Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Delen van het werk werden ondersteund door NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 en U24 DK112349

Alle in het protocol beschreven procedures met betrekking tot dierlijke of menselijke monsters/weefsels werden goedgekeurd door en volgden de institutionele richtlijnen van de ethische commissie voor onderzoek bij mens en dier.
1. Homogenisatie/lysis van het monster
<ol><li>Ingevroren weefselmonsters<ol><li>Gehakt bevroren weefsel (~ 30 mg) op een glazen microscoop glaasje op droogijs met behulp van een vooraf gechilleerd scheermesje en een tang. Breng het gehakte weefsel over in een vooraf ...

Harsondersteunde afvang is gebruikt in een verscheidenheid aan monstertypen en biologische systemen voor het onderzoek naar oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen 25,29,30. Deze methode maakt de evaluatie van monsters op meerdere niveaus en uitlezingen mogelijk, waaronder eiwitten en peptiden met behulp van SDS-PAGE en western blot-analyse, evenals individuele cysteïnesites met behulp van massaspectrometrie. Ongeacht het...

Onder homeostatische omstandigheden genereren cellen reactieve zuurstof-, stikstof- of zwavelsoorten die helpen om processen te vergemakkelijken, zoals metabolisme en signalering 1,2,3, die zich uitstrekken tot zowel prokaryoten als eukaryoten. Fysiologische niveaus van deze reactieve soorten zijn noodzakelijk voor een goede cellulaire functie, ook bekend als 'eustress'1,4. Daarentegen kan een toename van oxidanten die leidt tot een onbalans tussen oxidanten en antioxidanten oxidatieve stress of 'distress'1 veroorzaken, wat leidt tot cellulaire schade. Oxidanten transduceren signalen naar biologische routes door verschillende biomoleculen te modificeren, waaronder eiwitten, DNA, RNA en lipiden. In het bijzonder zijn cysteïneresiduen van eiwitten zeer reactieve plaatsen die vatbaar zijn voor oxidatie als gevolg van de thiolgroep op cysteïne, die reactief is op verschillende soorten oxidanten5. Dit geeft aanleiding tot een breed scala aan reversibele redox-gebaseerde posttranslationele modificaties (PTM's) voor cysteïne, waaronder nitrosylatie (SNO), glutathionylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidatie (SSH), polysulfidatie (SSnH), acylering en disulfiden. Onomkeerbare vormen van cysteïne-oxidatie omvatten sulfinylering (SO2H) en sulfonylering (SO3H).
Omkeerbare oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen kunnen beschermende rollen vervullen om verdere onomkeerbare oxidatie te voorkomen of dienen als signaalmoleculen voor stroomafwaartse cellulaire routes 6,7. De omkeerbaarheid van sommige thiol redox PTM's zorgt ervoor dat cysteïneplaatsen kunnen functioneren als "redoxschakelaars"8,9, waarbij veranderingen in de redoxtoestand van deze sites de eiwitfunctie veranderen om hun rol in voorbijgaande processen te reguleren. De modulerende effecten van redox PTM's10 zijn waargenomen in vele aspecten van eiwitfunctie11, waaronder katalyse12, eiwit-eiwitinteracties13, conformatieverandering14, metaalionencoördinatie15 of farmacologische inhibitorbinding16. Bovendien zijn redox PTM's betrokken bij cysteïneplaatsen van eiwitten die routes reguleren zoals transcriptie17, translatie18 of metabolisme19. Gezien de impact die redox PTM's hebben op de eiwitfunctie en biologische processen, is het belangrijk om de mate van oxidatie te kwantificeren die een cysteïneplaats ondergaat als reactie op een verstoring van de redoxtoestand.
De identificatie van cysteïneplaatsen met veranderde redoxtoestanden is gericht op de vergelijking van de oxidatietoestand op het locatiespecifieke niveau tussen normale en verstoorde omstandigheden. Vouwveranderingsmetingen worden vaak gebruikt om te bepalen welke sites aanzienlijk zijn gewijzigd, omdat dit gebruikers helpt te interpreteren welke cysteïnesites fysiologisch significant kunnen zijn voor het onderzoek. Als alternatief geven stoichiometrische metingen van omkeerbare thioloxidatie over een specifiek monstertype een algemeen beeld van de fysiologische toestand met betrekking tot cellulaire oxidatie, een belangrijke meting die vaak over het hoofd wordt gezien en onderbenut. Modificatie stoichiometrie is gebaseerd op het kwantificeren van het percentage gemodificeerde thiol als verhouding tot totaal eiwit thiol (gemodificeerd en ongewijzigd)20,21. Als gevolg hiervan bieden stoichiometrische metingen een nauwkeurigere meting dan vouwverandering, vooral bij gebruik van massaspectrometrie. De betekenis van de toename van oxidatie kan gemakkelijker worden vastgesteld door stoichiometrie te gebruiken om de PTM-bezetting van een bepaalde cysteïneplaats te bepalen. Een 3-voudige toename van thioloxidatie kan bijvoorbeeld het gevolg zijn van een overgang van slechts 1% naar 3% of zo groot als 30% tot 90%. Een 3-voudige toename van oxidatie voor een site die slechts 1% bezetting heeft, kan weinig invloed hebben op de functie van een eiwit; een 3-voudige toename voor een site met 30% bezetting in rusttoestand kan echter meer substantieel worden beïnvloed. Stoichiometrische metingen, wanneer uitgevoerd tussen totaal geoxideerde thiolen en specifieke oxidatieve modificaties, waaronder eiwitgluutathionylering (SSG) en nitrosylering (SNO), kunnen verhoudingen en kwantitatieve informatie onthullen met betrekking tot specifieke modificatietypen.
Omdat reversibele thioloxidatie typisch een posttranslationele modificatie met een lage abundantie is, zijn er meerdere benaderingen ontwikkeld voor de verrijking van eiwitten die deze modificaties bevatten uit biologische monsters. Een vroege aanpak bedacht door Jaffrey en anderen, genaamd de biotine switch techniek (BST)22, omvat meerdere stappen waarbij ongewijzigde thiolen worden geblokkeerd door alkylering, reversibel gemodificeerde thiolen worden gereduceerd tot ontluikende vrije thiolen, ontluikende vrije thiolen worden gelabeld met biotine en de gelabelde eiwitten worden verrijkt door streptavidin affiniteit pulldown. Deze techniek is in veel studies gebruikt om SNO en SSG te profileren en kan worden aangepast om te onderzoeken op andere vormen van reversibele thioloxidatie23,24. Hoewel BST is gebruikt om te onderzoeken op verschillende vormen van omkeerbare thioloxidatie, is een zorg bij deze aanpak dat verrijking wordt beïnvloed door de niet-specifieke binding van niet-geïnbiotinyleerde eiwitten aan streptavidin. Een alternatieve aanpak die in ons laboratorium is ontwikkeld, genaamd resin-assisted capture (RAC)25,26 (figuur 1), omzeilt de kwestie van verrijking van thiolgroepen via het biotine-streptavidin-systeem.
Na de reductie van reversibel geoxideerde thiolen, worden eiwitten met ontluikende vrije thiolen verrijkt met de thiolaffiniteitshars, die covalent vrije thiolgroepen vangt, waardoor meer specifieke verrijking van cysteïnebevattende eiwitten mogelijk is dan BST. Het koppelen van RAC aan de multiplexingkracht van de recente vooruitgang in isobare etikettering en massaspectrometrie creëert een robuuste en gevoelige workflow voor de verrijking, identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen op proteoombreed niveau. Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie hebben een veel diepere profilering van het thiol redoxproteoom mogelijk gemaakt, waardoor het begrip van zowel de oorzaak als het gevolg van eiwitthioloxidatieis toegenomen 27. De informatie die wordt verkregen uit locatiespecifieke kwantitatieve gegevens maakt verdere studies mogelijk van de mechanistische effecten en downstream-effecten van omkeerbare oxidatieve modificaties28. Het gebruik van deze workflow heeft inzicht gegeven in de fysiologische effecten van omkeerbare cysteïne-oxidatie met betrekking tot normale fysiologische gebeurtenissen zoals veroudering, waarbij de niveaus van SSG verschilden met betrekking tot leeftijd. De verouderingseffecten op SSG werden gedeeltelijk omgekeerd met behulp van SS-31 (elamipretide), een nieuw peptide dat de mitochondriale functie verbetert en de SSG-niveaus bij oudere muizen verlaagt, waardoor ze een SSG-profiel hebben dat meer lijkt op jonge muizen29.
Van pathofysiologische aandoeningen die worden toegeschreven aan blootstelling aan nanodeeltjes is aangetoond dat SSG betrokken is bij een macrofaagmodel van muizen. Met behulp van RAC in combinatie met massaspectrometrie toonden de auteurs aan dat SSG-niveaus direct gecorreleerd waren met de mate van oxidatieve stress en aantasting van de macrofaagfagocytische functie. De gegevens onthulden ook pathway-specifieke verschillen in reactie op verschillende gemanipuleerde nanomaterialen die verschillende graden van oxidatieve stress induceren30. De methode heeft ook zijn nut bewezen bij prokaryote soorten, waar het werd toegepast om de effecten van dagcyclussen in fotosynthetische cyanobacteriën met betrekking tot thioloxidatie te bestuderen. Brede veranderingen in thioloxidatie in verschillende belangrijke biologische processen werden waargenomen, waaronder elektronentransport, koolstoffixatie en glycolyse. Bovendien werd door orthogonale validatie bevestigd dat verschillende belangrijke functionele locaties werden gewijzigd, wat suggereert dat deze regulerende rollen van deze oxidatieve modificaties6.
Hierin beschrijven we de details van een gestandaardiseerde workflow (figuur 1), die het nut van de RAC-benadering aantoont voor de verrijking van totale geoxideerde cysteïnethiolen van eiwitten en hun daaropvolgende etikettering en stoichiometrische kwantificering. Deze workflow is geïmplementeerd in studies naar de redoxtoestand in verschillende monstertypen, waaronder celculturen 27,30 en hele weefsels (bijv. skeletspieren, hart, longen)29,31,32,33. Hoewel het hier niet is opgenomen, is het RAC-protocol ook gemakkelijk aan te passen voor het onderzoek naar specifieke vormen van omkeerbare redoxmodificaties, waaronder SSG, SNO en S-acylering, zoals eerder vermeld 25,29,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

Reversibele oxidatieve modificaties op eiwitthiolen zijn onlangs naar voren gekomen als belangrijke mediatoren van cellulaire functie. Hierin beschrijven we de gedetailleerde procedure van een kwantitatieve redox proteomics-methode die gebruik maakt van resin-assisted capture (RAC) in combinatie met tandem mass tag (TMT) isobare etikettering en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) om multiplexed stochiometrische kwantificering van geoxideerde eiwitthiolen op proteoomniveau mogelijk te maken. De site-specifieke kwantitatieve informatie over geoxideerde cysteïneresiduen biedt extra inzicht in de functionele effecten van dergelijke modificaties. 
De workflow is aanpasbaar voor vele soorten monsters, waaronder gekweekte cellen (bijv. Zoogdier, prokaryote) en hele weefsels (bijv. Hart, long, spier), die aanvankelijk worden gelyseerd / gehomogeniseerd en waarbij vrije thiolen worden gealkyleerd om kunstmatige oxidatie te voorkomen. De geoxideerde eiwitthiolen worden vervolgens gereduceerd en gevangen door een thiolaffiniteitshars, die de workflowstappen stroomlijnt en vereenvoudigt door de lopende verterings-, etiketterings- en wasprocedures uit te voeren zonder extra overdracht van eiwitten / peptiden. Ten slotte worden de gelabelde peptiden geëlueerd en geanalyseerd door LC-MS / MS om uitgebreide stoichiometrische veranderingen te onthullen die verband houden met thioloxidatie in het hele proteoom. Deze methode verbetert het begrip van de rol van redox-afhankelijke regulatie onder fysiologische en pathofysiologische toestanden gerelateerd aan eiwitthioloxidatie aanzienlijk.

Voltooiing van het protocol zal resulteren in zeer specifieke verrijking van voorheen geoxideerde cysteïnebevattende peptiden, vaak met >95% specificiteit 27,35,36. Verschillende belangrijke stappen van het protocol vereisen echter speciale aandacht, bijvoorbeeld de initiële blokkering van vrije thiolen voorafgaand aan monsterlysis / homogenisatie, die kunstmatige oxidatie en niet-specifieke verrijking van kunstmatig geoxideer...

Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Dit protocol beschrijft een methode die locatiespecifieke identificatie van geoxideerde cystineresiduen van eiwitten mogelijk maakt. De methode maakt het mogelijk kwantitatieve en locatiespecifieke gegevens van geoxideerde cystineresiduen te genereren uit verschillende monstertypen. Om de geassisteerde vangstprocedure te starten, wast u de neergeslagen eiwitkorrels tweemaal met aceton door centrifugeren op 20.500 G, in vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Decanteer vervolgens de aceton en verwijder de resterende aceton met een micropipet. Voeg met behulp van een glazen serologische pipet drie milliliter verse ijskoude aceton toe aan de buis en meng goed door de buis meerdere keren om te keren. Laat de pellets na de tweede wasbeurt één tot twee minuten aan de lucht drogen zonder ze te laten drogen.Voeg een milliliter buffer B toe aan de gedroogde eiwitkorrel. Om het eiwit op te lossen, soniceert u de pellet herhaaldelijk in een badsonicator met een vermogen van 250 watt gedurende 15 tot 30 seconden per keer, samen met korte vortexing. Voer de Bicinchoninic acid of BCA assay uit om de eiwitconcentratie te meten.Om de eiwitconcentraties te standaardiseren, brengt u 500 microgram eiwitmonster over naar een centrifugaalfilter van 0,5 milliliter, 10 kilodalton en volume verhoogt u het monster tot 500 microliter met resuspensiebuffer. Centrifugeer het eiwitbuffermengsel bij 14.000 g bij kamertemperatuur, totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 microliter is. Verzamel het monster door het filter in een opvangbuis om te keren.Centrifugeer het monster gedurende twee minuten bij 1000 G en voeg buffer C toe om een eindvolume van 500 microliter te krijgen. Om de eiwitthiolen te verminderen, voegt u 20 microliter 500 millimol dithiothreitol of DTT toe aan het monster om een uiteindelijke concentratie van 20 millimol te krijgen en incubeert u de monsters gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met schudden bij 850 RPM. Na reductie centrifugeert u de monsters tot 0,5 milliliter centrifugaalfilters van 10 kilodalton bij 14.000 G bij kamertemperatuur, totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 microliter bedraagt.Voeg buffer D toe om het volume op te voeren tot 500 microliter en herhaal centrifugatie. Na de vierde centrifugatie verzamelt u de monsters door het filter in een verzamelbuis om te keren om gedurende twee minuten bij 1000 G te centrifugeren. Meet vervolgens de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-test.Plaats vervolgens de spinkolommen op een vacuümspruitstuk en breng met behulp van een micropipet 500 microliter van de vers bereide thiolaffiniteitshars slurry over naar elke kolom. Breng vacuüm aan voor het verwijderen van water. Herhaal de procedure eenmaal om 30 milligram hars per kolom te verkrijgen.Was de hars vijf keer met 500 microliter ultrapuur water, door een vacuüm toe te passen om het water te verwijderen en vervolgens vijf keer met 500 microliter buffer E.In een nieuwe buis, voeg buffer C toe aan 150 microgram van het gereduceerde eiwitmonster totdat het uiteindelijke volume 120 microliter is. Breng de eiwitoplossing over in een verstopte spinkolom met de hars. Plaats de dop op de kolom en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 tpm.Was de hars zoals beschreven in het manuscript. Vervang de stekker. Om tryptische vertering op hars uit te voeren, voegt u 120 microliter vers bereide trypsine-oplossing toe aan de monsters en incubeert u de kolom 's nachts bij 37 graden Celsius, met schudden bij 850 RPM.Was de hars de volgende dag meerdere keren zoals beschreven in het manuscript en vervang de plug. Voeg met behulp van een micropipet 40 microliter 100 millimol Triethylammonium bicarbonaatbuffer toe aan de gewassen hars. Voeg vervolgens 70 microliter van de opgeloste tandemmassatag of TMT-etiketteringsreagens toe en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 RPM.Bewaar alle resterende TMT-reagens bij min 80 graden Celsius. Was de hars en vervang de plug. Eluteer de TMT-gelabelde peptiden door 100 microliter 100 millimolar ammoniumbicarbonaatbuffer bij pH 8,0, met 20 millimolar DTT, aan de kolom toe te voegen en de kolom op een thermische mixer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij 850 RPM te incuberen.Voer na incubatie elutie uit door de kolom op een vacuümspruitstuk te plaatsen, het vacuüm toe te passen en de monsters in een microcentrifugebuis van vijf milliliter te elueren. Herhaal de stap eenmaal en voeg vervolgens 100 microliter 80% acetonitril met 0,1% trifluorazijnzuur toe aan de kolom. Nadat u de kolom gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur hebt ingecubeerd, elueert u het monster in dezelfde centrifugebuis van vijf milliliter.Plaats de geëlueerde monsters in een vacuümconcentrator tot ze droog zijn. Bewaar vervolgens de droge peptiden bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. De kwalitatieve analyse van peptidemonsters uit RAW 264,7-cellen werd uitgevoerd met SDS-PAGE, waarbij monsters werden vergeleken door verschillende niveaus van oxidatie als gevolg van behandelingen te bepalen.De gescheiden eiwitten werden vervolgens onderzocht door western blot om de oxidatieniveaus van individuele eiwitten verder te onderzoeken. Gerapporteerde ionenintensiteiten van cystine bevattende peptiden werden geanalyseerd door vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie. De thioloxidatie stoichiometrie van iTRAQ, gelabeld verrijkte en geoxideerde peptiden op individuele cystine site niveaus werden gekwantificeerd.Verwijder aceton voorzichtig zonder de eiwitkorrel te verstoren. Zorg ervoor dat de eiwitpellet volledig nauwkeurig is opgelost en gekwantificeerd en dat hars nauwkeurig wordt toegewezen aan spinkolommen. Zorg ervoor dat u hars resuspendeert tijdens de wasstappen.Verdere evaluatie van verrijkte eiwitten en peptiden kan worden uitgevoerd door SDS-PAGE en kleuring, western blotting en massaspectrometrie.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...