Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Certaines parties du travail ont été soutenues par les subventions NIH R01 DK122160, R01 HL139335 et U24 DK112349

Toutes les procédures décrites dans le protocole concernant les échantillons/tissus animaux ou humains ont été approuvées et suivies par les lignes directrices institutionnelles du comité d’éthique de la recherche sur les humains et les animaux.
1. Homogénéisation/lyse des échantillons
<ol><li>Échantillons de tissus congelés<ol><li>Hacher du tissu congelé (~30 mg) sur une lame de microscope en verre sur de la glace sèche à l’aide d’une lame de rasoir prérefroidie et d?...

La capture assistée par résine a été utilisée dans divers types d’échantillons et systèmes biologiques pour étudier les modifications oxydatives des résidus de cystéine25,29,30. Cette méthode permet d’évaluer des échantillons à plusieurs niveaux et lectures, y compris des protéines et des peptides à l’aide de SDS-PAGE et de Western blot, ainsi que des sites individuels de cystéine à l’aide de la spectro...

Dans des conditions homéostatiques, les cellules génèrent des espèces réactives d’oxygène, d’azote ou de soufre qui aident à faciliter les processus, tels que le métabolisme et la signalisation 1,2,3, s’étendant à la fois aux procaryotes et aux eucaryotes. Les niveaux physiologiques de ces espèces réactives sont nécessaires au bon fonctionnement cellulaire, également connu sous le nom d'«eustress»1,4. En revanche, une augmentation des oxydants qui entraîne un déséquilibre entre les oxydants et les antioxydants peut provoquer un stress oxydatif, ou « détresse »1, qui entraîne des dommages cellulaires. Les oxydants transduisent les signaux aux voies biologiques en modifiant différentes biomolécules, y compris les protéines, l’ADN, l’ARN et les lipides. En particulier, les résidus de cystéine des protéines sont des sites très réactifs sujets à l’oxydation en raison du groupe thiol sur la cystéine, qui est réactif envers différents types d’oxydants5. Cela donne lieu à une gamme variée de modifications post-traductionnelles réversibles à base de redox (PTM) pour la cystéine, y compris la nitrosylation (SNO), la glutathionylation (SSG), la sulfénylation (SOH), la persulfidation (SSH), la polysulfuration (SSnH), l’acylation et les disulfures. Les formes irréversibles d’oxydation de la cystéine comprennent la sulfinylation (SO2H) et la sulfonylation (SO3H).
Les modifications oxydatives réversibles des résidus de cystéine peuvent jouer un rôle protecteur empêchant une oxydation irréversible ultérieure ou servir de molécules de signalisation pour les voies cellulaires en aval 6,7. La réversibilité de certains PTM redox thiol permet aux sites cystéine de fonctionner comme des « commutateurs redox»8,9, dans lesquels les changements dans l’état redox de ces sites modifient la fonction protéique pour réguler leur rôle dans les processus transitoires. Les effets modulateurs des PTM redox 10 ont été observés dans de nombreux aspects de la fonction protéique11, notamment la catalyse 12, les interactions protéine-protéine 13, le changement de conformation 14, la coordination des ions métalliques 15 ou la liaison inhibitrice pharmacologique 16. De plus, les PTM redox sont impliqués dans les sites cystéine des protéines qui régulent des voies telles que la transcription17, la traduction 18 ou le métabolisme19. Compte tenu de l’impact que les PTM redox ont sur la fonction protéique et les processus biologiques, il est important de quantifier l’étendue de l’oxydation qu’un site cystéine subit en réponse à une perturbation de l’état redox.
L’identification des sites de cystéine avec des états redox altérés est axée sur la comparaison de l’état d’oxydation au niveau spécifique du site entre les conditions normales et perturbées. Les mesures de changement de pli sont souvent utilisées pour déterminer quels sites sont significativement modifiés, car cela aide les utilisateurs à interpréter quels sites de cystéine peuvent être physiologiquement significatifs pour l’étude. Alternativement, les mesures stœchiométriques de l’oxydation réversible du thiol sur un type d’échantillon spécifique donnent une image générale de l’état physiologique par rapport à l’oxydation cellulaire, une mesure importante qui est souvent négligée et sous-utilisée. La stœchiométrie de modification est basée sur la quantification du pourcentage de thiol modifié par rapport au thiol protéique total (modifié et non modifié)20,21. En conséquence, les mesures stœchiométriques offrent une mesure plus précise que le changement de pli, en particulier lors de l’utilisation de la spectrométrie de masse. L’importance de l’augmentation de l’oxydation peut être plus facilement déterminée en utilisant la stœchiométrie pour déterminer l’occupation PTM d’un site particulier de cystéine. Par exemple, une multiplication par 3 de l’oxydation du thiol pourrait résulter d’une transition d’aussi peu que 1% à 3% ou aussi grande que 30% à 90%. Une multiplication par 3 de l’oxydation pour un site qui n’est occupé qu’à 1% peut avoir peu d’impact sur la fonction d’une protéine; Cependant, une multiplication par 3 pour un site avec un taux d’occupation de 30% à l’état de repos peut être plus substantiellement affectée. Les mesures stœchiométriques, lorsqu’elles sont effectuées entre les thiols oxydés totaux et des modifications oxydatives spécifiques, y compris la glutathionylation des protéines (SSG) et la nitrosylation (SNO), peuvent révéler des ratios et des informations quantitatives par rapport à des types de modification spécifiques.
Étant donné que l’oxydation réversible du thiol est généralement une modification post-traductionnelle de faible abondance, de multiples approches ont été développées pour l’enrichissement des protéines contenant ces modifications à partir d’échantillons biologiques. Une première approche conçue par Jaffrey et d’autres, appelée la technique de commutation de la biotine (BST)22, implique plusieurs étapes dans lesquelles les thiols non modifiés sont bloqués par alkylation, les thiols modifiés de manière réversible sont réduits en thiols libres naissants, les thiols libres naissants sont marqués avec de la biotine et les protéines marquées sont enrichies par la pulldown d’affinité de streptavidine. Cette technique a été utilisée pour établir le profil de l’ONS et de la SSG dans de nombreuses études et peut être adaptée pour sonder d’autres formes d’oxydation réversible du thiol23,24. Bien que la BST ait été utilisée pour sonder différentes formes d’oxydation réversible du thiol, l’une des préoccupations de cette approche est que l’enrichissement est affecté par la liaison non spécifique de protéines non biotinylées à la streptavidine. Une autre approche développée dans notre laboratoire, appelée capture assistée par résine (RAC)25,26 (Figure 1), contourne la question de l’enrichissement des groupes thiol via le système biotine-streptavidine.
Après la réduction des thiols oxydés de manière réversible, les protéines avec des thiols libres naissants sont enrichies par la résine d’affinité thiol, qui capture de manière covalente les groupes thiols libres, permettant un enrichissement plus spécifique des protéines contenant de la cystéine que la BST. Le couplage du RAC avec la puissance de multiplexage des progrès récents du marquage isobare et de la spectrométrie de masse crée un flux de travail robuste et sensible pour l’enrichissement, l’identification et la quantification des résidus de cystéine oxydés de manière réversible au niveau du protéome. Les progrès récents de la spectrométrie de masse ont permis un profilage beaucoup plus approfondi du protéome thiol redox, améliorant ainsi la compréhension de la cause et de l’effet de l’oxydation des protéines thiol27. Les informations obtenues à partir de données quantitatives spécifiques au site permettent d’étudier plus avant les impacts mécanistes et les effets en aval des modifications oxydatives réversibles28. L’utilisation de ce flux de travail a permis de mieux comprendre les impacts physiologiques de l’oxydation réversible de la cystéine par rapport aux événements physiologiques normaux tels que le vieillissement, dans lesquels les niveaux de SSG différaient en fonction de l’âge. Les effets du vieillissement sur la SSG ont été partiellement inversés à l’aide de SS-31 (élamipretide), un nouveau peptide qui améliore la fonction mitochondriale et réduit les niveaux de SSG chez les souris âgées, ce qui leur donne un profil SSG plus similaire à celui des jeunes souris29.
Il a été démontré que les conditions physiopathologiques attribuées à l’exposition aux nanoparticules impliquent la SSG dans un modèle de macrophage murin. En utilisant RAC couplé à la spectrométrie de masse, les auteurs ont montré que les niveaux de SSG étaient directement corrélés au degré de stress oxydatif et à l’altération de la fonction phagocytaire des macrophages. Les données ont également révélé des différences spécifiques à la voie dans la réponse à différents nanomatériaux manufacturés qui induisent différents degrés de stress oxydatif30. La méthode a également prouvé son utilité chez les espèces procaryotes, où elle a été appliquée pour étudier les effets des cycles diurnes chez les cyanobactéries photosynthétiques en ce qui concerne l’oxydation du thiol. De vastes changements dans l’oxydation du thiol à travers plusieurs processus biologiques clés ont été observés, y compris le transport d’électrons, la fixation du carbone et la glycolyse. De plus, grâce à la validation orthogonale, plusieurs sites fonctionnels clés ont été confirmés comme étant modifiés, suggérant des rôles régulateurs de ces modifications oxydatives6.
Nous décrivons ici les détails d’un flux de travail standardisé (Figure 1), démontrant l’utilité de l’approche RAC pour l’enrichissement des thiols de cystéine oxydés totaux des protéines et leur marquage ultérieur et leur quantification stœchiométrique. Ce flux de travail a été mis en œuvre dans des études de l’état redox dans différents types d’échantillons, y compris les cultures cellulaires27,30 et les tissus entiers (par exemple, muscle squelettique, cœur, poumon)29,31,32,33. Bien qu’il ne soit pas inclus ici, le protocole RAC est également facilement adapté à l’étude de formes spécifiques de modifications redox réversibles, y compris SSG, SNO et S-acylation, comme mentionné précédemment25,29,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

Les modifications oxydatives réversibles sur les thiols protéiques sont récemment apparues comme des médiateurs importants de la fonction cellulaire. Nous décrivons ici la procédure détaillée d’une méthode quantitative de protéomique redox qui utilise la capture assistée par résine (RAC) en combinaison avec le marquage isobare par étiquette de masse en tandem (TMT) et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) pour permettre la quantification stochiométrique multiplexée des thiols de protéines oxydées au niveau du protéome. Les informations quantitatives spécifiques au site sur les résidus oxydés de cystéine fournissent des informations supplémentaires sur les impacts fonctionnels de ces modifications. 
Le flux de travail est adaptable à de nombreux types d’échantillons, y compris les cellules en culture (par exemple, mammifères, procaryotes) et les tissus entiers (par exemple, le cœur, les poumons, les muscles), qui sont initialement lysés / homogénéisés et avec des thiols libres alkylés pour empêcher l’oxydation artificielle. Les thiols de protéines oxydées sont ensuite réduits et capturés par une résine d’affinité thiol, qui rationalise et simplifie les étapes du flux de travail en permettant aux procédures de digestion, d’étiquetage et de lavage d’être effectuées sans transfert supplémentaire de protéines / peptides. Enfin, les peptides marqués sont élués et analysés par LC-MS/MS pour révéler des changements stœchiométriques complets liés à l’oxydation du thiol sur l’ensemble du protéome. Cette méthode améliore considérablement la compréhension du rôle de la régulation redox-dépendante dans les états physiologiques et physiopathologiques liés à l’oxydation des protéines thiol.

L’achèvement du protocole entraînera un enrichissement hautement spécifique de peptides contenant de la cystéine anciennement oxydés, souvent avec une spécificité de >95% 27,35,36. Cependant, plusieurs étapes clés du protocole nécessitent une attention particulière, par exemple le blocage initial des thiols libres avant la lyse/homogénéisation de l’échantillon, qui interdit l’oxydation artificielle et l’enr...

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Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

L’oxydation des protéines thiols a des implications significatives dans des conditions physiologiques et physiopathologiques normales. Nous décrivons les détails d’une méthode quantitative de protéomique redox, qui utilise la capture assistée par résine, le marquage isobare et la spectrométrie de masse, permettant l’identification et la quantification spécifiques au site des résidus de cystéine oxydés de protéines de manière réversible.

Capture assistée par résine couplée à un étiquetage de masse en tandem isobare pour la quantification multiplexée de l’oxydation des protéines thiols

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Ce protocole décrit une méthode qui permet l’identification spécifique au site des résidus oxydés de cystine de protéines. La méthode permet de générer des données quantitatives et spécifiques au site sur les résidus de cystine oxydés à partir de différents types d’échantillons. Pour commencer la procédure de capture assistée, laver deux fois les granulés de protéines précipités avec de l’acétone en centrifugeant à 20, 500 G, dans quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, décantez l’acétone et retirez l’acétone restante avec une micro-pipette. À l’aide d’une pipette sérologique en verre, ajoutez trois millilitres d’acétone fraîche glacée dans le tube et mélangez bien en retournant le tube plusieurs fois. Après le deuxième lavage, laissez les granulés sécher à l’air pendant une à deux minutes sans les laisser sécher.Ajouter un millilitre de tampon B à la pastille de protéine séchée. Pour solubiliser la protéine, sonicer la pastille à plusieurs reprises dans un sonicateur de bain avec une sortie de 250 watts pendant 15 à 30 secondes à la fois, avec un bref vortex. Effectuer le test de l’acide bicinchoninique ou BCA pour mesurer la concentration en protéines.Pour normaliser les concentrations de protéines, transférez 500 microgrammes d’échantillon de protéines dans un filtre centrifuge de 0,5 millilitre et 10 kilodaltons et augmentez le volume de l’échantillon à 500 microlitres avec un tampon de remise en suspension. Centrifuger le mélange tampon protéique à 14 000 g à température ambiante, jusqu’à ce que le volume dans le filtre centrifuge soit inférieur à 100 microlitres. Prélever l’échantillon en inversant le filtre dans un tube de collecte.Centrifuger l’échantillon à 1000 G pendant deux minutes et ajouter le tampon C pour obtenir un volume final de 500 microlitres. Pour réduire les thiols protéiques, ajoutez 20 microlitres de dithiothréitol ou de DTT à 500 millimolaires à l’échantillon pour obtenir une concentration finale de 20 millimolaires et incuber les échantillons pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec agitation à 850 tr / min. Après réduction, centrifuger les échantillons dans des filtres centrifuges de 0,5 millilitre et 10 kilodaltons à 14 000 g à température ambiante, jusqu’à ce que le volume dans le filtre centrifuge soit inférieur à 100 microlitres.Ajouter le tampon D pour porter le volume à 500 microlitres et répéter la centrifugation. Après la quatrième centrifugation, prélever les échantillons en inversant le filtre dans un tube de collecte pour centrifuger à 1000 G pendant deux minutes. Ensuite, mesurez la concentration en protéines à l’aide du test BCA.Ensuite, placez les colonnes de spin sur un collecteur à vide et, à l’aide d’une micro-pipette, transférez 500 microlitres de la boue de résine d’affinité thiol fraîchement préparée à chaque colonne. Appliquer le vide pour éliminer l’eau. Répétez la procédure une fois pour obtenir 30 milligrammes de résine par colonne.Lavez la résine cinq fois avec 500 microlitres d’eau ultrapure, en appliquant un vide pour éliminer l’eau, puis cinq fois avec 500 microlitres de tampon E.In un nouveau tube, ajoutez le tampon C à 150 microgrammes de l’échantillon de protéines réduit jusqu’à ce que le volume final soit de 120 microlitres. Transférer la solution protéique dans une colonne de spin bouché contenant la résine. Placer le bouchon sur la colonne et incuber pendant deux heures à température ambiante en agitant à 850 tr/min.Lavez la résine comme décrit dans le manuscrit. Remplacez la fiche. Pour effectuer une digestion tryptique sur résine, ajoutez 120 microlitres de solution de trypsine fraîchement préparée aux échantillons et incuber la colonne pendant une nuit à 37 degrés Celsius, en agitant à 850 tr / min.Le lendemain, lavez la résine plusieurs fois comme décrit dans le manuscrit et remplacez le bouchon. À l’aide d’une micropipette, ajouter 40 microlitres de tampon de bicarbonate de triéthylammonium de 100 millimolaires à la résine lavée. Ajoutez ensuite 70 microlitres de l’étiquette de masse en tandem dissous ou du réactif de marquage TMT, et incuber pendant une heure à température ambiante en agitant à 850 tr / min.Conservez tout réactif TMT restant à moins 80 degrés Celsius. Lavez la résine et remplacez le bouchon. Éluer les peptides marqués TMT en ajoutant 100 microlitres de tampon de bicarbonate d’ammonium 100 millimolaires à pH 8,0, contenant 20 millimolaires de DTT, à la colonne, et en incubant la colonne sur un mélangeur thermique à température ambiante pendant 30 minutes à 850 tr / min.Après l’incubation, effectuer l’élution en plaçant la colonne sur un collecteur à vide, en appliquant le vide et en éluant les échantillons dans un tube microcentrifuge de cinq millilitres. Répétez l’étape une fois, puis ajoutez 100 microlitres d’acétonitrile à 80% avec 0,1% d’acide trifluoroacétique dans la colonne. Après avoir incubé la colonne pendant 10 minutes à température ambiante, éluer l’échantillon dans le même tube à centrifuger de cinq millilitres.Placer les échantillons élués dans un concentrateur sous vide jusqu’à ce qu’ils soient secs. Ensuite, conservez les peptides secs à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. L’analyse qualitative d’échantillons peptidiques de cellules RAW 264.7 a été réalisée avec SDS-PAGE, dans laquelle les échantillons ont été comparés en déterminant différents niveaux d’oxydation dus aux traitements.Les protéines séparées ont ensuite été sondées par transfert Western pour étudier plus en détail les niveaux d’oxydation des protéines individuelles. Les intensités ioniques rapportées de peptides contenant de la cystine ont été analysées par chromatographie liquide par spectrométrie de masse en tandem. La stœchiométrie d’oxydation thiol de l’iTRAQ, des peptides enrichis et oxydés marqués aux niveaux individuels du site cystine a été quantifiée.Retirez soigneusement l’acétone sans déranger la pastille de protéine. Assurez-vous que la pastille de protéine est complètement solubilisée et quantifiée avec précision, et que la résine est allouée avec précision aux colonnes de spin. Assurez-vous de remettre en suspension la résine pendant les étapes de lavage.Une évaluation plus approfondie des protéines et peptides enrichis peut être effectuée par SDS-PAGE et coloration, Western blot et spectrométrie de masse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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