Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Delar av arbetet stöddes av NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 och U24 DK112349

Alla förfaranden som beskrivs i protokollet relaterade till djur- eller humana prover / vävnader godkändes av och följde de institutionella riktlinjerna för etikkommittén för forskning på människor och djur.
1. Provhomogenisering/-lys
<ol><li>Frysta vävnadsprover<ol><li>Hacka fryst vävnad (~ 30 mg) på ett glasmikroskop som glider på torris med ett förkylt rakblad och pincett. Överför den malet vävnaden till ett förkylt 5 ml rundbottnat polystyrenrör som innehåller 700 μl...

Hartsassisterad fångst har använts i en mängd olika provtyper och biologiska system för undersökning av oxidativa modifieringar av cysteinrester25,29,30. Denna metod möjliggör utvärdering av prover på flera nivåer och avläsningar, inklusive proteiner och peptider med hjälp av SDS-PAGE och western blot-analys, såväl som enskilda cysteinställen med masspektrometri. Oavsett provtyp eller slutlig slutpunkt möjliggör...

Under homeostatiska förhållanden genererar celler reaktiva syre-, kväve- eller svavelarter som hjälper till att underlätta processer, såsom metabolism och signalering 1,2,3, som sträcker sig till både prokaryoter och eukaryoter. Fysiologiska nivåer av dessa reaktiva arter är nödvändiga för korrekt cellulär funktion, även känd som 'eustress'1,4. Däremot kan en ökning av oxidanter som leder till en obalans mellan oxidanter och antioxidanter orsaka oxidativ stress, eller "nöd"1, vilket leder till cellskador. Oxidanter omvandlar signaler till biologiska vägar genom att modifiera olika biomolekyler, inklusive protein, DNA, RNA och lipider. I synnerhet är cysteinrester av proteiner mycket reaktiva platser benägna att oxidera på grund av tiolgruppen på cystein, som är reaktiv mot olika typer av oxidanter5. Detta ger upphov till ett varierat utbud av reversibla redoxbaserade posttranslationella modifieringar (PTM) för cystein, inklusive nitrosylering (SNO), glutationylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidering (SSH), polysulfidering (SSnH), acylering och disulfider. Irreversibla former av cysteinoxidation innefattar sulfinylering (SO2H) och sulfonylering (SO3H).
Reversibla oxidativa modifieringar av cysteinrester kan tjäna skyddande roller som förhindrar ytterligare irreversibel oxidation eller fungera som signalmolekyler för nedströms cellulära vägar 6,7. Reversibiliteten hos vissa tiol redox PTM gör det möjligt för cysteinställen att fungera som "redoxomkopplare"8,9, varvid förändringar i redoxtillståndet på dessa platser förändrar proteinfunktionen för att reglera deras roll i övergående processer. De modulerande effekterna av redox PTM 10 har observerats i många aspekter av proteinfunktion 11, inklusive katalys 12, protein-proteininteraktioner 13, konformationsförändring 14, metalljonkoordinering15 eller farmakologisk inhibitorbindning 16. Dessutom är redox-PTM involverade i cysteinställen för proteiner som reglerar vägar såsom transkription 17, översättning18 eller metabolism19. Med tanke på den inverkan som redox PTM har på proteinfunktion och biologiska processer är det viktigt att kvantifiera omfattningen av oxidation som en cystein plats genomgår som svar på en störning av redoxtillståndet.
Identifieringen av cystein platser med förändrade redoxtillstånd är inriktad på jämförelsen av oxidationstillståndet på platsspecifik nivå mellan normala och störda förhållanden. Fold change mätningar används ofta för att avgöra vilka platser som är signifikant förändrade eftersom detta hjälper användare att tolka vilka cystein platser kan vara fysiologiskt betydelsefulla för studien. Alternativt ger stökiometriska mätningar av reversibel tioloxidation över en specifik provtyp en allmän bild av det fysiologiska tillståndet med avseende på cellulär oxidation, en viktig mätning som ofta förbises och underutnyttjas. Modifieringsstökiometri baseras på kvantifiering av procentandelen modifierad tiol som ett förhållande till totalt proteintiol (modifierat och omodifierat)20,21. Som ett resultat erbjuder stökiometriska mätningar en mer exakt mätning än vikförändring, särskilt vid användning av masspektrometri. Betydelsen av ökningen av oxidation kan lättare fastställas genom att använda stökiometri för att bestämma PTM-beläggningen för en viss cysteinplats. Till exempel kan en 3-faldig ökning av tioloxidation bero på en övergång på så lite som 1% till 3% eller så stor som 30% till 90%. En 3-faldig ökning av oxidationen för en plats som endast har 1% beläggning kan ha liten inverkan på ett proteins funktion; En 3-faldig ökning för en plats med 30% beläggning i viloläge kan dock påverkas mer väsentligt. Stökiometriska mätningar, när de utförs mellan totala oxiderade tioler och specifika oxidativa modifieringar, inklusive proteinglutationylering (SSG) och nitrosylering (SNO), kan avslöja förhållanden och kvantitativ information med avseende på specifika modifieringstyper.
Eftersom reversibel tioloxidation vanligtvis är en posttranslationell modifiering med låg överflöd, har flera metoder utvecklats för anrikning av proteiner som innehåller dessa modifieringar ur biologiska prover. Ett tidigt tillvägagångssätt som utarbetats av Jaffrey och andra, som heter biotinomkopplartekniken (BST)22, involverar flera steg där omodifierade tioler blockeras genom alkylering, reversibelt modifierade tioler reduceras till begynnande fria tioler, framväxande fria tioler är märkta med biotin och de märkta proteinerna berikas av streptavidinaffinitetsdragning. Denna teknik har använts för att profilera SNO och SSG i många studier och kan anpassas för att undersöka andra former av reversibel tioloxidation23,24. Medan BST har använts för att undersöka olika former av reversibel tioloxidation, är ett problem med detta tillvägagångssätt att anrikning påverkas av den icke-specifika bindningen av obiotinylerade proteiner till streptavidin. Ett alternativt tillvägagångssätt som utvecklats i vårt laboratorium, kallat hartsassisterad fångst (RAC)25,26 (figur 1), kringgår frågan om anrikning av tiolgrupper via biotin-streptavidinsystemet.
Efter minskningen av reversibelt oxiderade tioler berikas proteiner med begynnande fria tioler av tiolaffinitetshartset, som kovalent fångar fria tiolgrupper, vilket möjliggör mer specifik anrikning av cysteinhaltiga proteiner än BST. Att koppla RAC med multiplexeringskraften i de senaste framstegen inom isobarisk märkning och masspektrometri skapar ett robust och känsligt arbetsflöde för anrikning, identifiering och kvantifiering av reversibelt oxiderade cysteinrester på proteomomfattande nivå. De senaste framstegen inom masspektrometri har möjliggjort mycket djupare profilering av tiol redoxproteomet, vilket ökar förståelsen för både orsak och effekt av proteintioloxidation27. Den information som erhålls från platsspecifika kvantitativa data möjliggör ytterligare studier av de mekanistiska effekterna och nedströmseffekterna av reversibla oxidativa modifieringar28. Att använda detta arbetsflöde har gett insikt i de fysiologiska effekterna av reversibel cysteinoxidation med avseende på normala fysiologiska händelser som åldrande, där nivåerna av SSG skilde sig åt med avseende på ålder. Åldringseffekterna på SSG vändes delvis med hjälp av SS-31 (elamipretid), en ny peptid som förbättrar mitokondriell funktion och minskar SSG-nivåerna hos åldrade möss, vilket gör att de har en SSG-profil som mer liknar unga möss29.
Patofysiologiska tillstånd som tillskrivs nanopartikelexponering har visat sig involvera SSG i en musmakrofagmodell. Med hjälp av RAC i kombination med masspektrometri visade författarna att SSG-nivåerna var direkt korrelerade med graden av oxidativ stress och försämring av makrofagisk fagocytisk funktion. Data avslöjade också vägspecifika skillnader som svar på olika konstruerade nanomaterial som inducerar olika grader av oxidativ stress30. Metoden har också visat sin användbarhet hos prokaryota arter, där den tillämpades för att studera effekterna av dagliga cykler i fotosyntetiska cyanobakterier med avseende på tioloxidation. Breda förändringar i tioloxidation över flera viktiga biologiska processer observerades, inklusive elektrontransport, kolfixering och glykolys. Dessutom, genom ortogonal validering, bekräftades flera viktiga funktionella platser att modifieras, vilket tyder på reglerande roller för dessa oxidativa modifieringar6.
Häri beskriver vi detaljerna i ett standardiserat arbetsflöde (figur 1), som visar nyttan av RAC-metoden för anrikning av totala oxiderade cysteintioler av proteiner och deras efterföljande märkning och stökiometriska kvantifiering. Detta arbetsflöde har implementerats i studier av redoxtillståndet i olika provtyper, inklusive cellkulturer27,30 och hela vävnader (t.ex. skelettmuskulatur, hjärta, lunga)29,31,32,33. Även om det inte ingår här, är RAC-protokollet också lätt anpassat för undersökning av specifika former av reversibla redoxmodifieringar, inklusive SSG, SNO och S-acylation, som tidigare nämnts25,29,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

Reversibla oxidativa modifieringar på proteintioler har nyligen framträtt som viktiga mediatorer av cellulär funktion. Häri beskriver vi det detaljerade förfarandet för en kvantitativ redoxproteomikmetod som använder hartsassisterad infångning (RAC) i kombination med tandemmasstagg (TMT) isobarisk märkning och vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) för att möjliggöra multiplexerad stochiometrisk kvantifiering av oxiderade proteintioler på proteomnivå. Den platsspecifika kvantitativa informationen om oxiderade cysteinrester ger ytterligare inblick i de funktionella effekterna av sådana modifieringar. 
Arbetsflödet är anpassningsbart över många provtyper, inklusive odlade celler (t.ex. däggdjur, prokaryota) och hela vävnader (t.ex. hjärta, lunga, muskler), som initialt lyseras / homogeniseras och med fria tioler som alkyleras för att förhindra artificiell oxidation. De oxiderade proteintiolerna reduceras sedan och fångas upp av ett tiolaffinitetsharts, vilket effektiviserar och förenklar arbetsflödesstegen genom att tillåta att de fortsatta matsmältnings-, märknings- och tvättprocedurerna utförs utan ytterligare överföring av proteiner / peptider. Slutligen elueras och analyseras de märkta peptiderna av LC-MS / MS för att avslöja omfattande stökiometriska förändringar relaterade till tioloxidation över hela proteomet. Denna metod förbättrar avsevärt förståelsen för rollen av redoxberoende reglering under fysiologiska och patofysiologiska tillstånd relaterade till proteintioloxidation.

Slutförandet av protokollet kommer att resultera i mycket specifik anrikning av tidigare oxiderade cysteinhaltiga peptider, ofta med >95% specificitet 27,35,36. Flera viktiga steg i protokollet kräver emellertid särskild uppmärksamhet, t.ex. den initiala blockeringen av fria tioler före provlys/homogenisering, vilket förbjuder artificiell oxidation och icke-specifik anrikning av artificiellt oxiderade tioler<sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Proteintioloxidation har betydande konsekvenser under normala fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Vi beskriver detaljerna i en kvantitativ redoxproteomikmetod, som använder hartsassisterad infångning, isobarisk märkning och masspektrometri, vilket möjliggör platsspecifik identifiering och kvantifiering av reversibelt oxiderade cysteinrester av proteiner.

Hartsassisterad fångst i kombination med isobar tandemmassetikettmärkning för multiplexerad kvantifiering av proteintioloxidation

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Detta protokoll beskriver en metod som möjliggör platsspecifik identifiering av oxiderade cystinrester av proteiner. Metoden gör det möjligt att generera kvantitativa och platsspecifika data av oxiderade cystinrester från olika provtyper. För att påbörja det assisterade infångningsförfarandet, tvätta de utfällda proteinpelletsna två gånger med aceton genom att centrifugera vid 20 500 G, i fyra grader Celsius i 10 minuter.Dekantera sedan acetonen och ta bort den återstående acetonen med en mikropipett. Använd en serologisk glaspipett tillsätt tre milliliter färsk iskall aceton till röret och blanda väl genom att invertera röret flera gånger. Efter den andra tvätten, låt pelletsna lufttorka i en till två minuter utan att låta dem torka.Tillsätt en milliliter buffert B till den torkade proteinpelleten. För att solubilisera proteinet, sonikera pelleten upprepade gånger i en bad sonicator med en utgång på 250 watt för 15 till 30 sekunder åt gången, tillsammans med kort virvel. Utför Bicinchoninic acid eller BCA-analysen för att mäta proteinkoncentrationen.För att standardisera proteinkoncentrationerna, överför 500 mikrogram proteinprov till ett centrifugalfilter på 0,5 ml 10 kilodalton och volym upp provet till 500 mikroliter med resuspensionsbuffert. Centrifugera proteinbuffertblandningen vid 14 000 G i rumstemperatur tills volymen i centrifugalfiltret är mindre än 100 mikroliter. Samla provet genom att invertera filtret i ett uppsamlingsrör.Centrifugera provet vid 1000 G i två minuter och tillsätt buffert C för att få en slutlig volym på 500 mikroliter. För att minska proteintiolerna, tillsätt 20 mikroliter 500 millimolar ditiotreitol eller DTT till provet för att få en slutlig koncentration av 20 millimolar och inkubera proverna i 30 minuter vid 37 grader Celsius med skakning vid 850 rpm. Efter reduktion, centrifugera till proverna i 0,5 ml 10 kilodalton centrifugalfilter vid 14 000 G vid rumstemperatur tills volymen i centrifugalfiltret är mindre än 100 mikroliter.Tillsätt buffert D för att öka volymen till 500 mikroliter och upprepa centrifugeringen. Efter den fjärde centrifugeringen samlar du upp proverna genom att invertera filtret i ett uppsamlingsrör för att centrifugera vid 1000 G i två minuter. Mät sedan proteinkoncentrationen med hjälp av BCA-analysen.Placera sedan spinnkolonnerna på ett vakuumgrenrör och överför 500 mikroliter av den nyberedda tiolaffinitetsuppslamningen till varje kolonn med hjälp av en mikropipett. Applicera vakuum för avlägsnande av vatten. Upprepa proceduren en gång för att erhålla 30 milligram harts per kolonn.Tvätta hartset fem gånger med 500 mikroliter ultrarent vatten, genom att applicera ett vakuum för att avlägsna vattnet och sedan fem gånger med 500 mikroliter buffert E.In ett nytt rör, tillsätt buffert C till 150 mikrogram av det reducerade proteinprovet tills den slutliga volymen är 120 mikroliter. Överför proteinlösningen till en pluggad spinnkolonn som innehåller hartset. Placera locket på kolonnen och inkubera i två timmar vid rumstemperatur med skakning vid 850 rpm.Tvätta hartset enligt beskrivningen i manuskriptet. Sätt tillbaka kontakten. För att utföra på-hartstryptisk matsmältning, tillsätt 120 mikroliter nyberedd trypsinlösning till proverna och inkubera kolonnen över natten vid 37 grader Celsius, med skakning vid 850 rpm.Nästa dag, tvätta hartset flera gånger enligt beskrivningen i manuskriptet och sätt tillbaka kontakten. Använd en mikropipett och tillsätt 40 mikroliter 100 millimolar Triethylammonium-bikarbonatbuffert till det tvättade hartset. Tillsätt sedan 70 mikroliter av den upplösta tandemmasstaggen eller TMT-märkningsreagenset och inkubera i en timme vid rumstemperatur med skakning vid 850 rpm.Förvara eventuellt kvarvarande TMT-reagens vid minus 80 grader Celsius. Tvätta hartset och sätt tillbaka kontakten. Eluera de TMT-märkta peptiderna genom att tillsätta 100 mikroliter 100 millimolar ammoniumbikarbonatbuffert vid pH 8,0, innehållande 20 millimolar DTT, till kolonnen och inkubera kolonnen på en termisk mixer vid rumstemperatur i 30 minuter vid 850 rpm.Efter inkubation, utför eluering genom att placera kolonnen på ett vakuumgrenrör, applicera vakuumet och eluera proverna i ett fem milliliter mikrocentrifugrör. Upprepa steget en gång och tillsätt sedan 100 mikroliter 80% acetonitril med 0,1% trifluorättiksyra till kolonnen. Efter inkubering av kolonnen i 10 minuter vid rumstemperatur, eluera provet i samma fem milliliter centrifugrör.Placera de eluterade proverna i ett vakuumkoncentrator tills det är torrt. Förvara sedan de torra peptiderna vid minus 80 grader Celsius tills vidare användning. Den kvalitativa analysen av peptidprover från RAW 264.7-celler utfördes med SDS-PAGE, där prover jämfördes genom att bestämma olika nivåer av oxidation på grund av behandlingar.De separerade proteinerna undersöktes därefter av western blot för att ytterligare undersöka oxidationsnivåerna för enskilda proteiner. Rapporterade jonintensiteter av cystininnehållande peptider analyserades med vätskekromatografi tandemmasspektrometri. Tioloxidationsstökiometrin av iTRAQ, märkt berikade och oxiderade peptider vid individuella cystinnivånivåer kvantifierades.Ta försiktigt bort aceton utan att störa proteinpelleten. Se till att proteinpelleten är helt solubiliserad och kvantifierad exakt, och att hartset är korrekt allokerat till spinnkolonner. Var noga med att återsuspendera harts under tvättstegen.Ytterligare utvärdering av berikade proteiner och peptider kan utföras med SDS-PAGE och färgning, western blotting och masspektrometri.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Förbättrad Prov Multiplexing av vävnader med användning Kombinerade Prekursor isotopmärkning och Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem vätskekromatografi-masspektrometri baserad strategi för metabolit analys av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...