Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

חלקים מהעבודה נתמכו על ידי מענקי NIH R01 DK122160, R01 HL139335 ו- U24 DK112349

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול הנוגעים לדגימות/רקמות של בעלי חיים או בני אדם אושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבני אדם ובבעלי חיים ופעלו על פיה.
1. הומוגניזציה/תזה לדוגמה
<ol><li>דגימות רקמה קפואות<ol><li>טחינה של רקמה קפואה (~ 30 מ"ג) על מיקרוסקופ זכוכית להחליק על קרח יבש באמצעות סכין ?...

לכידה בסיוע שרף שימשה במגוון סוגי דגימות ומערכות ביולוגיות לחקר שינויים חמצוניים של שאריות ציסטאין25,29,30. שיטה זו מאפשרת הערכה של דגימות ברמות וקריאות מרובות, כולל חלבונים ופפטידים באמצעות SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים, כמו גם אתרי ציסטאין ב?...

בתנאים הומאוסטטיים, תאים מייצרים חמצן, חנקן או מיני גופרית תגובתיים המסייעים להקל על תהליכים, כגון חילוף חומרים ואיתות 1,2,3, המגיעים הן לפרוקריוטים והן לאאוקריוטים. רמות פיזיולוגיות של מינים תגובתיים אלה נחוצות לתפקוד תקין של התאים, הידוע גם בשם 'eustress'1,4. לעומת זאת, עלייה במחמצנים שמובילה לחוסר איזון בין מחמצנים לנוגדי חמצון עלולה לגרום לעקה חמצונית, או 'מצוקה'1, שמובילה לפגיעה בתאים. מחמצנים מתמרים אותות למסלולים ביולוגיים על ידי שינוי ביומולקולות שונות, כולל חלבונים, דנ"א, רנ"א ושומנים. בפרט, שאריות ציסטאין של חלבונים הן אתרים תגובתיים מאוד המועדים לחמצון עקב קבוצת התיול על ציסטאין, שהוא תגובתי כלפי סוגים שונים של מחמצנים5. זה יוצר מגוון רחב של שינויים פוסט-טרנסלציוניים הפיכים מבוססי חמצון-חיזור (PTMs) עבור ציסטאין, כולל ניטרוזילציה (SNO), גלוטתיוניל (SSG), סולפנילציה (SOH), פרסולפידציה (SSH), פוליסולפידציה (SSnH), אצילציה ודיסולפידים. צורות בלתי הפיכות של חמצון ציסטאין כוללות סולפינילציה (SO2H) וסולפונילציה (SO3H).
שינויים חמצוניים הפיכים של שאריות ציסטאין עשויים לשמש כמגנים ולמנוע חמצון בלתי הפיך נוסף או לשמש כמולקולות איתות למסלולים תאיים במורד הזרם 6,7. ההפיכות של חלק מה-PTMs של חמצון-חיזור מחדש של תיול מאפשרת לאתרי ציסטאין לתפקד כ"מתגי חמצון-חיזור"8,9, כאשר שינויים במצב חמצון-חיזור של אתרים אלה משנים את תפקוד החלבון כדי לווסת את תפקידם בתהליכים חולפים. ההשפעות המווסתות של PTMs10 של חמצון-חיזור נצפו בהיבטים רבים של תפקוד חלבונים11, כולל קטליזה12, אינטראקציות חלבון-חלבון 13, שינוי קונפורמציה 14, תיאום יוני מתכת 15, או קשירת מעכבים פרמקולוגית 16. בנוסף, PTMs של חמצון-חיזור מעורבים באתרי ציסטאין של חלבונים המווסתים מסלולים כגון שעתוק17, תרגום 18 או חילוף חומרים19. בהתחשב בהשפעה שיש ל-PTMs של חמצון-חיזור על תפקוד חלבונים ותהליכים ביולוגיים, חשוב לכמת את מידת החמצון שעובר אתר ציסטאין בתגובה להפרעה במצב חמצון-חיזור.
הזיהוי של אתרי ציסטאין עם מצבי חמצון-חיזור משתנים מתמקד בהשוואה של מצב החמצון ברמה הספציפית לאתר בין תנאים נורמליים לתנאים מופרעים. מדידות שינוי קיפול משמשות לעתים קרובות כדי לקבוע אילו אתרים משתנים באופן משמעותי מכיוון שזה עוזר למשתמשים לפרש אילו אתרי ציסטאין עשויים להיות משמעותיים מבחינה פיזיולוגית למחקר. לחלופין, מדידות סטויכיומטריות של חמצון תיול הפיך על פני סוג דגימה מסוים נותנות תמונה כללית של המצב הפיזיולוגי ביחס לחמצון התאים, מדידה חשובה שלעתים קרובות מתעלמים ממנה ולא מנצלים אותה. סטויכיומטריה של שינוי מבוססת על כימות אחוז התיול המהונדס כיחס לסך החלבון תיול (שונה ולא שונה)20,21. כתוצאה מכך, מדידות סטויכיומטריות מציעות מדידה מדויקת יותר מאשר שינוי קיפול, במיוחד בעת שימוש בספקטרומטריית מסות. ניתן לברר ביתר קלות את משמעות העלייה בחמצון על ידי שימוש בסטויכיומטריה כדי לקבוע את תפוסת ה- PTM של אתר ציסטאין מסוים. לדוגמה, עלייה של פי 3 בחמצון תיול יכולה לנבוע ממעבר של 1% ל-3% או מגודל של 30% עד 90%. עלייה של פי 3 בחמצון עבור אתר שנמצא בתפוסה של 1% בלבד עשויה להיות בעלת השפעה מועטה על תפקוד החלבון; עם זאת, עלייה של פי 3 עבור אתר עם תפוסה של 30% במצב מנוחה עשויה להיות מושפעת באופן משמעותי יותר. מדידות סטויכיומטריות, כאשר הן מבוצעות בין סך כל התיולים המחומצנים לבין שינויים חמצוניים ספציפיים, כולל חלבון גלוטתיוניל (SSG) וניטרוסילציה (SNO), יכולות לחשוף יחסים ומידע כמותי ביחס לסוגי שינויים ספציפיים.
מאחר שחמצון תיול הפיך הוא בדרך כלל שינוי פוסט-טרנסלציוני בעל שפע נמוך, פותחו גישות רבות להעשרת חלבונים המכילים שינויים אלה מתוך דגימות ביולוגיות. גישה מוקדמת שהומצאה על ידי ג'פרי ואחרים, שנקראה טכניקת מתג הביוטין (BST)22, כוללת שלבים מרובים שבהם תיולים ללא שינוי נחסמים באמצעות אלקילציה, תיולים שעברו שינוי הפיך מצטמצמים לתיולים חופשיים מתהווים, תיולים חופשיים מתהווים מסומנים בביוטין, והחלבונים המסומנים מועשרים על ידי משיכה של זיקה לסטרפטאווידין. טכניקה זו שימשה לפרופיל SNO ו- SSG במחקרים רבים וניתן להתאים אותה כדי לחקור צורות אחרות של חמצון תיול הפיך23,24. בעוד ש-BST נוצל כדי לחקור צורות שונות של חמצון תיול הפיך, אחד החששות בגישה זו הוא שההעשרה מושפעת מהקשירה הלא ספציפית של חלבונים לא ביוטינילטים לסטרפטאבידין. גישה חלופית שפותחה במעבדה שלנו, שנקראת לכידה בסיוע שרף (RAC)25,26 (איור 1), עוקפת את הנושא של העשרת קבוצות תיול באמצעות מערכת ביוטין-סטרפטאווידין.
בעקבות הפחתה של תיולים מחומצנים באופן הפיך, חלבונים עם תיולים חופשיים מתהווים מועשרים על ידי שרף זיקה תיול, אשר לוכד באופן קוולנטי קבוצות תיול חופשי, ומאפשר העשרה ספציפית יותר של חלבונים המכילים ציסטאין מאשר BST. צימוד RAC עם כוח הריבוב של ההתקדמות האחרונה בתיוג איזוברי וספקטרומטריית מסות יוצר זרימת עבודה חזקה ורגישה להעשרה, זיהוי וכימות של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך ברמה הרחבה של פרוטאום. ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסות אפשרה פרופיל עמוק הרבה יותר של פרוטאום החיזור של תיול, מה שהגביר את ההבנה של הסיבה והתוצאה של חמצון תיול חלבון27. המידע המתקבל מנתונים כמותיים ספציפיים לאתר מאפשר מחקרים נוספים על ההשפעות המכניסטיות וההשפעות במורד הזרם של שינויים חמצוניים הפיכים28. שימוש בתהליך עבודה זה סיפק תובנה לגבי ההשפעות הפיזיולוגיות של חמצון ציסטאין הפיך ביחס לאירועים פיזיולוגיים נורמליים כגון הזדקנות, שבהם רמות ה- SSG היו שונות ביחס לגיל. השפעות ההזדקנות על SSG התהפכו חלקית באמצעות SS-31 (אלמיפרטיד), פפטיד חדש המשפר את תפקוד המיטוכונדריה ומפחית את רמות ה-SSG בעכברים מבוגרים, מה שגורם להם להיות בעלי פרופיל SSG דומה יותר לעכברים צעירים29.
הודגם כי תנאים פתופיזיולוגיים המיוחסים לחשיפה לננו-חלקיקים מערבים SSG במודל מקרופאגים של עכברים. באמצעות RAC בשילוב עם ספקטרומטריית מסות, החוקרים הראו כי רמות SSG היו בקורלציה ישירה למידת העקה החמצונית ולפגיעה בתפקוד הפאגוציטי של מקרופאגים. הנתונים גם חשפו הבדלים ספציפיים למסלול בתגובה לננו-חומרים מהונדסים שונים הגורמים לדרגות שונות של עקה חמצונית30. השיטה הוכיחה את תועלתה גם במינים פרוקריוטים, שם היא יושמה כדי לחקור את ההשפעות של מחזורים יומיים בציאנובקטריה פוטוסינתטית ביחס לחמצון תיול. נצפו שינויים נרחבים בחמצון תיול במספר תהליכים ביולוגיים מרכזיים, כולל הובלת אלקטרונים, קיבוע פחמן וגליקוליזה. יתר על כן, באמצעות אימות אורתוגונלי, מספר אתרים פונקציונליים מרכזיים אושרו לשינוי, מה שמרמז על תפקידים רגולטוריים של שינויים חמצוניים אלה6.
במאמר זה נתאר את הפרטים של זרימת עבודה מתוקננת (איור 1), המדגימה את התועלת של גישת RAC להעשרת סך כל תיולי ציסטאין מחומצנים של חלבונים ואת התיוג והכימות הסטויכיומטרי שלהם לאחר מכן. תהליך עבודה זה יושם במחקרים של מצב חמצון-חיזור בסוגי דגימות שונים, כולל תרביות תאים27,30 ורקמות שלמות (למשל, שרירי שלד, לב, ריאות)29,31,32,33. למרות שאינו כלול כאן, פרוטוקול RAC מותאם בקלות גם לחקירה של צורות ספציפיות של שינויי חמצון-חיזור הפיכים, כולל SSG, SNO ו-S-acylation, כפי שצוין קודם לכן25,29,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

שינויים חמצוניים הפיכים בתיולים חלבוניים התגלו לאחרונה כמתווכים חשובים של תפקוד התאים. להלן נתאר את ההליך המפורט של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור המשתמשת בלכידה בסיוע שרף (RAC) בשילוב עם תיוג איזוברי של תג מסה טנדם (TMT) וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם (LC-MS/MS) כדי לאפשר כימות סטוכיומטרי מרובב של תיולים חלבוניים מחומצנים ברמת הפרוטאום. המידע הכמותי הספציפי לאתר על שאריות ציסטאין מחומצן מספק תובנה נוספת לגבי ההשפעות הפונקציונליות של שינויים כאלה. 
זרימת העבודה ניתנת להתאמה על פני סוגי דגימות רבים, כולל תאים בתרבית (למשל, יונקים, פרוקריוטים) ורקמות שלמות (למשל, לב, ריאות, שרירים), אשר בתחילה שוכבים/הומוגניים ועם תיולים חופשיים להיות alkylated כדי למנוע חמצון מלאכותי. לאחר מכן, תיול החלבון המחומצן מצטמצם ונלכד על ידי שרף זיקה לתיול, אשר מייעל ומפשט את שלבי זרימת העבודה בכך שהוא מאפשר לבצע את הליכי העיכול, הסימון והשטיפה ללא העברה נוספת של חלבונים/פפטידים. לבסוף, הפפטידים המסומנים עוברים אלוט וניתוח על ידי LC-MS/MS כדי לחשוף שינויים סטויכיומטריים מקיפים הקשורים לחמצון תיול על פני הפרוטאום כולו. שיטה זו משפרת מאוד את ההבנה של התפקיד של ויסות תלוי חמצון-חיזור במצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים הקשורים לחמצון חלבון תיול.

השלמת הפרוטוקול תביא להעשרה ספציפית ביותר של פפטידים המכילים ציסטאין שחומצנו בעבר, לעתים קרובות עם ספציפיותשל >95% 27,35,36. עם זאת, מספר שלבים מרכזיים בפרוטוקול דורשים תשומת לב מיוחדת, למשל, חסימה ראשונית של תיולים חופשיים לפני ליזיס דגימה / ה...

Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

לחמצון חלבון תיול יש השלכות משמעותיות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים רגילים. אנו מתארים את הפרטים של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור, המשתמשת בלכידה בסיוע שרף, תיוג איזוברי וספקטרומטריית מסה, ומאפשרת זיהוי וכימות ספציפיים לאתר של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך של חלבונים.

לכידה בסיוע שרפים בשילוב עם תיוג תג מסת טנדם איזוברי לכימות מרובב של חמצון חלבון תיול

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה המאפשרת זיהוי ספציפי לאתר של שאריות ציסטין מחומצנות של חלבונים. השיטה מאפשרת להפיק נתונים כמותיים וספציפיים לאתר של שאריות ציסטין מחומצנות מסוגי דגימות שונים. כדי להתחיל בהליך הלכידה בסיוע, יש לשטוף את כדורי החלבון המזורזים פעמיים באצטון על ידי צנטריפוגה בעוצמה של 20, 500 גרם, בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר מכן decant את האצטון ולהסיר את האצטון הנותר עם מיקרו פיפטה. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית להוסיף שלושה מיליליטר של אצטון קר כקרח טרי לצינור ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. לאחר השטיפה השנייה, אפשרו לכופתיות להתייבש באוויר במשך דקה עד שתי דקות מבלי לתת להן להתייבש.מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ B לכדור החלבון המיובש. כדי לבודד את החלבון, סוניקו את הכדור שוב ושוב בסוניק אמבטיה עם תפוקה של 250 וואט למשך 15 עד 30 שניות בכל פעם, יחד עם מערבולת קצרה. בצעו את בדיקת החומצה הביצ'ינצ'ונית או BCA כדי למדוד את ריכוז החלבון.כדי לתקנן את ריכוזי החלבון, העבירו 500 מיקרוגרם של דגימת חלבון למסנן צנטריפוגלי של 0.5 מיליליטר, 10 קילודלטון, והגדילו את הדגימה ל-500 מיקרוליטר עם חיץ מחדש. צנטריפוגה תערובת מאגר חלבון ב 14, 000 גרם בטמפרטורת החדר, עד נפח במסנן צנטריפוגלי הוא פחות מ 100 microliters. אסוף את הדגימה על ידי היפוך המסנן בצינור איסוף.צנטריפוגה הדגימה ב 1000 G במשך שתי דקות ולהוסיף חיץ C כדי לקבל נפח סופי של 500 מיקרוליטר. כדי להפחית את תיול החלבון, להוסיף 20 microliters של 500 מילימולר dithiothreitol או DTT, לדגימה כדי לקבל ריכוז סופי של 20 מילימולר, ולדגור את הדגימות במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 850 סל"ד. לאחר הפחתה, צנטריפוגה לדגימות לתוך 0.5 מיליליטר 10 קילודלטון מסננים צנטריפוגליים ב 14, 000 G בטמפרטורת החדר, עד נפח במסנן צנטריפוגלי הוא פחות מ 100 microliters.הוסף חיץ D כדי להשלים את הנפח ל-500 מיקרוליטר וחזור על הצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה הרביעית, אסוף את הדגימות על ידי היפוך המסנן בצינור איסוף לצנטריפוגה ב 1000 G במשך שתי דקות. לאחר מכן מדדו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA.לאחר מכן, מניחים את עמודי הספין על סעפת ואקום, ובעזרת מיקרו פיפטה מעבירים 500 מיקרוליטרים של שרף זיקה תיול טרי לכל עמודה. החל ואקום להסרת מים. חזור על ההליך פעם אחת כדי לקבל 30 מיליגרם של שרף לכל עמודה.לשטוף את השרף חמש פעמים עם 500 microliters של מים ultrapurure, על ידי החלת ואקום כדי להסיר את המים ולאחר מכן חמש פעמים עם 500 microliters של חיץ E.In צינור חדש, להוסיף חיץ C ל 150 מיקרוגרם של דגימת חלבון מופחת עד נפח הסופי הוא 120 microliters. מעבירים את תמיסת החלבון לעמודת ספין סתומה המכילה את השרף. מניחים את הכובע על העמוד ודוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם רעידות ב-850 סל"ד.לשטוף את השרף כפי שמתואר בכתב היד. החלף את התקע. כדי לבצע עיכול טריפטי על שרף, הוסיפו 120 מיקרוליטרים של תמיסת טריפסין טרייה לדגימות, ודגרו את העמודה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם רעידות במהירות של 850 סל"ד.למחרת, יש לשטוף את השרף מספר פעמים כמתואר בכתב היד ולהחליף את התקע. באמצעות מיקרו פיפטה, להוסיף 40 microliters של 100 מילימולר Triethylammonium ביקרבונט חיץ שרף שטף. לאחר מכן הוסיפו 70 מיקרוליטרים של תג מסת טנדם מומס או מגיב תיוג TMT, ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-850 סל"ד.אחסן את כל מגיב TMT שנותר במינוס 80 מעלות צלזיוס. שטפו את השרף והחליפו את התקע. שדרגו את הפפטידים המסומנים ב-TMT על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של חיץ אמוניום ביקרבונט של 100 מילימולאר ב-pH 8.0, המכיל DTT של 20 מילימולר, לעמודה, והדגרת העמודה על מערבל תרמי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב-850 סל"ד.לאחר הדגירה, בצע אלוציה על ידי הנחת העמודה על סעפת ואקום, החלת הוואקום והפיכת הדגימות לצינור מיקרו צנטריפוגה של חמישה מיליליטר. חזור על השלב פעם אחת, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של 80% acetonitrile עם 0.1% חומצה trifluoroacetic לעמודה. לאחר דגירה של העמודה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לחמוק מהדגימה באותו צינור צנטריפוגה של חמישה מיליליטר.מניחים את הדגימות המלוטשות ברכז ואקום עד לייבוש. לאחר מכן יש לאחסן את הפפטידים היבשים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הניתוח האיכותי של דגימות פפטידים מתאי RAW 264.7 בוצע באמצעות SDS-PAGE, שבו הדגימות הושוו על ידי קביעת רמות שונות של חמצון עקב טיפולים.החלבונים שהופרדו נחקרו לאחר מכן על ידי כתם מערבי כדי לחקור עוד יותר את רמות החמצון של חלבונים בודדים. עוצמות יונים מדווחות של ציסטין המכילות פפטידים נותחו על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית. הסטויכיומטריה של חמצון תיול של iTRAQ, המסומנת כפפטידים מועשרים ומחומצנים ברמות של אתרי ציסטין בודדים, כומתה.בזהירות להסיר אצטון מבלי להפריע גלולה חלבון. ודאו כי גלולת החלבון מסיסה לחלוטין וכמותית במדויק, וכי שרף מוקצה במדויק לעמודות ספין. הקפידו להשהות את השרף במהלך שלבי הכביסה.הערכה נוספת של חלבונים ופפטידים מועשרים עשויה להתבצע על ידי SDS-PAGE וכתמים, כתם מערבי וספקטרומטריית מסה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...