Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Partes del trabajo fueron apoyadas por las subvenciones de los NIH R01 DK122160, R01 HL139335 y U24 DK112349

Todos los procedimientos descritos en el protocolo relacionados con muestras/tejidos animales o humanos fueron aprobados y siguieron las directrices institucionales del comité de ética de investigación humana y animal.
1. Homogeneización/lisis de la muestra
<ol><li>Muestras de tejido congelado<ol><li>Picar tejido congelado (~ 30 mg) en un portaobjetos de microscopio de vidrio sobre hielo seco con una cuchilla de afeitar preenfriada y pinzas. Transfiera el tejido picado a un tubo de polie...

La captura asistida por resina se ha utilizado en una variedad de tipos de muestras y sistemas biológicos para la investigación de modificaciones oxidativas de residuos de cisteína25,29,30. Este método permite la evaluación de muestras en múltiples niveles y lecturas, incluyendo proteínas y péptidos utilizando SDS-PAGE y análisis de Western blot, así como sitios individuales de cisteína utilizando espectrometría de m...

En condiciones homeostáticas, las células generan especies reactivas de oxígeno, nitrógeno o azufre que ayudan a facilitar procesos, como el metabolismo y la señalización 1,2,3, extendiéndose tanto a procariotas como a eucariotas. Los niveles fisiológicos de estas especies reactivas son necesarios para la función celular adecuada, también conocida como "eustrés"1,4. Por el contrario, un aumento de oxidantes que conduce a un desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes puede causar estrés oxidativo, o "angustia"1, que conduce al daño celular. Los oxidantes transducen señales a las vías biológicas modificando diferentes biomoléculas, incluyendo proteínas, ADN, ARN y lípidos. En particular, los residuos de cisteína de las proteínas son sitios altamente reactivos propensos a la oxidación debido al grupo tiol en la cisteína, que es reactivo hacia diferentes tipos de oxidantes5. Esto da lugar a una amplia gama de modificaciones postraduccionales reversibles basadas en redox (PTM) para cisteína, incluyendo nitrosilación (SNO), glutationilación (SSG), sulfenilación (SOH), persulfuración (SSH), polisulfuración (SSnH), acilación y disulfuros. Las formas irreversibles de oxidación de cisteína incluyen sulfinilación (SO2H) y sulfonilación (SO3H).
Las modificaciones oxidativas reversibles de los residuos de cisteína pueden desempeñar funciones protectoras que impiden una mayor oxidación irreversible o servir como moléculas de señalización para las vías celulares aguas abajo 6,7. La reversibilidad de algunos PTM redox de tiol permite que los sitios de cisteína funcionen como "interruptores redox"8,9, en los que los cambios en el estado redox de estos sitios alteran la función de las proteínas para regular su papel en los procesos transitorios. Los efectos moduladores de los PTMs redox 10 se han observado en muchos aspectos de la función proteica11, incluyendo catálisis12, interacciones proteína-proteína 13, cambio de conformación 14, coordinación de iones metálicos 15 o unión de inhibidores farmacológicos 16. Además, los PTM redox están involucrados en sitios de cisteína de proteínas que regulan vías como la transcripción17, la traducción 18 o el metabolismo19. Dado el impacto que los PTM redox tienen en la función de las proteínas y los procesos biológicos, es importante cuantificar el grado de oxidación que sufre un sitio de cisteína en respuesta a una perturbación del estado redox.
La identificación de sitios de cisteína con estados redox alterados se centra en la comparación del estado de oxidación a nivel específico del sitio entre condiciones normales y perturbadas. Las mediciones de cambio de pliegue a menudo se utilizan para determinar qué sitios están alterados significativamente, ya que esto ayuda a los usuarios a interpretar qué sitios de cisteína pueden ser fisiológicamente significativos para el estudio. Alternativamente, las mediciones estequiométricas de la oxidación reversible del tiol a través de un tipo de muestra específico dan una imagen general del estado fisiológico con respecto a la oxidación celular, una medida importante que a menudo se pasa por alto y se infrautiliza. La estequiometría de modificación se basa en cuantificar el porcentaje de tiol modificado como relación con la proteína tiol total (modificada y no modificada)20,21. Como resultado, las mediciones estequiométricas ofrecen una medición más precisa que el cambio de pliegue, especialmente cuando se utiliza espectrometría de masas. La importancia del aumento en la oxidación se puede determinar más fácilmente mediante el uso de estequiometría para determinar la ocupación de PTM de un sitio particular de cisteína. Por ejemplo, un aumento de 3 veces en la oxidación del tiol podría resultar de una transición de tan solo 1% a 3% o tan grande como 30% a 90%. Un aumento de 3 veces en la oxidación para un sitio que está solo al 1% de ocupación puede tener poco impacto en la función de una proteína; Sin embargo, un aumento de 3 veces para un sitio con una ocupación del 30% en estado de reposo puede verse afectado de manera más sustancial. Las mediciones estequiométricas, cuando se realizan entre tioles oxidados totales y modificaciones oxidativas específicas, incluida la glutationilación de proteínas (SSG) y la nitrosilación (SNO), pueden revelar proporciones e información cuantitativa con respecto a tipos de modificación específicos.
Debido a que la oxidación reversible del tiol es típicamente una modificación postraduccional de baja abundancia, se han desarrollado múltiples enfoques para el enriquecimiento de proteínas que contienen estas modificaciones a partir de muestras biológicas. Un enfoque temprano ideado por Jaffrey y otros, llamado la técnica de cambio de biotina (BST)22, implica múltiples pasos en los que los tioles no modificados se bloquean a través de alquilación, los tioles modificados reversiblemente se reducen a tioles libres nacientes, los tioles libres nacientes se marcan con biotina y las proteínas marcadas se enriquecen con la tirada de afinidad de estreptavidina. Esta técnica se ha utilizado para perfilar SNO y SSG en muchos estudios y se puede adaptar para sondear otras formas de oxidación reversible de tiol23,24. Si bien BST se ha utilizado para investigar diferentes formas de oxidación reversible de tiol, una preocupación con este enfoque es que el enriquecimiento se ve afectado por la unión no específica de proteínas no biotiniladas a la estreptavidina. Un enfoque alternativo desarrollado en nuestro laboratorio, llamado captura asistida por resina (RAC)25,26 (Figura 1), evita el problema del enriquecimiento de grupos tiol a través del sistema biotina-estreptavidina.
Tras la reducción de los tioles oxidados reversiblemente, las proteínas con tioles libres nacientes se enriquecen con la resina de afinidad tiol, que captura covalentemente los grupos tiol libres, lo que permite un enriquecimiento más específico de proteínas que contienen cisteína que el BST. El acoplamiento de RAC con el poder de multiplexación de los recientes avances en el etiquetado isobárico y la espectrometría de masas crea un flujo de trabajo robusto y sensible para el enriquecimiento, identificación y cuantificación de residuos de cisteína oxidados reversiblemente a nivel de proteoma en todo el proteoma. Los avances recientes en espectrometría de masas han permitido un perfil mucho más profundo del proteoma redox de tiol, aumentando la comprensión tanto de la causa como del efecto de la oxidación de la proteína tiol27. La información obtenida de datos cuantitativos específicos del sitio permite estudios adicionales de los impactos mecanicistas y los efectos posteriores de las modificaciones oxidativas reversibles28. La utilización de este flujo de trabajo ha proporcionado información sobre los impactos fisiológicos de la oxidación reversible de cisteína con respecto a los eventos fisiológicos normales, como el envejecimiento, en los que los niveles de SSG diferían con respecto a la edad. Los efectos del envejecimiento sobre la SSG se revirtieron parcialmente utilizando SS-31 (elamipretide), un nuevo péptido que mejora la función mitocondrial y reduce los niveles de SSG en ratones envejecidos, lo que hace que tengan un perfil de SSG más similar al de los ratones jóvenes29.
Se ha demostrado que las condiciones fisiopatológicas atribuidas a la exposición a nanopartículas involucran SSG en un modelo de macrófagos de ratón. Usando RAC junto con espectrometría de masas, los autores mostraron que los niveles de SSG estaban directamente correlacionados con el grado de estrés oxidativo y el deterioro de la función fagocítica de los macrófagos. Los datos también revelaron diferencias específicas de la vía en respuesta a diferentes nanomateriales diseñados que inducen diferentes grados de estrés oxidativo30. El método también ha demostrado su utilidad en especies procariotas, donde se aplicó para estudiar los efectos de los ciclos diurnos en cianobacterias fotosintéticas con respecto a la oxidación del tiol. Se observaron amplios cambios en la oxidación del tiol en varios procesos biológicos clave, incluido el transporte de electrones, la fijación de carbono y la glucólisis. Además, a través de la validación ortogonal, se confirmó la modificación de varios sitios funcionales clave, lo que sugiere roles reguladores de estas modificaciones oxidativas6.
Aquí, describimos los detalles de un flujo de trabajo estandarizado (Figura 1), demostrando la utilidad del enfoque RAC para el enriquecimiento de tioles de cisteína oxidada total de proteínas y su posterior etiquetado y cuantificación estequiométrica. Este flujo de trabajo se ha implementado en estudios del estado redox en diferentes tipos de muestras, incluyendo cultivos celulares27,30 y tejidos enteros (por ejemplo, músculo esquelético, corazón, pulmón)29,31,32,33. Aunque no se incluye aquí, el protocolo RAC también se adapta fácilmente para la investigación de formas específicas de modificaciones redox reversibles, incluyendo SSG, SNO y S-acilación, como se mencionó anteriormente25,29,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

Las modificaciones oxidativas reversibles en los tioles proteicos han surgido recientemente como mediadores importantes de la función celular. Aquí describimos el procedimiento detallado de un método cuantitativo de proteómica redox que utiliza la captura asistida por resina (RAC) en combinación con el etiquetado isobárico de etiqueta de masa en tándem (TMT) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS) para permitir la cuantificación estoquiométrica multiplexada de tioles de proteínas oxidadas a nivel de proteoma. La información cuantitativa específica del sitio sobre residuos de cisteína oxidada proporciona información adicional sobre los impactos funcionales de tales modificaciones. 
El flujo de trabajo es adaptable a través de muchos tipos de muestras, incluidas las células cultivadas (por ejemplo, mamíferos, procariotas) y tejidos enteros (por ejemplo, corazón, pulmón, músculo), que inicialmente se lisan / homogeneizan y con tioles libres alquilados para evitar la oxidación artificial. Los tioles de proteínas oxidadas se reducen y capturan mediante una resina de afinidad por tiol, que agiliza y simplifica los pasos del flujo de trabajo al permitir que los procedimientos de digestión, etiquetado y lavado se realicen sin transferencia adicional de proteínas / péptidos. Finalmente, los péptidos marcados son eluyidos y analizados por LC-MS / MS para revelar cambios estequiométricos completos relacionados con la oxidación del tiol en todo el proteoma. Este método mejora en gran medida la comprensión del papel de la regulación dependiente de redox en estados fisiológicos y fisiopatológicos relacionados con la oxidación de proteínas tiol.

La finalización del protocolo resultará en un enriquecimiento altamente específico de péptidos que contienen cisteína previamente oxidados, a menudo con una especificidad del >95% 27,35,36. Sin embargo, varios pasos clave del protocolo requieren atención especial, por ejemplo, el bloqueo inicial de tioles libres antes de la lisis/homogeneización de la muestra, que prohíbe la oxidación artificial y el enriquecimiento no ...

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Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

La oxidación de la proteína tiol tiene implicaciones significativas en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas normales. Describimos los detalles de un método cuantitativo de proteómica redox, que utiliza captura asistida por resina, etiquetado isobárico y espectrometría de masas, lo que permite la identificación y cuantificación de proteínas de cisteína oxidadas reversibles.

Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Este protocolo describe un método que permite la identificación específica del sitio de residuos de cistina oxidada de proteínas. El método permite generar datos cuantitativos y específicos del sitio de residuos de cistina oxidada a partir de varios tipos de muestras. Para comenzar el procedimiento de captura asistida, lave los gránulos de proteína precipitada dos veces con acetona centrifugando a 20, 500 G, en cuatro grados centígrados durante 10 minutos.A continuación, decantar la acetona y retirar la acetona restante con una micropipeta. Usando una pipeta serológica de vidrio, agregue tres mililitros de acetona fresca helada al tubo y mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces. Después del segundo lavado, deje que los gránulos se sequen al aire durante uno o dos minutos sin dejar que se sequen demasiado.Agregue un mililitro de tampón B al pellet de proteína seca. Para solubilizar la proteína, sonicar el pellet repetidamente en un sonicador de baño con una salida de 250 vatios durante 15 a 30 segundos a la vez, junto con un breve vórtice. Realice el ensayo de ácido bicinchonínico o BCA para medir la concentración de proteína.Para estandarizar las concentraciones de proteína, transfiera 500 microgramos de muestra de proteína a un filtro centrífugo de 0,5 mililitros y 10 kilodaltons, y aumente el volumen de la muestra a 500 microlitros con tampón de resuspensión. Centrifugar la mezcla tampón de proteínas a 14, 000 G a temperatura ambiente, hasta que el volumen en el filtro centrífugo sea inferior a 100 microlitros. Recoja la muestra invirtiendo el filtro en un tubo de recolección.Centrifugar la muestra a 1000 G durante dos minutos y añadir tampón C para obtener un volumen final de 500 microlitros. Para reducir la proteína tioles, añadir 20 microlitros de 500 milimolares de ditiothreitol o DTT, a la muestra para obtener una concentración final de 20 milimolar, e incubar las muestras durante 30 minutos a 37 grados centígrados con agitación a 850 RPM. Después de la reducción, centrifugar a las muestras en filtros centrífugos de 0,5 mililitros y 10 kilodalton a 14, 000 G a temperatura ambiente, hasta que el volumen en el filtro centrífugo sea inferior a 100 microlitros.Agregue el tampón D para completar el volumen a 500 microlitros y repita la centrifugación. Después de la cuarta centrifugación, recoger las muestras invirtiendo el filtro en un tubo de recogida para centrifugar a 1000 G durante dos minutos. Luego mida la concentración de proteína usando el ensayo BCA.A continuación, coloque las columnas de centrifugado en un colector de vacío y, utilizando una micropipeta, transfiera 500 microlitros de la suspensión de resina de afinidad tiol recién preparada a cada columna. Aplicar vacío para la eliminación de agua. Repita el procedimiento una vez para obtener 30 miligramos de resina por columna.Lave la resina cinco veces con 500 microlitros de agua ultrapura, aplicando un vacío para eliminar el agua y luego cinco veces con 500 microlitros de tampón E.In un nuevo tubo, agregue tampón C a 150 microgramos de la muestra de proteína reducida hasta que el volumen final sea de 120 microlitros. Transfiera la solución de proteína a una columna de centrifugado tapada que contenga la resina. Coloque la tapa en la columna e incube durante dos horas a temperatura ambiente agitando a 850 rpm.Lave la resina como se describe en el manuscrito. Vuelva a colocar el enchufe. Para realizar la digestión tríptica sobre resina, agregue 120 microlitros de solución de tripsina recién preparada a las muestras e incube la columna durante la noche a 37 grados centígrados, con agitación a 850 RPM.Al día siguiente, lave la resina varias veces como se describe en el manuscrito y reemplace el tapón. Usando una micropipeta, agregue 40 microlitros de tampón de bicarbonato de trietilamonio 100 milimolar a la resina lavada. Luego agregue 70 microlitros de la etiqueta de masa en tándem disuelta o el reactivo de etiquetado TMT, e incube durante una hora a temperatura ambiente con agitación a 850 RPM.Guarde cualquier reactivo TMT restante a menos 80 grados centígrados. Lave la resina y vuelva a colocar el tapón. Eluya los péptidos marcados con TMT agregando 100 microlitros de tampón de bicarbonato de amonio de 100 milimolares a pH 8.0, que contiene 20 milimolares DTT, a la columna, e incubando la columna en un mezclador térmico a temperatura ambiente durante 30 minutos a 850 RPM.Después de la incubación, realice la elución colocando la columna en un colector de vacío, aplicando el vacío y eluyendo las muestras en un tubo de microcentrífuga de cinco mililitros. Repita el paso una vez, luego agregue 100 microlitros de 80% de acetonitrilo con 0.1% de ácido trifluoroacético a la columna. Después de incubar la columna durante 10 minutos a temperatura ambiente, eluya la muestra en el mismo tubo de centrífuga de cinco mililitros.Coloque las muestras eluyidas en un concentrador de vacío hasta que estén secas. Luego guarde los péptidos secos a menos 80 grados centígrados hasta que se sigan usando. El análisis cualitativo de muestras de péptidos de células RAW 264.7 se llevó a cabo con SDS-PAGE, donde las muestras se compararon determinando diferentes niveles de oxidación debido a los tratamientos.Las proteínas separadas fueron posteriormente probadas por Western blot para investigar más a fondo los niveles de oxidación de proteínas individuales. Las intensidades iónicas reportadas de péptidos que contienen cistina se analizaron mediante cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem. Se cuantificó la estequiometría de oxidación de tiol de iTRAQ, péptidos marcados enriquecidos y oxidados a niveles individuales del sitio de cistina.Retire con cuidado la acetona sin alterar el pellet de proteína. Asegúrese de que el pellet de proteína esté completamente solubilizado y cuantificado con precisión, y que la resina se asigne con precisión a las columnas de centrifugado. Asegúrese de resuspender la resina durante los pasos de lavado.Se puede realizar una evaluación adicional de proteínas y péptidos enriquecidos mediante SDS-PAGE y tinción, western blot y espectrometría de masas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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