37 grader Celsius med omrystning ved 850 o / min. Efter reduktion centrifugeres til prøverne i 0, 5 milliliter 10 kilodalton centrifugalfiltre ved 14.000 G ved stuetemperatur, indtil volumenet i centrifugalfilteret er mindre end 100 mikroliter.Tilsæt buffer D for at gøre volumenet op til 500 mikroliter og gentag centrifugering. Efter den fjerde centrifugering indsamles prøverne ved at invertere filteret i et opsamlingsrør til centrifuge ved 1000 G i to minutter. Mål derefter proteinkoncentrationen ved hjælp af BCA-analysen.Placer derefter spinkolonnerne på en vakuummanifold, og ved hjælp af en mikropipette overføres 500 mikroliter af den frisklavede thiolaffinitetsharpiksopslæmning til hver søjle. Påfør vakuum til fjernelse af vand. Gentag proceduren en gang for at opnå 30 milligram harpiks pr. Kolonne.Vask harpiksen fem gange med 500 mikroliter ultrarent vand ved at anvende et vakuum for at fjerne vandet og derefter fem gange med 500 mikroliter buffer E.In et nyt rør, tilsæt buffer C til 150 mikrogram af den reducerede proteinprøve, indtil det endelige volumen er 120 mikroliter. Overfør proteinopløsningen til en tilsluttet spinkolonne indeholdende harpiksen. Placer hætten på søjlen og inkuber i to timer ved stuetemperatur med omrystning ved 850 o / min.Vask harpiksen som beskrevet i manuskriptet. Udskift stikket. For at udføre tryptisk fordøjelse på harpiks tilsættes 120 mikroliter frisklavet trypsinopløsning til prøverne og inkuberes søjlen natten over ved 37 grader Celsius med omrystning ved 850 o / min.Den næste dag vaskes harpiksen flere gange som beskrevet i manuskriptet, og stikket udskiftes. Ved hjælp af en mikropipette tilsættes 40 mikroliter 100 millimolar Triethylammoniumbicarbonatbuffer til den vaskede harpiks. Tilsæt derefter 70 mikroliter af det opløste tandemmassemærke eller TMT-mærkningsreagens, og inkuber i en time ved stuetemperatur med omrystning ved 850 o / min.Opbevares eventuelt resterende TMT-reagens ved minus 80 grader Celsius. Vask harpiksen og udskift stikket. Elute de TMT-mærkede peptider ved at tilsætte 100 mikroliter 100 millimolar ammoniumbicarbonatbuffer ved pH 8,0, indeholdende 20 millimolar DTT, til søjlen og inkubere søjlen på en termisk mixer ved stuetemperatur i 30 minutter ved 850 o / min.Efter inkubation udføres elution ved at placere søjlen på en vakuummanifold, påføre vakuumet og eluere prøverne i et fem milliliter mikrocentrifugerør. Gentag trinnet en gang, og tilsæt derefter 100 mikroliter 80% acetonitril med 0,1% trifluoreddikesyre til søjlen. Efter inkubation af søjlen i 10 minutter ved stuetemperatur fortyndes prøven i det samme fem milliliter centrifugerør.De eluerede prøver anbringes i en vakuumkoncentrator, indtil de er tørre. Opbevar derefter de tørre peptider ved minus 80 grader Celsius indtil yderligere brug. Den kvalitative analyse af peptidprøver fra RAW 264.7-celler blev udført med SDS-PAGE, hvor prøver blev sammenlignet ved at bestemme forskellige oxidationsniveauer på grund af behandlinger.De adskilte proteiner blev efterfølgende undersøgt af western blot for yderligere at undersøge oxidationsniveauerne af individuelle proteiner. Rapporterede ionintensiteter af cystin indeholdende peptider blev analyseret ved væskekromatografi tandem massespektrometri. Thioloxidationsstøkiometrien af iTRAQ, mærket beriget og oxiderede peptider på individuelle cystinniveauniveauer blev kvantificeret.Fjern forsigtigt acetone uden at forstyrre proteinpellet. Sørg for, at proteinpelleten er fuldstændigt opløseligt og kvantificeret præcist, og at harpiks er nøjagtigt allokeret til spinkolonner. Sørg for at resuspendere harpiks under vasketrinnene.Yderligere evaluering af berigede proteiner og peptider kan udføres ved SDS-PAGE og farvning, western blotting og massespektrometri.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Prøve Multiplexing af væv under anvendelse kombinerede Precursor isotopmærkning og isobar Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskellige dimensioner ved hjælp af automatiseret krystallisering kombineret med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...