Name: resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Çalışmanın bazı bölümleri NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 ve U24 DK112349 tarafından desteklenmiştir.

Hayvan veya insan örnekleri/dokuları ile ilgili protokolde açıklanan tüm prosedürler, insan ve hayvan araştırmaları etik komitesinin kurumsal kılavuzları tarafından onaylanmış ve takip edilmiştir.
1. Numune homojenizasyonu/lizisi
<ol><li>Dondurulmuş doku örnekleri<ol><li>Bir cam mikroskop üzerinde dondurulmuş dokuyu (~ 30 mg) kıymak, önceden soğutulmuş bir tıraş bıçağı ve forseps kullanarak kuru buz üzerinde kaydırır. Kıyılmış dokuyu 700 μL tampon A içer...

Reçine destekli yakalama, sistein kalıntılarının oksidatif modifikasyonlarının araştırılması için çeşitli numune tiplerinde ve biyolojik sistemlerde kullanılmıştır25,29,30. Bu yöntem, SDS-PAGE ve batı leke analizi kullanılarak proteinler ve peptitler ve ayrıca kütle spektrometrisi kullanılarak bireysel sistein bölgeleri de dahil olmak üzere çoklu seviyelerde ve okumalarda numunelerin değerlendirilmesi...

Homeostatik koşullar altında, hücreler hem prokaryotlara hem de ökaryotlara uzanan metabolizma ve sinyal 1,2,3 gibi süreçleri kolaylaştırmaya yardımcı olan reaktif oksijen, azot veya kükürt türleri üretir. Bu reaktif türlerin fizyolojik seviyeleri, 'eustress' olarak da bilinen düzgün hücresel fonksiyon için gereklidir1,4. Buna karşılık, oksidanlarda oksidanlar ve antioksidanlar arasında dengesizliğe yol açan bir artış, oksidatif strese veya hücresel hasara yol açan "sıkıntıya" neden olabilir1. Oksidanlar, protein, DNA, RNA ve lipitler dahil olmak üzere farklı biyomolekülleri değiştirerek sinyalleri biyolojik yollara dönüştürür. Özellikle, proteinlerin sistein kalıntıları, farklı oksidan türlerine karşı reaktif olan sistein üzerindeki tiol grubu nedeniyle oksidasyona eğilimli oldukça reaktif bölgelerdir5. Bu, nitrosilasyon (SNO), glutatyonilasyon (SSG), sülfenilasyon (SOH), persülfidasyon (SSH), polisülfidasyon (SSnH), asilasyon ve disülfidler dahil olmak üzere sistein için çeşitli geri dönüşümlü redoks bazlı posttranslasyonel modifikasyonlara (PTM'ler) yol açar. Sistein oksidasyonunun geri dönüşümsüz formları arasında sülfinilasyon (S02H) ve sülfonilasyon (S3H) bulunur.
Sistein kalıntılarının geri dönüşümlü oksidatif modifikasyonları, daha fazla geri dönüşümsüz oksidasyonu önleyen koruyucu rollere hizmet edebilir veya aşağı akış hücresel yolları için sinyal molekülleri olarak işlev görebilir 6,7. Bazı tiol redoks PTM'lerinin geri dönüşümlülüğü, sistein bölgelerinin "redoks anahtarları" olarak işlev görmesine izin verir8,9, burada bu bölgelerin redoks durumundaki değişiklikler, geçici süreçlerdeki rollerini düzenlemek için protein fonksiyonunu değiştirir. Redoks PTM'lerin10'un modülatör etkileri, kataliz 12, protein-protein etkileşimleri 13, konformasyon değişikliği 14, metal iyonu koordinasyonu 15 veya farmakolojik inhibitör bağlama 16 dahil olmak üzere protein fonksiyonu 11'in birçok alanında gözlenmiştir. Ek olarak, redoks PTM'ler, transkripsiyon17, translasyon18 veya metabolizma19 gibi yolları düzenleyen proteinlerin sistein bölgelerinde rol oynar. Redoks PTM'lerinin protein fonksiyonu ve biyolojik süreçler üzerindeki etkisi göz önüne alındığında, redoks durumunun bozulmasına yanıt olarak bir sistein bölgesinin maruz kaldığı oksidasyonun derecesini ölçmek önemlidir.
Değişmiş redoks durumlarına sahip sistein bölgelerinin tanımlanması, normal ve bozulmuş koşullar arasında bölgeye özgü düzeyde oksidasyon durumunun karşılaştırılmasına odaklanmıştır. Katlama değişimi ölçümleri genellikle hangi bölgelerin önemli ölçüde değiştirildiğini belirlemek için kullanılır, çünkü bu, kullanıcıların hangi sistein bölgelerinin çalışma için fizyolojik olarak önemli olabileceğini yorumlamalarına yardımcı olur. Alternatif olarak, belirli bir numune tipi boyunca geri dönüşümlü tiol oksidasyonunun stokiyometrik ölçümleri, hücresel oksidasyona ilişkin fizyolojik durumun genel bir resmini verir, bu da genellikle göz ardı edilen ve az kullanılan önemli bir ölçümdür. Modifikasyon stokiyometrisi, modifiye tiyolün yüzdesinin toplam protein tiol (modifiye edilmiş ve değiştirilmemiş) 20,21'e oranı olarak ölçülmesine dayanır. Sonuç olarak, stokiyometrik ölçümler, özellikle kütle spektrometrisi kullanıldığında, kıvrım değişiminden daha hassas bir ölçüm sunar. Oksidasyondaki artışın önemi, belirli bir sistein bölgesinin PTM doluluğunu belirlemek için stokiyometri kullanılarak daha kolay tespit edilebilir. Örneğin, tiol oksidasyonunda 3 kat artış,% 1 ila% 3 kadar küçük veya% 30 ila% 90 kadar büyük bir geçişten kaynaklanabilir. Sadece% 1 dolulukta olan bir bölge için oksidasyonda 3 kat artış, bir proteinin işlevi üzerinde çok az etkiye sahip olabilir; ancak, dinlenme durumunda% 30 doluluğa sahip bir site için 3 kat artış daha önemli ölçüde etkilenebilir. Stokiyometrik ölçümler, toplam oksitlenmiş tioller ile protein glutatyonilasyonu (SSG) ve nitrosilasyon (SNO) dahil olmak üzere spesifik oksidatif modifikasyonlar arasında yapıldığında, spesifik modifikasyon tiplerine göre oranları ve nicel bilgileri ortaya çıkarabilir.
Geri dönüşümlü tiol oksidasyonu tipik olarak düşük bollukta bir posttranslasyonel modifikasyon olduğundan, bu modifikasyonları içeren proteinlerin biyolojik örneklerden zenginleştirilmesi için çoklu yaklaşımlar geliştirilmiştir. Jaffrey ve diğerleri tarafından geliştirilen ve biyotin anahtar tekniği (BST)22 olarak adlandırılan erken bir yaklaşım, modifiye edilmemiş tiyollerin alkilasyon yoluyla bloke edildiği, geri dönüşümlü olarak modifiye edilmiş tiollerin yeni ortaya çıkan serbest tiollere indirgendiği, yeni ortaya çıkan serbest tiollerin biyotin ile etiketlendiği ve etiketli proteinlerin streptavidin afinitesi pulldown ile zenginleştirildiği birçok adımı içerir. Bu teknik, birçok çalışmada SNO ve SSG'nin profilini çıkarmak için kullanılmıştır ve diğer geri dönüşümlü tiol oksidasyon formları için prob 23,24'e uyarlanabilir. BST, farklı tersinir tiol oksidasyon formlarını araştırmak için kullanılmış olsa da, bu yaklaşımla ilgili bir endişe, zenginleştirmenin, biyotinillenmemiş proteinlerin streptavidin'e spesifik olmayan bağlanmasından etkilenmesidir. Laboratuvarımızda geliştirilen reçine destekli yakalama (RAC)25,26 (Şekil 1) adlı alternatif bir yaklaşım, biyotin-streptavidin sistemi aracılığıyla tiol gruplarının zenginleştirilmesi sorununu aşmaktadır.
Geri dönüşümlü olarak oksitlenmiş tiyollerin indirgenmesini takiben, yeni ortaya çıkan serbest tiollere sahip proteinler, serbest tiol gruplarını kovalent olarak yakalayan ve sistein içeren proteinlerin BST'den daha spesifik zenginleşmesine izin veren tiol-afinite reçinesi ile zenginleştirilir. RAC'yi izobarik etiketleme ve kütle spektrometresindeki son gelişmelerin çoklama gücü ile birleştirmek, proteom çapında geri dönüşümlü olarak oksitlenmiş sistein kalıntılarının zenginleştirilmesi, tanımlanması ve nicelleştirilmesi için sağlam ve hassas bir iş akışı yaratır. Kütle spektrometresindeki son gelişmeler, tiol redoks proteomunun çok daha derin profillenmesini sağlayarak protein tiol oksidasyonunun hem nedeninin hem de etkisinin anlaşılmasını sağlamıştır27. Sahaya özgü nicel verilerden elde edilen bilgiler, geri dönüşümlü oksidatif modifikasyonların mekanik etkileri ve aşağı yönlü etkileri hakkında daha fazla çalışmaya izin verir28. Bu iş akışının kullanılması, SSG seviyelerinin yaşa göre farklılık gösterdiği yaşlanma gibi normal fizyolojik olaylarla ilgili olarak geri dönüşümlü sistein oksidasyonunun fizyolojik etkileri hakkında fikir vermiştir. SSG üzerindeki yaşlanma etkileri, mitokondriyal fonksiyonu artıran ve yaşlı farelerde SSG seviyelerini azaltan ve genç farelere daha benzer bir SSG profiline sahip olmalarına neden olan yeni bir peptid olan SS-31 (elamipretid) kullanılarak kısmen tersine çevrildi29.
Nanopartikül maruziyetine atfedilen patofizyolojik koşulların, bir fare makrofaj modelinde SSG'yi içerdiği gösterilmiştir. Kütle spektrometrisi ile birlikte RAC kullanarak, yazarlar SSG seviyelerinin oksidatif stres derecesi ve makrofaj fagositik fonksiyonunun bozulması ile doğrudan ilişkili olduğunu göstermiştir. Veriler ayrıca, farklı derecelerde oksidatif strese neden olan farklı mühendislik nanomalzemelerine yanıt olarak yola özgü farklılıkları da ortaya koydu30. Yöntem ayrıca, fotosentetik siyanobakterilerdeki günlük döngülerin tiol oksidasyonuna ilişkin etkilerini incelemek için uygulandığı prokaryotik türlerde de faydasını kanıtlamıştır. Elektron taşınması, karbon fiksasyonu ve glikoliz dahil olmak üzere çeşitli önemli biyolojik işlemlerde tiol oksidasyonunda geniş değişiklikler gözlenmiştir. Ayrıca, ortogonal validasyon yoluyla, bu oksidatif modifikasyonların düzenleyici rollerini düşündüren birkaç önemli fonksiyonel bölgenin modifiye edildiği doğrulanmıştır6.
Burada, proteinlerin toplam oksitlenmiş sistein tiyollerinin zenginleştirilmesi ve bunların sonraki etiketlemesi ve stokiyometrik nicelleştirilmesi için RAC yaklaşımının faydasını gösteren standartlaştırılmış bir iş akışının ayrıntılarını açıklıyoruz (Şekil 1). Bu iş akışı, hücre kültürleri27,30 ve tüm dokular (örneğin, iskelet kası, kalp, akciğer) 29,31,32,33 dahil olmak üzere farklı örnek tiplerinde redoks durumu çalışmalarında uygulanmıştır. Buraya dahil edilmemiş olsa da, RAC protokolü, daha önce de belirtildiği gibi SSG, SNO ve S-asilasyonu dahil olmak üzere geri dönüşümlü redoks modifikasyonlarının spesifik formlarının araştırılması için kolayca uyarlanmıştır 25,29,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-101794</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.0 mL round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Thiol&#8211;Sepharose&#160;4B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8512</td>
			<td>Potential replacement for thiol-affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonicic acid (BCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein Assay Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>985370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetimide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-0906-01</td>
			<td>Reagent for in-house resin synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strata C18-E reverse phase columns</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>8B-S001-DAK</td>
			<td>Peptide desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopropyl Sepharose 6B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0420-01</td>
			<td>Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT isobaric labels (16 plex)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A44522</td>
			<td>Peptide labeling reagent; available in multiple formats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus speedvac</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resin-assisted capture coupled with isobaric tandem mass tag labeling for multiplexed quantification of protein thiol oxidation

Protein tiolleri üzerindeki geri dönüşümlü oksidatif modifikasyonlar son zamanlarda hücresel fonksiyonun önemli aracıları olarak ortaya çıkmıştır. Burada, proteom seviyesinde oksitlenmiş protein tiyollerinin çoklanmış stokiyometrik nicelleştirilmesine izin vermek için tandem kütle etiketi (TMT) izobarik etiketleme ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) ile birlikte reçine destekli yakalama (RAC) kullanan kantitatif bir redoks proteomik yönteminin ayrıntılı prosedürünü açıklamaktayız. Oksitlenmiş sistein kalıntıları hakkındaki bölgeye özgü kantitatif bilgiler, bu tür modifikasyonların fonksiyonel etkileri hakkında ek bilgi sağlar. 
İş akışı, kültürlenmiş hücreler (örneğin, memeli, prokaryotik) ve başlangıçta lize edilen / homojenize edilen ve yapay oksidasyonu önlemek için alkillenen serbest tiollerle birlikte tüm dokular (örneğin, kalp, akciğer, kas) dahil olmak üzere birçok numune türüne uyarlanabilir. Oksitlenmiş protein tiolleri daha sonra indirgenir ve bir tiol-afinite reçinesi tarafından yakalanır, bu da devam eden sindirim, etiketleme ve yıkama prosedürlerinin ek protein / peptit transferi olmadan gerçekleştirilmesine izin vererek iş akışı adımlarını kolaylaştırır ve basitleştirir. Son olarak, etiketli peptitler, tüm proteom boyunca tiol oksidasyonu ile ilgili kapsamlı stokiyometrik değişiklikleri ortaya çıkarmak için LC-MS / MS tarafından salınır ve analiz edilir. Bu yöntem, protein tiol oksidasyonu ile ilgili fizyolojik ve patofizyolojik durumlar altında redoksa bağımlı regülasyonun rolünün anlaşılmasını büyük ölçüde geliştirir.

Protokolün tamamlanması, daha önce oksitlenmiş sistein içeren peptitlerin, genellikle% >95 özgüllük 27,35,36 ile oldukça spesifik zenginleşmesine neden olacaktır. Bununla birlikte, protokolün birkaç önemli adımı özel dikkat gerektirir, örneğin, yapay oksidasyonu ve yapay olarak oksitlenmiş tiyollerin spesifik olmayan zenginleşmesini yasaklayan numune lizisi/homojenizasyonundan önce serbest tiollerin ilk blo...

Watch this Scientific Journal Video about Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation at JoVE.com

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Protein tiol oksidasyonunun normal fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında önemli etkileri vardır. Reçine destekli yakalama, izobarik etiketleme ve kütle spektrometrisini kullanan, proteinlerin geri dönüşümlü olarak oksitlenmiş sistein kalıntılarının bölgeye özgü tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan kantitatif bir redoks proteomik yönteminin ayrıntılarını açıklıyoruz.

Reçine Destekli Yakalama, Protein Thiol Oksidasyonunun Çoklanmış Niceliği için İzobarik Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Birleştirildiğinde

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Bu protokol, proteinlerin oksitlenmiş sistin kalıntılarının bölgeye özgü olarak tanımlanmasını sağlayan bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, oksitlenmiş sistin kalıntılarının kantitatif ve bölgeye özgü verilerinin çeşitli numune tiplerinden üretilmesini sağlar. Yardımlı yakalama prosedürüne başlamak için, çökeltilmiş protein peletlerini 10 dakika boyunca dört santigrat derece içinde 20.500 G'de santrifüj yaparak asetonla iki kez yıkayın.Daha sonra asetonu boşaltın ve kalan asetonu bir mikro pipetle çıkarın. Bir cam serolojik pipet kullanarak tüpe üç mililitre taze buz gibi soğuk aseton ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. İkinci yıkamadan sonra, peletlerin kurumasına izin vermeden bir ila iki dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin.Kurutulmuş protein peletine bir mililitre tampon B ekleyin. Proteini çözündürmek için, peleti bir seferde 15 ila 30 saniye boyunca 250 watt'lık bir çıkışa sahip bir banyo sonikatöründe tekrar tekrar sonikleştirin, kısa girdapla birlikte. Protein konsantrasyonunu ölçmek için Bicinchoninic asit veya BCA testini yapın.Protein konsantrasyonlarını standartlaştırmak için, 500 mikrogram protein örneğini 0,5 mililitre, 10 kilodalton santrifüj filtreye aktarın ve numuneyi ressüspansiyon tamponu ile 500 mikrolitreye çıkarın. Protein tampon karışımını, santrifüj filtredeki hacim 100 mikrolitreden az olana kadar oda sıcaklığında 14.000 G'de santrifüj yapın. Bir toplama tüpündeki filtreyi ters çevirerek numuneyi toplayın.Numuneyi iki dakika boyunca 1000 G'de santrifüj edin ve 500 mikrolitrelik son bir hacim elde etmek için C tamponunu ekleyin. Protein tiollerini azaltmak için, 20 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için numuneye 20 mikrolitre 500 milimolar dithiothreitol veya DTT ekleyin ve numuneleri 850 RPM'de sallayarak 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İndirgemeden sonra, santrifüj filtresindeki hacim 100 mikrolitreden az olana kadar, numunelere oda sıcaklığında 14.000 G'de 0,5 mililitre 10 kilodalton santrifüj filtrelere santrifüj yapın.Hacmi 500 mikrolitreye çıkarmak için tampon D ekleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Dördüncü santrifüjlemeden sonra, iki dakika boyunca 1000 G'de santrifüj yapmak için filtreyi bir toplama tüpünde ters çevirerek numuneleri toplayın. Daha sonra BCA testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.Daha sonra, sıkma kolonlarını bir vakum manifolduna yerleştirin ve bir mikro pipet kullanarak, taze hazırlanmış tiol afiniteli reçine bulamacının 500 mikrolitresini her bir kolona aktarın. Suyun uzaklaştırılması için vakum uygulayın. Sütun başına 30 miligram reçine elde etmek için prosedürü bir kez tekrarlayın.Reçineyi beş kez 500 mikrolitre ultra saf su ile yıkayın, suyu çıkarmak için bir vakum uygulayarak ve daha sonra yeni bir tüp E.In 500 mikrolitre tamponla beş kez yıkayın, son hacim 120 mikrolitre olana kadar indirgenmiş protein numunesinin 150 mikrogramına C tamponu ekleyin. Protein çözeltisini, reçineyi içeren tıkanmış bir spin kolonuna aktarın. Kapağı kolona yerleştirin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca 850 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.Reçineyi makalede açıklandığı gibi yıkayın. Fişi değiştirin. Reçine üzerinde triptik sindirim gerçekleştirmek için, numunelere 120 mikrolitre taze hazırlanmış tripsin çözeltisi ekleyin ve kolonu gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, 850 RPM'de çalkalayın.Ertesi gün, reçineyi makalede açıklandığı gibi birkaç kez yıkayın ve fişi değiştirin. Bir mikro pipet kullanarak, yıkanmış reçineye 40 mikrolitre 100 milimolar Trietilammonyum bikarbonat tamponu ekleyin. Daha sonra 70 mikrolitre çözünmüş tandem kütle etiketi veya TMT etiketleme reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 850 RPM'de çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin.Kalan TMT reaktifini eksi 80 santigrat derecede saklayın. Reçineyi yıkayın ve fişi değiştirin. TMT etiketli peptitleri, pH 8.0'da 20 milimolar DTT içeren pH 8.0'da 100 mikrolitre 100 milimolar amonyum bikarbonat tamponu ekleyerek ve kolonu oda sıcaklığında bir termal karıştırıcı üzerinde 850 RPM'de 30 dakika boyunca inkübe ederek etkisiz hale getirin.Kuluçkadan sonra, sütunu bir vakum manifolduna yerleştirerek, vakumu uygulayarak ve numuneleri beş mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne boşaltarak elüsyon gerçekleştirin. Adımı bir kez tekrarlayın, ardından kolona% 0.1 trifloroasetik asit ile% 80 asetonitril 100 mikrolitre ekleyin. Kolonu oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, numuneyi aynı beş mililitrelik santrifüj tüpünde süzün.Salınan numuneleri kuruyana kadar bir vakum yoğunlaştırıcısına yerleştirin. Daha sonra kuru peptitleri daha fazla kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. RAW 264.7 hücrelerinden alınan peptit örneklerinin kalitatif analizi, SDS-PAGE ile gerçekleştirilmiştir, burada örnekler, tedavilere bağlı farklı oksidasyon seviyeleri belirlenerek karşılaştırılmıştır.Ayrılan proteinler daha sonra, bireysel proteinlerin oksidasyon seviyelerini daha fazla araştırmak için batı lekesi tarafından araştırıldı. Sistin içeren peptitlerin bildirilen iyon yoğunlukları sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi ile analiz edildi. Bireysel sistin bölgesi seviyelerinde zenginleştirilmiş ve oksitlenmiş peptitler olarak etiketlenmiş iTRAQ'ın tiol oksidasyon stokiyometrisi ölçüldü.Protein peletini rahatsız etmeden asetonu dikkatlice çıkarın. Protein peletinin tamamen çözünür hale getirildiğinden ve hassas bir şekilde nicelleştirildiğinden ve reçinenin spin kolonlarına doğru bir şekilde tahsis edildiğinden emin olun. Yıkama adımları sırasında reçineyi yeniden askıya aldığınızdan emin olun.Zenginleştirilmiş proteinlerin ve peptitlerin daha ileri değerlendirilmesi SDS-PAGE ve boyama, batı lekelenmesi ve kütle spektrometrisi ile yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...