Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Teile der Arbeit wurden durch NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 und U24 DK112349 unterstützt.

Alle im Protokoll beschriebenen Verfahren in Bezug auf tierische oder menschliche Proben/Gewebe wurden von der Ethikkommission für Human- und Tierforschung genehmigt und folgten den institutionellen Richtlinien.
1. Probenhomogenisierung/-lyse
<ol><li>Gefrorene Gewebeproben<ol><li>Zerkleinern Sie gefrorenes Gewebe (~ 30 mg) auf einem Glasmikroskopobjektträger auf Trockeneis mit einer vorgekühlten Rasierklinge und einer Pinzette. Das Hackfleisch wird in ein vorgekühltes 5-ml-Polystyrolröh...

Die harzunterstützte Abscheidung wurde in einer Vielzahl von Probentypen und biologischen Systemen zur Untersuchung oxidativer Modifikationen von Cysteinresteneingesetzt 25,29,30. Diese Methode ermöglicht die Auswertung von Proben auf mehreren Ebenen und Auslesen, einschließlich Proteinen und Peptiden mittels SDS-PAGE und Western Blot-Analyse sowie einzelner Cysteinstellen mittels Massenspektrometrie. Unabhängig vom Probenty...

Unter homöostatischen Bedingungen erzeugen Zellen reaktive Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelspezies, die dazu beitragen, Prozesse wie Stoffwechsel und Signalübertragung 1,2,3 zu erleichtern, die sich sowohl auf Prokaryoten als auch auf Eukaryoten erstrecken. Die physiologischen Ebenen dieser reaktiven Spezies sind für die ordnungsgemäße Zellfunktion notwendig, auch bekannt als "Eustress"1,4. Im Gegensatz dazu kann ein Anstieg der Oxidationsmittel, der zu einem Ungleichgewicht zwischen Oxidationsmitteln und Antioxidantien führt, oxidativen Stress oder "Distress"1 verursachen, der zu Zellschäden führt. Oxidantien leiten Signale an biologische Signalwege weiter, indem sie verschiedene Biomoleküle modifizieren, einschließlich Protein, DNA, RNA und Lipide. Insbesondere Cysteinreste von Proteinen sind hochreaktive Stellen, die aufgrund der Thiolgruppe auf Cystein, die gegenüber verschiedenen Arten von Oxidationsmitteln reaktiv ist, oxidationsanfällig sind5. Dies führt zu einer Vielzahl von reversiblen redoxbasierten posttranslationalen Modifikationen (PTMs) für Cystein, einschließlich Nitrosylierung (SNO), Glutathionylierung (SSG), Sulfenylierung (SOH), Persulfidierung (SSH), Polysulfidierung (SSnH), Acylierung und Disulfiden. Irreversible Formen der Cysteinoxidation umfassen Sulfinylierung (SO2H) und Sulfonylierung (SO3H).
Reversible oxidative Modifikationen von Cysteinresten können eine schützende Rolle spielen, die eine weitere irreversible Oxidation verhindert, oder als Signalmoleküle für nachgeschaltete zelluläre Signalwege dienen 6,7. Die Reversibilität einiger Thiol-Redox-PTMs ermöglicht es Cysteinstellen, als "Redoxschalter"8,9 zu fungieren, wobei Änderungen im Redoxzustand dieser Stellen die Proteinfunktion verändern, um ihre Rolle in transienten Prozessen zu regulieren. Die modulatorischen Wirkungen von Redox-PTMs 10 wurden in vielen Aspekten der Proteinfunktion 11 beobachtet, einschließlich Katalyse 12, Protein-Protein-Interaktionen13, Konformationsänderung14, Metallionenkoordination 15 oder pharmakologische Inhibitorbindung 16. Darüber hinaus sind Redox-PTMs an Cysteinstellen von Proteinen beteiligt, die Wege wie Transkription 17, Translation18 oder Stoffwechsel19 regulieren. Angesichts des Einflusses, den Redox-PTMs auf die Proteinfunktion und biologische Prozesse haben, ist es wichtig, das Ausmaß der Oxidation zu quantifizieren, das eine Cysteinstelle als Reaktion auf eine Störung des Redoxzustands erfährt.
Die Identifizierung von Cysteinstellen mit veränderten Redoxzuständen konzentriert sich auf den Vergleich der Oxidationsstufe auf der standortspezifischen Ebene zwischen normalen und gestörten Bedingungen. Faltenänderungsmessungen werden häufig verwendet, um festzustellen, welche Stellen signifikant verändert sind, da dies den Benutzern hilft, zu interpretieren, welche Cysteinstellen für die Studie physiologisch bedeutsam sein können. Alternativ liefern stöchiometrische Messungen der reversiblen Thioloxidation über einen bestimmten Probentyp hinweg ein allgemeines Bild des physiologischen Zustands in Bezug auf die zelluläre Oxidation, eine wichtige Messung, die oft übersehen und nicht ausreichend genutzt wird. Die Modifikationsstöchiometrie basiert auf der Quantifizierung des Prozentsatzes des modifizierten Thiols im Verhältnis zum Gesamtproteinthiol (modifiziert und unmodifiziert)20,21. Infolgedessen bieten stöchiometrische Messungen eine präzisere Messung als Faltenänderungen, insbesondere bei Verwendung der Massenspektrometrie. Die Bedeutung der Zunahme der Oxidation kann leichter durch die Stöchiometrie ermittelt werden, um die PTM-Belegung einer bestimmten Cysteinstelle zu bestimmen. Zum Beispiel könnte ein 3-facher Anstieg der Thioloxidation aus einem Übergang von nur 1% zu 3% oder so groß wie 30% zu 90% resultieren. Eine 3-fache Erhöhung der Oxidation für eine Stelle, die nur bei 1% Belegung ist, kann wenig Einfluss auf die Funktion eines Proteins haben; Eine 3-fache Erhöhung für einen Standort mit 30% Belegung im Ruhezustand kann jedoch stärker betroffen sein. Stöchiometrische Messungen, wenn sie zwischen insgesamt oxidierten Thiolen und spezifischen oxidativen Modifikationen, einschließlich Proteinglutathionylierung (SSG) und Nitrosylierung (SNO), durchgeführt werden, können Verhältnisse und quantitative Informationen in Bezug auf bestimmte Modifikationstypen aufdecken.
Da die reversible Thioloxidation typischerweise eine posttranslationale Modifikation mit geringer Häufigkeit ist, wurden mehrere Ansätze für die Anreicherung von Proteinen entwickelt, die diese Modifikationen aus biologischen Proben enthalten. Ein früher Ansatz, der von Jaffrey und anderen entwickelt wurde und als Biotin-Switch-Technik (BST)22 bezeichnet wird, umfasst mehrere Schritte, bei denen unmodifizierte Thiole durch Alkylierung blockiert werden, reversibel modifizierte Thiole zu entstehenden freien Thiolen reduziert werden, naszierende freie Thiole mit Biotin markiert werden und die markierten Proteine durch Streptavidin-Affinitätspulldown angereichert werden. Diese Technik wurde in vielen Studien verwendet, um SNO und SSG zu profilieren und kann angepasst werden, um andere Formen der reversiblen Thioloxidation23,24 zu untersuchen. Während BST verwendet wurde, um verschiedene Formen der reversiblen Thioloxidation zu untersuchen, besteht ein Problem bei diesem Ansatz darin, dass die Anreicherung durch die unspezifische Bindung von unbiotinylierten Proteinen an Streptavidin beeinflusst wird. Ein alternativer Ansatz, der in unserem Labor entwickelt wurde, genannt Resin-assisted capture (RAC)25,26 (Abbildung 1), umgeht das Problem der Anreicherung von Thiolgruppen über das Biotin-Streptavidin-System.
Nach der Reduktion reversibel oxidierter Thiole werden Proteine mit entstehenden freien Thiolen durch das Thiolaffinitätsharz angereichert, das kovalent freie Thiolgruppen einfängt, was eine spezifischere Anreicherung von Cystein-haltigen Proteinen als BST ermöglicht. Die Kopplung von RAC mit der Multiplexleistung der jüngsten Fortschritte in der isobaren Markierung und Massenspektrometrie schafft einen robusten und empfindlichen Workflow für die Anreicherung, Identifizierung und Quantifizierung reversibel oxidierter Cysteinreste auf proteomweiter Ebene. Jüngste Fortschritte in der Massenspektrometrie haben eine viel tiefere Profilierung des Thiolredoxproteoms ermöglicht und das Verständnis sowohl der Ursache als auch der Wirkung der Proteinthioloxidation verbessert27. Die aus standortspezifischen quantitativen Daten gewonnenen Informationen ermöglichen weitere Studien der mechanistischen Auswirkungen und nachgelagerten Effekte reversibler oxidativer Modifikationen28. Die Verwendung dieses Workflows hat Einblicke in die physiologischen Auswirkungen der reversiblen Cysteinoxidation in Bezug auf normale physiologische Ereignisse wie Alterung gegeben, wobei sich die SSG-Spiegel in Bezug auf das Alter unterschieden. Die Alterungseffekte auf SSG wurden teilweise mit SS-31 (Elamipretid) umgekehrt, einem neuartigen Peptid, das die mitochondriale Funktion verbessert und den SSG-Spiegel bei älteren Mäusen senkt, wodurch sie ein SSG-Profil haben, das jungen Mäusen ähnlicher ist29.
Es wurde gezeigt, dass pathophysiologische Bedingungen, die auf die Exposition von Nanopartikeln zurückzuführen sind, SSG in einem Mausmakrophagenmodell einbeziehen. Unter Verwendung von RAC in Verbindung mit Massenspektrometrie zeigten die Autoren, dass die SSG-Spiegel direkt mit dem Grad des oxidativen Stresses und der Beeinträchtigung der phagozytischen Makrophagenfunktion korrelierten. Die Daten zeigten auch wegspezifische Unterschiede in der Reaktion auf verschiedene technisch hergestellte Nanomaterialien, die unterschiedliche Grade von oxidativem Stress induzieren30. Die Methode hat sich auch bei prokaryotischen Spezies bewährt, wo sie angewendet wurde, um die Auswirkungen von Tageszyklen in photosynthetischen Cyanobakterien in Bezug auf die Thioloxidation zu untersuchen. Es wurden breite Veränderungen in der Thioloxidation über mehrere wichtige biologische Prozesse hinweg beobachtet, einschließlich Elektronentransport, Kohlenstofffixierung und Glykolyse. Darüber hinaus wurde durch orthogonale Validierung bestätigt, dass mehrere wichtige funktionelle Stellen modifiziert wurden, was auf eine regulatorische Rolle dieser oxidativen Modifikationen hindeutet6.
Hier beschreiben wir die Details eines standardisierten Workflows (Abbildung 1) und demonstrieren den Nutzen des RAC-Ansatzes für die Anreicherung von insgesamt oxidierten Cysteinthiolen von Proteinen und deren anschließende Markierung und stöchiometrische Quantifizierung. Dieser Workflow wurde in Studien des Redoxzustands in verschiedenen Probentypen implementiert, einschließlich Zellkulturen27,30 und ganzen Geweben (z. B. Skelettmuskel, Herz, Lunge)29,31,32,33. Obwohl das RAC-Protokoll hier nicht enthalten ist, kann es auch leicht für die Untersuchung spezifischer Formen reversibler Redoxmodifikationen angepasst werden, einschließlich SSG, NSO und S-Acylierung, wie bereits erwähnt25,29,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

Reversible oxidative Modifikationen an Proteinthiolen haben sich kürzlich als wichtige Mediatoren der Zellfunktion herausgestellt. Hierin beschreiben wir das detaillierte Verfahren einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang (RAC) in Kombination mit isobarer Tandem-Massenmarkierung (TMT) und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) verwendet, um eine gemultiplexte stöchiometrische Quantifizierung oxidierter Proteinthiole auf Proteomebene zu ermöglichen. Die standortspezifischen quantitativen Informationen zu oxidierten Cysteinresten liefern zusätzliche Einblicke in die funktionellen Auswirkungen solcher Modifikationen. 
Der Arbeitsablauf kann an viele Probentypen angepasst werden, einschließlich kultivierter Zellen (z. B. Säugetierzellen, Prokaryoten) und ganzer Gewebe (z. B. Herz, Lunge, Muskel), die zunächst lysiert/homogenisiert und mit freien Thiolen alkyliert werden, um eine künstliche Oxidation zu verhindern. Die oxidierten Proteinthiole werden dann reduziert und von einem Thiol-Affinitätsharz erfasst, das die Arbeitsschritte rationalisiert und vereinfacht, indem die fortschreitenden Verdauungs-, Markierungs- und Waschvorgänge ohne zusätzlichen Transfer von Proteinen / Peptiden durchgeführt werden können. Schließlich werden die markierten Peptide eluiert und mittels LC-MS/MS analysiert, um umfassende stöchiometrische Veränderungen im Zusammenhang mit der Thioloxidation über das gesamte Proteom aufzudecken. Diese Methode verbessert das Verständnis der Rolle der redoxabhängigen Regulation unter physiologischen und pathophysiologischen Zuständen im Zusammenhang mit der Proteinthioloxidation erheblich.

Die Fertigstellung des Protokolls wird zu einer hochspezifischen Anreicherung ehemals oxidierter Cystein-haltiger Peptide führen, oft mit >95% Spezifität 27,35,36. Einige Schlüsselschritte des Protokolls erfordern jedoch besondere Aufmerksamkeit, z. B. die anfängliche Blockierung freier Thiole vor der Probenlyse/Homogenisierung, die die künstliche Oxidation und unspezifische Anreicherung künstlich oxidierter Thiole verbiet...

Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Die Proteinthioloxidation hat unter normalen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen erhebliche Auswirkungen. Wir beschreiben die Details einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang, isobare Markierung und Massenspektrometrie verwendet, um eine ortsspezifische Identifizierung und Quantifizierung von reversibel oxidierten Cysteinresten von Proteinen zu ermöglichen.

Harzgestützte Erfassung in Verbindung mit isobarer Tandem-Massenmarkierung für eine multiplexige Quantifizierung der Proteinthioloxidation

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die eine ortsspezifische Identifizierung von oxidierten Cystinresten von Proteinen ermöglicht. Die Methode ermöglicht es, quantitative und standortspezifische Daten von oxidierten Cystinresten aus verschiedenen Probentypen zu generieren. Um das unterstützte Abscheidungsverfahren zu beginnen, waschen Sie die gefällten Proteinpellets zweimal mit Aceton, indem Sie bei 20, 500 G, bei vier Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren.Dekantieren Sie dann das Aceton und entfernen Sie das restliche Aceton mit einer Mikropipette. Mit einer serologischen Glaspipette drei Milliliter frisches eiskaltes Aceton in die Tube geben und gut mischen, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Lassen Sie die Pellets nach der zweiten Wäsche ein bis zwei Minuten an der Luft trocknen, ohne sie übertrocknen zu lassen.Fügen Sie dem getrockneten Proteinpellet einen Milliliter Puffer B hinzu. Um das Protein zu lösen, beschallen Sie das Pellet wiederholt in einem Badesonikator mit einer Leistung von 250 Watt für jeweils 15 bis 30 Sekunden zusammen mit kurzem Wirbeln. Führen Sie den Bicinchoninsäure- oder BCA-Assay durch, um die Proteinkonzentration zu messen.Um die Proteinkonzentrationen zu standardisieren, werden 500 Mikrogramm Proteinprobe in einen 0,5 Milliliter, 10 Kilodalton Zentrifugalfilter überführt und die Probe mit Resuspensionspuffer auf 500 Mikroliter erhöht. Zentrifugieren Sie die Proteinpuffermischung bei 14.000 G bei Raumtemperatur, bis das Volumen im Zentrifugalfilter weniger als 100 Mikroliter beträgt. Sammeln Sie die Probe, indem Sie den Filter in einem Sammelröhrchen umdrehen.Zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 G für zwei Minuten und fügen Sie Puffer C hinzu, um ein Endvolumen von 500 Mikrolitern zu erhalten. Um die Proteinthiole zu reduzieren, fügen Sie 20 Mikroliter 500 Millimolar Dithiothreitol oder DTT in die Probe hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar zu erhalten, und inkubieren Sie die Proben für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 850 U / min. Nach der Reduktion werden die Proben in 0,5 Milliliter 10 Kilodalton Zentrifugalfilter bei 14.000 G bei Raumtemperatur zentrifugiert, bis das Volumen im Zentrifugalfilter weniger als 100 Mikroliter beträgt.Fügen Sie den Puffer D hinzu, um das Volumen auf 500 Mikroliter zu erhöhen, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Nach der vierten Zentrifugation sammeln Sie die Proben, indem Sie den Filter in einem Sammelröhrchen umdrehen, um zwei Minuten lang bei 1000 G zu zentrifugieren. Messen Sie dann die Proteinkonzentration mit dem BCA-Assay.Als nächstes legen Sie die Spinsäulen auf einen Vakuumverteiler und übertragen mit einer Mikropipette 500 Mikroliter der frisch zubereiteten Thiol-Affinitätsharzaufschlämmung auf jede Säule. Wenden Sie Vakuum an, um Wasser zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang einmal, um 30 Milligramm Harz pro Säule zu erhalten.Waschen Sie das Harz fünfmal mit 500 Mikrolitern Reinstwasser, indem Sie ein Vakuum anwenden, um das Wasser zu entfernen, und dann fünfmal mit 500 Mikrolitern Puffer E.In einem neuen Röhrchen, fügen Sie Puffer C zu 150 Mikrogramm der reduzierten Proteinprobe hinzu, bis das endgültige Volumen 120 Mikroliter beträgt. Übertragen Sie die Proteinlösung in eine verstopfte Spinsäule, die das Harz enthält. Setzen Sie die Kappe auf die Säule und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur mit Schütteln bei 850 U/min.Waschen Sie das Harz wie im Manuskript beschrieben. Ersetzen Sie den Stecker (plug). Um einen tryptischen Aufschluss auf Harz durchzuführen, fügen Sie den Proben 120 Mikroliter frisch zubereitete Trypsinlösung hinzu und inkubieren Sie die Säule über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 850 U/min.Am nächsten Tag waschen Sie das Harz mehrmals, wie im Manuskript beschrieben, und ersetzen Sie den Stopfen. Mit einer Mikropipette 40 Mikroliter 100 Millimolar Triethylammoniumbicarbonatpuffer in das gewaschene Harz geben. Dann fügen Sie 70 Mikroliter des gelösten Tandem-Massenetiketts oder TMT-Etikettierreagenz hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 850 U/min.Lagern Sie das restliche TMT-Reagenz bei minus 80 Grad Celsius. Waschen Sie das Harz und setzen Sie den Stopfen wieder ein. Eluieren Sie die TMT-markierten Peptide, indem Sie 100 Mikroliter 100 Millimolar Ammoniumbicarbonatpuffer bei pH 8,0, der 20 Millimolar DTT enthalten, in die Säule geben und die Säule auf einem thermischen Mischer bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 850 U/min inkubieren.Führen Sie nach der Inkubation eine Elution durch, indem Sie die Säule auf einen Vakuumverteiler legen, das Vakuum anwenden und die Proben in ein Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen eluieren. Wiederholen Sie den Schritt einmal und fügen Sie dann 100 Mikroliter 80% Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure in die Säule ein. Nach 10-minütiger Inkubation der Säule bei Raumtemperatur eluieren Sie die Probe im selben Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Legen Sie die eluierten Proben in einen Vakuumkonzentrator, bis sie trocken sind. Anschließend lagern Sie die trockenen Peptide bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Die qualitative Analyse von Peptidproben aus RAW 264.7 Zellen wurde mit SDS-PAGE durchgeführt, wobei Proben durch Bestimmung verschiedener Oxidationsgrade aufgrund von Behandlungen verglichen wurden.Die getrennten Proteine wurden anschließend mit Western Blot untersucht, um die Oxidationsgrade einzelner Proteine weiter zu untersuchen. Die berichteten Ionenintensitäten von cystinhaltigen Peptiden wurden mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Thioloxidationsstöchiometrie von iTRAQ markierte angereicherte und oxidierte Peptide auf einzelnen Cystinstellenebenen wurden quantifiziert.Entfernen Sie vorsichtig Aceton, ohne das Proteinpellet zu stören. Stellen Sie sicher, dass das Proteinpellet vollständig löslich und präzise quantifiziert ist und dass das Harz den Spinsäulen genau zugeordnet ist. Achten Sie darauf, Harz während der Waschschritte zu resuspendieren.Die weitere Bewertung von angereicherten Proteinen und Peptiden kann durch SDS-PAGE und Färbung, Western Blotting und Massenspektrometrie erfolgen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...