Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

لم يتلق المؤلفون أي تمويل لهذا العمل.

1. ثقافة pHCECs و iHCECs
<ol><li>قم بتنمية pHCECs و iHCECs في الوسط الظهاري العيني البشري (HOEM) مع المكملات التالية: 6 mM L-glutamine ، 0.002٪ مكمل وسائط الخلية O (جدول المواد) ، 1.0 ميكرومتر ادرينالين ، 0.4٪ مكمل وسائط الخلية P (جدول المواد) ، 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين rh ، 5 ميكروغرام / مل apo-transferrin ، و 100 ?...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

تم تقييم الاختلافات المحتملة في استخدام نوعين من HCECs. تم وضع الخلايا في نفس الوسط (HOEM) بتركيزات متطابقة من الخلايا ثم تعرضت لفترات قصيرة وطويلة من الأشعة فوق البنفسجية وثلاثة سموم عينية. تم اختيار جرعات من الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية بناء على آثارها الفسيولوجية ، والتي كانت ضا?...

يتم إجراء دراسات علم السموم في المختبر للتنبؤ بالآثار السامة للمواد الكيميائية والعوامل الأخرى التي يمكن أن تسبب تلفا للخلايا. في تقييم السمية للقرنية ، تم استخدام الخلايا الظهارية القرنية البشرية (HCECs) في نماذج لتقييم هذه التأثيرات1،2،3،4. تقوم هذه النماذج عادة بتقييم التأثيرات الفسيولوجية مثل التغيرات في النشاط الأيضي للخلية ، وتكاثر الخلايا ، ووظائف الخلية الأخرى مثل إنتاج وإطلاق السيتوكينات الالتهابية. بالنسبة لدراسات السموم هذه ، تم اختيار خلايا من مصادر مختلفة لتقييم الآثار الضارة للمواد الكيميائية والأشعة فوق البنفسجية على HCECs 2,3. تتوفر خطوط pHCEC من الشركات التي توفر هذه الخلايا من الأنسجة المانحة للبالغين. يمكن علاج الخلايا الأولية ب dispase وكشط القرنية بلطف للثقافة5. ثم يتم اختبار الخلايا بحثا عن الفيروسات والتلوث ثم يتم شحنها بالتبريد في 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
ميزة خطوط الخلايا الأولية هي أن الخلايا متطابقة وراثيا مع خلايا المتبرع. هذا مثالي ، حيث يجب أن يحاكي النموذج في المختبر الأنسجة في الجسم الحي قدر الإمكان. عيب خطوط الخلايا الأولية هو أن لديها عددا محدودا من انقسامات الخلايا أو الممرات6. يحد العدد المحدود من الخلايا المتاحة من عدد التجارب التي يمكن إجراؤها باستخدام ثقافة أولية واحدة ، مما يزيد من تكلفة التجارب.
كما تم استخدام خطوط الخلايا الخالدة في نماذج سمية زراعة الخلايا. ومع ذلك ، على عكس خط الخلية الأساسي الذي تم الحصول عليه من الأنسجة الحية ، فقد تم تغيير خط الخلية الخالد وراثيا. يتم إنشاء الخلايا الخالدة عن طريق دمج جينات الفيروس في الحمض النووي للخلايا الأولية6،7،8. يتم اختيار الخلايا ذات الدمج الجيني الفيروسي الناجح لخط الخلية الخالد. ميزة الخلود هي أنه يسمح بالانتشار السريع إلى أجل غير مسمى ، مما يوفر عددا غير محدود من الخلايا لإجراء تجارب متعددة باستخدام نفس خط الخلية. هذا يسمح بالاتساق بين التجارب ويقلل التكلفة.
بالإضافة إلى التغيرات في الجينات التي تحد من تكاثر الخلايا ، يمكن أن تحدث أيضا تغييرات في التعبير عن الجينات ذات الوظائف الحرجة9. لذلك ، فإن عيب استخدام الخلايا الخالدة هو أنها قد لا تمثل الخلايا الأصلية في الجسم الحي من حيث استجابتها للمحفزات الخارجية المختلفة10. تضمنت المقارنات مراقبة الآثار السامة للمواد الكيميائية على الخلايا القرنية البشرية الأولية والخالدة11 ، وكذلك HCECs الخالدة والخلايا الأولية الظهارية لقرنيةالأرانب 12. أظهرت المقارنة بين تأثيرات السموم على خلايا القرنية البشرية الأولية والخلايا القرنية الخالدة عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية11. باستخدام الطرق المفصلة في هذه المقالة ، سيتم تحديد فعالية هذه المقايسات لتقييم سمية الأشعة فوق البنفسجية والسموم العينية على pHCECs و iHCECs.
تم اختيار ثلاثة سموم عينية شائعة الاستخدام في المقايسات المختبرية: BAK و H2O2 و SDS. BAK هو مادة حافظة كاتيونية شائعة الاستخدام في محاليل العيون 13،14 ، H 2 O2يستخدم عادة لتطهير العدسات اللاصقة 15 ، و SDS هو خافض للتوتر السطحي أنيوني موجود في المنظفات والشامبو 14. على غرار السموم العينية ، يمكن أن تسبب الأشعة فوق البنفسجية أيضا أضرارا كبيرة ل HCECs3. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسبب التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية حالة عينية تعرف باسم التهاب القرنية الضوئي تتميز بأعراض التمزق والحساسية للضوء والشعور بالحصى16.
هناك عدد غير محدود من مزارع الخلايا الأولية التي يمكن استخدامها والعديد من خطوط الخلايا الخالدة التي تم تطويرها. لذلك ، تم إجراء تحقيق لمقارنة HCECs الأولية بخط HCEC الخالد لتحديد أوجه التشابه والاختلاف بين النماذج التي تتضمن هذه الأنواع من الخلايا.
استخدم هذا التحقيق الفحص المجهري لتقييم الاختلافات المحتملة بين pHCECs و iHCECs على الاستجابة الفسيولوجية للخلايا للأشعة فوق البنفسجية والسموم. كما تم تقييم آثار الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية على النشاط الأيضي للخلايا وإطلاق السيتوكين الالتهابي لخطي الخلية. تكمن أهمية تحديد الاختلافات بين خطي الخلية في فهم الاستخدام الأمثل لخطوط الخلايا هذه لتقييم: 1) تأثير الأشعة فوق البنفسجية على الخلايا ، 2) آثار السموم على الخلايا ، و 3) التغييرات الناتجة في التمثيل الغذائي ، وصلاحية الخلية ، وإطلاق السيتوكين الخلوي للدراسات المستقبلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

توضح هذه المقالة طرق قياس سمية الأشعة فوق البنفسجية (UV) والسموم العينية على مزارع الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية (pHCEC) والخالدة (iHCEC). تعرضت الخلايا للأشعة فوق البنفسجية والجرعات السامة من كلوريد البنزالكونيوم (BAK) وبيروكسيد الهيدروجين (H 2O2) وكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). تم قياس النشاط الأيضي باستخدام مقايسة التمثيل الغذائي. تم قياس إطلاق السيتوكينات الالتهابية باستخدام إنترلوكين متعدد الإرسال (IL) -1β و IL-6 و IL-8 ومقايسة عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، وتم تقييم الخلايا للتأكد من صلاحيتها باستخدام الأصباغ الفلورية.
حدثت الآثار الضارة للأشعة فوق البنفسجية على النشاط الأيضي للخلايا وإطلاق السيتوكين في 5 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية ل iHCEC و 20 دقيقة ل pHCEC. حدثت انخفاضات مماثلة في النسبة المئوية في النشاط الأيضي ل iHCEC و pHCEC بعد التعرض ل BAK أو H2O2 أو SDS ، وحدثت أهم التغييرات في إطلاق السيتوكين ل IL-6 و IL-8. أظهر الفحص المجهري للخلايا المعرضة ل iHCEC و pHCEC BAK الملطخة بالفلورسنت موت الخلايا عند التعرض بنسبة 0.005٪ ل BAK ، على الرغم من أن درجة تلطيخ الإيثيديوم كانت أكبر في iHCECs من pHCECs. باستخدام طرق متعددة لتقييم التأثيرات السامة باستخدام الفحص المجهري ، وتقييم النشاط الأيضي ، وإنتاج السيتوكين ، يمكن تحديد سمية الأشعة فوق البنفسجية والسموم الكيميائية لكل من خطوط الخلايا الأولية والخالدة.

حجم الخلية تم تصور HCECs الأولية والخالدة بثلاثة أصباغ فلورية ، والتي تعكس ثلاث مراحل مختلفة من صلاحية الخلية. الخلايا الحية خضراء (calcein-AM) ، والخلايا الميتة حمراء (ethidium homodimer-1) ، والخلايا المبرمج صفراء (لون ملحق V- مضبوط بالكمبيوتر لتصور أفضل للإشارة الفلورية). تحتوي الخلايا الحية ع?...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

توضح هذه المقالة الإجراءات المستخدمة لتقييم سمية الأشعة فوق البنفسجية والسموم الكيميائية على خط الخلية الأولية والخالدة.

تحديد سمية الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية على الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية والخالدة

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم سمية تركيبات منتجات العيون الجديدة في المختبر. من خلال تحسين تركيزات المواد الكيميائية وتركيبات المنتجات باستخدام خلايا العين في المختبر ، يمكن تقليل استخدام الحيوانات لتقييم سلامة المنتجات الجديدة. تقيم المقايسات في المختبر نقاط نهاية السمية التي لا يمكن تقييمها في الجسم الحي ، مثل تحديد تأثير مادة كيميائية على وظيفة الميتوكوندريا وسلامة غشاء الخلية ونشاط الإنزيم.تقييم سمية الخلايا في المختبر هو المفتاح لفهم الآليات المحتملة للسمية. هذا ضروري لتحديد جرعة قصوى مقبولة من المواد الكيميائية العلاجية في العين. سيوضح الإجراء نيجاني ناجارودوماران ، باحث من مختبر جونز.ابدأ بجلوس كل من pHCECs و iHCECs على أطباق بتري المطلية بالكولاجين مع انزلاقات الغطاء السفلي الزجاجي بتركيز 1 × 10 إلى 5 مع 1 ملليلتر من وسط ظهارة العين البشرية ، أو HOEM. تنمو pHCECs و iHCECs 1 مجموعة من الثقافات لمدة 24 ساعة ومجموعة أخرى لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، قم بتلطيخ الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول عازل تلطيخ الملحق يحتوي على 4 ميكرومولار كالسيين ، و 8 ميكرومولار إيثيديوم هوموديمر 1 ، وملحق 5 لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.بعد تلطيخ الخلايا ، اضبط مجهر المسح بالليزر متحد البؤر لالتقاط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث ، كما هو موضح في المخطوطة النصية. الحصول على الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد باتباع التعليمات الواردة في المخطوطة. قم بزرع الخلايا عند 5 × 10 إلى 4 لكل مليلتر من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مغلفة بالكولاجين 1 مكونة من 24 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 ساعات.بعد الحضانة ، قلل حجم الوسط في الآبار إلى 300 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بتعريض الخلايا لإشعاع UVA عند 6.48 واط لكل متر مربع ، وإشعاع UVB عند 1.82 واط لكل متر مربع عند 37 درجة مئوية لمدة 5 و 20 دقيقة في تجارب منفصلة. بعد الأشعة فوق البنفسجية ، أضف 200 ميكرولتر من HOEM الطازج إلى كل بئر واحتضانها لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في اليوم التالي ، اجمع طاف الخلية في كل بئر وانقله إلى أنابيب البولي بروبلين المعقمة سعة 2 ملليلتر. قم بتجميد المادة الطافية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتحديد مستويات السيتوكين التي تطلقها pHCECs و iHCECs بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، استخدم مقايسة السيتوكين المتعدد واتبع تعليمات المجموعة لتحديد كمية الإنترلوكين 6 والإنترلوكين 8 والإنترلوكين -1 بيتا و TNF-alpha.تحضير كاشف فحص التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ في DMEM و F12. استبدل وسط الاستزراع في كل بئر ب 1 ملليلتر من محلول الفحص الأيضي بنسبة 10٪ واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 4 ساعات. قم بقياس مضان كل محلول باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت عند إثارة 530 نانومتر وأطوال موجية انبعاث 590 نانومتر.خلايا البذور في 5 × 10 إلى الرابع لكل ملليلتر من HOEM في كل بئر من لوحة استزراع مطلية بالكولاجين 1 مكونة من 24 بئرا. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط وتعريض الخلايا ل 1 ملليلتر من السموم الكيميائية ، والتي تشمل 0.001٪ كلوريد البنزالكونيوم ، أو BAK ، و 0.01٪ بيروكسيد الهيدروجين ، و 0.0025٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم في برنامج تلفزيوني لمدة 5 و 15 دقيقة.بعد التعرض للسموم الكيميائية ، قم بإزالة السموم من الآبار ، واشطفها ب 1 ملليلتر من PBS ، وأضف 1 ملليلتر من HOEM إلى كل بئر. بعد 20 ساعة من الحضانة ، قم بإجراء فحص التمثيل الغذائي عن طريق استبدال الوسط ب 1 ملليلتر من محلول فحص التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ والحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 4 ساعات. قم بقياس مضان كل محلول باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت عند إثارة 530 نانومتر ، وأطوال موجية انبعاث 590 نانومتر.نقل طافات الخلايا من الآبار بعد الحضانة لمدة 20 ساعة إلى أنابيب البولي بروبلين المعقمة المنفصلة سعة 2 ملليلتر وتجميدها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. استخدم نفس منصة تعدد الإرسال المستخدمة لتقييم السيتوكينات من الخلايا المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية باتباع تعليمات المجموعة لتحديد كمية الإنترلوكين 6 والإنترلوكين 8 والإنترلوكين -1 بيتا و TNF-alpha. خلايا البذور عند 1 × 10 إلى 5 لكل مليلتر من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مطلية بالكولاجين 1 مكونة من 24 بئرا وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط وتعريض الخلايا ل 1 ملليلتر من السموم الكيميائية ، بما في ذلك 0.001٪ BAK و 0.005٪ BAK و 0.01٪ BAK في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. بعد التعرض ، قم بإزالة السموم الكيميائية ، وشطف الآبار مع 1 ملليلتر من PBS وإضافة 1 ملليلتر من HOEM إلى كل بئر. بعد 20 ساعة من الحضانة ، قم بتلطيخ الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول عازل تلطيخ الملحق يحتوي على الكالسيين والإيثيديوم هوموديمير والملحق 5 لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.اضبط المجهر لقياس الشدة عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث من 630 و 675 نانومتر للملحق 5 و 495 و 515 نانومتر للكالسيين AM ، و 528 و 617 نانومتر لتلطيخ الإيثيديوم 1. ثم الحصول على صور للخلايا باستخدام المجهر الفلوري. تم العثور على iHCECs لتكون خلايا صغيرة تتراوح من 10 إلى 20 ميكرومتر وكانت pHCECs في حدود 20 إلى 50 ميكرومتر بعد 24 ساعة من النمو.لوحظت اختلافات مماثلة في نطاق الحجم ل iHCECs و pHCECs بعد 48 ساعة من النمو. بالمقارنة مع الخلايا غير المعرضة للأشعة فوق البنفسجية ، انخفض النشاط الأيضي ل pHCECs المشععة بشكل كبير في 20 دقيقة من التعرض. بالنسبة ل iHCECs ، انخفض النشاط الأيضي للخلايا المشععة في كل من 5 و 20 دقيقة.لذلك ، استغرق الأمر وقتا أطول للتعرض لتقليل النشاط الأيضي ل pHCECs من iHCECs. كان الحد الأقصى لإطلاق السيتوكين بواسطة iHCECs عند 5 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية. حدث الحد الأقصى لإطلاق السيتوكين ل pHCECs في 20 دقيقة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية.من حيث الكميات الإجمالية من السيتوكينات الالتهابية التي تم إطلاقها ، أطلقت pHCECs عددا أكبر بكثير من إنترلوكين -1 بيتا وإنترلوكين 8 و TNF-alpha من iHCECs ، في حين أطلقت iHCECs المزيد من الإنترلوكين 6. أظهرت كل من pHCECs و iHCECs تغيرا في إطلاق الإنترلوكين 6 بعد التعرض لجميع المواد الكيميائية الثلاث. تسبب BAK في انخفاض في إطلاق الإنترلوكين 6 مقارنة بالتحكم لكل من HCECs الأولية والخالدة.تسبب بيروكسيد الهيدروجين في زيادة إطلاق الإنترلوكين 6 من iHCECs ، وانخفاض في الإطلاق من pHCECs. تضررت كل من pHCECs و iHCECs بشكل كبير عند 0.005٪ و 0.1٪ من BAK. بعد إجراء تقييمات في المختبر لسمية خلايا العين ، يمكن إجراء المزيد من النماذج الحيوانية لسمية العين لتحديد تأثير منتج العين على أعصاب القرنية أو الجهاز المناعي للعين.هذه التقنيات ضرورية لتحديد آليات السمية الكيميائية وصياغة المنتج على العين وستساعد في تقليل استخدام الحيوانات لاختبار تطوير المنتج.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

الإنسان الشعبي الأساسي الخلايا الظهارية نمت من Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

تحليل سكاب<em&gt; N</em&gt; -glycosylation والاتجار في الخلايا البشرية

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

نموذج القُزلة السنخية البشرية متعددة الخلايا يتكون من الخلايا الظهارية والخلايا المناعية الأولية لتقييم المخاطر

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...