Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Deler av arbeidet ble støttet av NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 og U24 DK112349

Alle prosedyrer beskrevet i protokollen knyttet til dyre- eller menneskeprøver/vev ble godkjent av og fulgte de institusjonelle retningslinjene til forskningsetisk komité for mennesker og dyr.
1. Prøvehomogenisering/lysis
<ol><li>Frosne vevsprøver<ol><li>Hakk frosset vev (~ 30 mg) på et glass mikroskop lysbilde på tørris ved hjelp av en forkjølt barberblad og tang. Overfør det hakkede vevet til et forkjølt 5 ml rundbunns polystyrenrør som inneholder 700 μL buffer A (se ta...

Harpiksassistert fangst har blitt brukt på tvers av en rekke prøvetyper og biologiske systemer for undersøkelse av oksidative modifikasjoner av cysteinrester25,29,30. Denne metoden tillater evaluering av prøver på flere nivåer og avlesninger, inkludert proteiner og peptider ved hjelp av SDS-PAGE og western blot-analyse, samt individuelle cysteinsteder ved hjelp av massespektrometri. Uavhengig av prøvetype eller endelig en...

Under homeostatiske forhold genererer celler reaktive oksygen-, nitrogen- eller svovelarter som bidrar til å lette prosesser, for eksempel metabolisme og signalering 1,2,3, som strekker seg til både prokaryoter og eukaryoter. Fysiologiske nivåer av disse reaktive artene er nødvendige for riktig cellulær funksjon, også kjent som 'eustress'1,4. I motsetning til dette kan en økning i oksidanter som fører til ubalanse mellom oksidanter og antioksidanter forårsake oksidativt stress, eller "nød"1, som fører til cellulær skade. Oksidanter transduserer signaler til biologiske veier ved å modifisere forskjellige biomolekyler, inkludert protein, DNA, RNA og lipider. Spesielt er cysteinrester av proteiner svært reaktive steder utsatt for oksidasjon på grunn av tiolgruppen på cystein, som er reaktiv mot forskjellige typeroksidanter. Dette gir opphav til et mangfoldig utvalg av reversible redoksbaserte posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) for cystein, inkludert nitrosylering (SNO), glutationylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidasjon (SSH), polysulfidasjon (SSnH), acylation og disulfides. Irreversible former for cysteinoksidasjon inkluderer sulfinylering (SO2H) og sulfonylering (SO3H).
Reversible oksidative modifikasjoner av cysteinrester kan tjene beskyttende roller som forhindrer ytterligere irreversibel oksidasjon eller tjene som signalmolekyler for nedstrøms cellulære veier 6,7. Reversibiliteten til noen tiol redox PTM gjør at cysteinsteder kan fungere som "redoksbrytere"8,9, hvor endringer i redokstilstanden til disse områdene endrer proteinfunksjonen for å regulere deres rolle i forbigående prosesser. De modulerende effektene av redoks PTM10 har blitt observert i mange aspekter av proteinfunksjon 11, inkludert katalyse 12, protein-protein-interaksjoner13, konformasjonsendring 14, metallionkoordinasjon 15 eller farmakologisk inhibitorbinding 16. I tillegg er redoks PTM involvert i cysteinsteder av proteiner som regulerer veier som transkripsjon 17, oversettelse18 eller metabolisme19. Gitt virkningen som redoks PTM har på proteinfunksjon og biologiske prosesser, er det viktig å kvantifisere omfanget av oksidasjon som et cysteinsted gjennomgår som svar på en forstyrrelse av redokstilstanden.
Identifiseringen av cysteinsteder med endrede redokstilstander er fokusert på sammenligning av oksidasjonstilstanden på det stedsspesifikke nivået mellom normale og forstyrrede forhold. Foldendringsmålinger brukes ofte til å bestemme hvilke steder som er betydelig endret, da dette hjelper brukerne til å tolke hvilke cysteinsteder som kan være fysiologisk signifikante for studien. Alternativt gir støkiometriske målinger av reversibel tioloksidasjon over en bestemt prøvetype et generelt bilde av den fysiologiske tilstanden med hensyn til cellulær oksidasjon, en viktig måling som ofte overses og underutnyttes. Modifikasjonsstøkiometri er basert på kvantifisering av prosentandelen modifisert tiol som et forhold til totalt proteintiol (modifisert og umodifisert)20,21. Som et resultat gir støkiometriske målinger en mer presis måling enn foldeendring, spesielt ved bruk av massespektrometri. Betydningen av økningen i oksidasjon kan lettere fastslås ved å bruke støkiometri for å bestemme PTM-belegget på et bestemt cysteinsted. For eksempel kan en 3 ganger økning i tioloksidasjon skyldes en overgang på så lite som 1% til 3% eller så stor som 30% til 90%. En 3 ganger økning i oksidasjon for et sted som bare er ved 1% belegg, kan ha liten innvirkning på proteinets funksjon; Imidlertid kan en 3 ganger økning for et sted med 30% belegg i hviletilstand bli mer vesentlig påvirket. Støkiometriske målinger, når de utføres mellom totale oksyderte tioler og spesifikke oksidative modifikasjoner, inkludert proteinglutationylering (SSG) og nitrosylering (SNO), kan avsløre forhold og kvantitativ informasjon med hensyn til spesifikke modifikasjonstyper.
Fordi reversibel tioloksidasjon vanligvis er en lav-overflod posttranslasjonell modifikasjon, har flere tilnærminger blitt utviklet for anrikning av proteiner som inneholder disse modifikasjonene ut av biologiske prøver. En tidlig tilnærming utviklet av Jaffrey og andre, kalt biotinbryterteknikken (BST)22, involverer flere trinn hvor umodifiserte tioler blokkeres gjennom alkylering, reversibelt modifiserte tioler reduseres til begynnende frie tioler, begynnende frie tioler er merket med biotin, og de merkede proteinene er beriket av nedtrekk av streptavidinaffinitet. Denne teknikken har blitt brukt til å profilere SNO og SSG i mange studier og kan tilpasses for sonde for andre former for reversibel tioloksidasjon23,24. Mens BST har blitt brukt til å sonde for ulike former for reversibel tioloksidasjon, er en bekymring med denne tilnærmingen at anrikning påvirkes av den ikke-spesifikke bindingen av ubiotinylerte proteiner til streptavidin. En alternativ tilnærming utviklet i vårt laboratorium, kalt harpiksassistert fangst (RAC) 25,26 (figur 1), omgår spørsmålet om anrikning av tiolgrupper via biotin-streptavidin-systemet.
Etter reduksjon av reversibelt oksyderte tioler, blir proteiner med begynnende frie tioler beriket av tiol-affinitetsharpiksen, som kovalent fanger frie tiolgrupper, noe som muliggjør mer spesifikk anrikning av cysteinholdige proteiner enn BST. Kobling av RAC med multipleksingskraften til de siste fremskrittene innen isobarisk merking og massespektrometri skaper en robust og sensitiv arbeidsflyt for anrikning, identifisering og kvantifisering av reversibelt oksyderte cysteinrester på proteom-bredt nivå. Nylige fremskritt innen massespektrometri har muliggjort mye dypere profilering av tiol redoksproteomet, noe som øker forståelsen av både årsak og virkning av proteintioloksidasjon27. Informasjonen fra stedsspesifikke kvantitative data muliggjør videre studier av mekanistiske virkninger og nedstrøms effekter av reversible oksidative modifikasjoner28. Bruk av denne arbeidsflyten har gitt innsikt i de fysiologiske effektene av reversibel cysteinoksidasjon med hensyn til normale fysiologiske hendelser som aldring, hvor nivåene av SSG var forskjellige med hensyn til alder. Aldringseffektene på SSG ble delvis reversert ved bruk av SS-31 (elamipretid), et nytt peptid som forbedrer mitokondriell funksjon og reduserer SSG-nivåer hos eldre mus, noe som får dem til å ha en SSG-profil som ligner mer på unge mus29.
Patofysiologiske forhold som tilskrives nanopartikkeleksponering har vist seg å involvere SSG i en musemakrofagmodell. Ved hjelp av RAC kombinert med massespektrometri viste forfatterne at SSG-nivåene var direkte korrelert med graden av oksidativt stress og nedsatt makrofagfagocytisk funksjon. Dataene avslørte også veispesifikke forskjeller i respons på forskjellige konstruerte nanomaterialer som induserer forskjellige grader av oksidativt stress30. Metoden har også bevist sin nytte i prokaryote arter, hvor den ble brukt til å studere effekten av daglige sykluser i fotosyntetiske cyanobakterier med hensyn til tioloksidasjon. Brede endringer i tioloksidasjon på tvers av flere viktige biologiske prosesser ble observert, inkludert elektrontransport, karbonfiksering og glykolyse. Videre, gjennom ortogonal validering, ble flere viktige funksjonelle steder bekreftet å bli modifisert, noe som tyder på regulatoriske roller av disse oksidative modifikasjonene6.
Her beskriver vi detaljene i en standardisert arbeidsflyt (figur 1), som demonstrerer nytten av RAC-tilnærmingen for anrikning av totale oksyderte cysteintioler av proteiner og deres påfølgende merking og støkiometriske kvantifisering. Denne arbeidsflyten er implementert i studier av redokstilstanden i forskjellige prøvetyper, inkludert cellekulturer27,30 og hele vev (f.eks. Skjelettmuskulatur, hjerte, lunge) 29,31,32,33. Selv om den ikke er inkludert her, er RAC-protokollen også lett tilpasset for undersøkelse av spesifikke former for reversible redoksmodifikasjoner, inkludert SSG, SNO og S-acylation, som tidligere nevnt25,29,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

Reversible oksidative modifikasjoner på proteintioler har nylig dukket opp som viktige mediatorer av cellulær funksjon. Her beskriver vi den detaljerte prosedyren for en kvantitativ redoks proteomikkmetode som benytter harpiksassistert fangst (RAC) i kombinasjon med tandemmassemerke (TMT) isobarisk merking og væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) for å tillate multiplekset stochiometrisk kvantifisering av oksyderte proteintioler på proteomnivå. Den stedsspesifikke kvantitative informasjonen om oksiderte cysteinrester gir ytterligere innsikt i de funksjonelle effektene av slike modifikasjoner. 
Arbeidsflyten kan tilpasses på tvers av mange prøvetyper, inkludert dyrkede celler (f.eks. pattedyr, prokaryote) og hele vev (f.eks. hjerte, lunge, muskel), som i utgangspunktet lyses / homogeniseres og med frie tioler som alkyleres for å forhindre kunstig oksidasjon. De oksyderte proteintiolene reduseres og fanges deretter opp av en tiol-affinitetsharpiks, som effektiviserer og forenkler arbeidsflyttrinnene ved å tillate at prosedyrene for fortsatt fordøyelse, merking og vasking utføres uten ytterligere overføring av proteiner / peptider. Til slutt blir de merkede peptidene eluert og analysert av LC-MS / MS for å avsløre omfattende støkiometriske endringer relatert til tioloksydasjon over hele proteomet. Denne metoden forbedrer i stor grad forståelsen av rollen som redoksavhengig regulering under fysiologiske og patofysiologiske tilstander relatert til proteintioloksidasjon.

Fullføring av protokollen vil resultere i svært spesifikk anrikning av tidligere oksiderte cysteinholdige peptider, ofte med >95% spesifisitet 27,35,36. Imidlertid krever flere viktige trinn i protokollen spesiell oppmerksomhet, for eksempel den første blokkeringen av frie tioler før prøvelyse / homogenisering, som forbyr kunstig oksidasjon og ikke-spesifikk anrikning av kunstig oksyderte tioler25. P...

Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Proteintioloksidasjon har betydelige implikasjoner under normale fysiologiske og patofysiologiske forhold. Vi beskriver detaljene i en kvantitativ redoks proteomikkmetode, som benytter harpiksassistert fangst, isobarisk merking og massespektrometri, noe som muliggjør stedsspesifikk identifisering og kvantifisering av reversibelt oksyderte cysteinrester av proteiner.

Harpiksassistert fangst kombinert med isobarisk tandemmassemerkemerking for multiplekset kvantifisering av proteintioloksidasjon

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Denne protokollen beskriver en metode som muliggjør stedsspesifikk identifisering av oksiderte cystinrester av proteiner. Metoden tillater kvantitative og stedsspesifikke data av oksyderte cystinrester som skal genereres fra ulike prøvetyper. For å starte den assisterte fangstprosedyren, vask de utfelte proteinpellets to ganger med aceton ved sentrifuging ved 20.500 G, i fire grader Celsius i 10 minutter.Dekanter deretter acetonen og fjern gjenværende aceton med en mikropipette. Ved hjelp av en glass serologisk pipette legg til tre milliliter fersk iskald aceton til røret og bland godt ved å invertere røret flere ganger. Etter den andre vasken, la pellets lufttørke i ett til to minutter uten å la dem tørke over.Tilsett en milliliter buffer B til den tørkede proteinpelleten. For å oppløse proteinet, sonikere pelleten gjentatte ganger i en badsoniker med en effekt på 250 watt i 15 til 30 sekunder om gangen, sammen med kort vortexing. Utfør Bicinchoninic acid eller BCA analysen for å måle proteinkonsentrasjonen.For å standardisere proteinkonsentrasjonene, overfør 500 mikrogram proteinprøve til et 0,5 milliliter, 10 kilodaltons sentrifugalfilter, og volum opp prøven til 500 mikroliter med resuspenderingsbuffer. Sentrifuger proteinbufferblandingen ved 14.000 G i romtemperatur, til volumet i sentrifugalfilteret er mindre enn 100 mikroliter. Samle prøven ved å invertere filteret i et oppsamlingsrør.Sentrifuger prøven ved 1000 G i to minutter og tilsett buffer C for å få et endelig volum på 500 mikroliter. For å redusere proteintiolene, tilsett 20 mikroliter 500 millimolar dithiothreitol eller DTT, til prøven for å få en endelig konsentrasjon på 20 millimolar, og inkuber prøvene i 30 minutter ved 37 grader Celsius med risting ved 850 RPM. Etter reduksjon, sentrifuge til prøvene i 0, 5 milliliter 10 kilodalton sentrifugalfiltre ved 14.000 G ved romtemperatur, til volumet i sentrifugalfilteret er mindre enn 100 mikroliter.Legg til buffer D for å gjøre opp volumet til 500 mikroliter og gjenta sentrifugering. Etter den fjerde sentrifugeringen samler du prøvene ved å invertere filteret i et oppsamlingsrør for å sentrifugere ved 1000 G i to minutter. Mål deretter proteinkonsentrasjonen ved hjelp av BCA-analysen.Deretter plasserer du spinnkolonnene på en vakuummanifold, og ved hjelp av en mikropipette overfører du 500 mikroliter av den nytilberedte tiolaffinitetsharpikslurryen til hver kolonne. Påfør vakuum for fjerning av vann. Gjenta prosedyren en gang for å oppnå 30 milligram harpiks per kolonne.Vask harpiksen fem ganger med 500 mikroliter ultrarent vann, ved å påføre vakuum for å fjerne vannet og deretter fem ganger med 500 mikroliter buffer E.In et nytt rør, tilsett buffer C til 150 mikrogram av den reduserte proteinprøven til det endelige volumet er 120 mikroliter. Overfør proteinoppløsningen til en plugget spinnkolonne som inneholder harpiksen. Plasser hetten på kolonnen og inkuber i to timer ved romtemperatur med risting ved 850 o / min.Vask harpiksen som beskrevet i manuskriptet. Bytt ut pluggen. For å utføre tryptisk fordøyelse på harpiks, tilsett 120 mikroliter nytilberedt trypsinløsning til prøvene, og inkuber kolonnen over natten ved 37 grader Celsius, med risting ved 850 RPM.Neste dag, vask harpiksen flere ganger som beskrevet i manuskriptet og bytt ut pluggen. Ved hjelp av en mikropipette, tilsett 40 mikroliter 100 millimolar Triethylammonium bikarbonatbuffer til den vasket harpiksen. Tilsett deretter 70 mikroliter av det oppløste tandemmassemerket eller TMT-merkingsreagenset, og inkuber i en time ved romtemperatur med risting ved 850 o / min.Oppbevar eventuelt gjenværende TMT-reagens ved minus 80 grader Celsius. Vask harpiksen og sett på pluggen. Elute TMT-merkede peptider ved å tilsette 100 mikroliter 100 millimolær ammoniumbikarbonatbuffer ved pH 8,0, som inneholder 20 millimolar DTT, til kolonnen, og inkubere kolonnen på en termisk mikser ved romtemperatur i 30 minutter ved 850 o / min.Etter inkubasjon, utfør eluering ved å plassere kolonnen på en vakuummanifold, påføre vakuumet og eluere prøvene i et fem milliliter mikrosentrifugerør. Gjenta trinnet en gang, og tilsett deretter 100 mikroliter 80% acetonitril med 0,1% trifluoreddiksyre til kolonnen. Etter inkubering av kolonnen i 10 minutter ved romtemperatur, eluere prøven i samme fem milliliter sentrifugerør.Plasser de eluerte prøvene i en vakuumkonsentrator til de er tørre. Oppbevar deretter de tørre peptidene ved minus 80 grader Celsius til videre bruk. Den kvalitative analysen av peptidprøver fra RAW 264.7-celler ble utført med SDS-PAGE, hvor prøver ble sammenlignet ved å bestemme forskjellige oksidasjonsnivåer på grunn av behandlinger.De separerte proteinene ble deretter undersøkt av western blot for ytterligere å undersøke oksidasjonsnivåene av individuelle proteiner. Rapporterte ioneintensiteter av cystinholdige peptider ble analysert ved væskekromatografi tandem massespektrometri. Tioloksidasjonsstøkiometrien til iTRAQ, merket berikede og oksyderte peptider på individuelle cystinnivå, ble kvantifisert.Fjern forsiktig aceton uten å forstyrre proteinpelleten. Sørg for at proteinpelleten er fullstendig oppløselig og kvantifisert nøyaktig, og at harpiks er nøyaktig allokert til spinnkolonner. Pass på å resuspendere harpiks under vasketrinnene.Videre vurdering av berikede proteiner og peptider kan gjøres ved SDS-PAGE og farging, western blotting og massespektrometri.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Sample Multiplexing av vev ved hjelp Kombinert Precursor Isotop Merking og isobariske Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskjellige dimensjoner bruke automatisert krystallisering kombinert med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...