Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Forfatterne modtog ingen finansiering til dette arbejde.

1. Dyrkning af pHCEC'er og iHCEC'er
<ol><li>Dyrk pHCEC'erne og iHCEC'erne i humant okulært epitelmedium (HOEM) med følgende kosttilskud: 6 mM L-glutamin, 0,002% cellemedietilskud O (materialefortegnelse), 1,0 μM adrenalin, 0,4% cellemedietilskud P (materialetabel), 5 μg / ml rh-insulin, 5 μg / ml apo-transferrin og 100 ng / ml hydrocortisonhemisuccinat i kollagen-1-belagte kulturkolber (18 ml i en 75 cm2 kulturkolbe).</li>
	<li>Skift mediet i kolberne hver 2-3 dage ved ...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

Potentielle forskelle i anvendelsen af to typer HCEC'er blev vurderet. Celler blev placeret i samme medium (HOEM) i identiske koncentrationer af celler og derefter udsat for korte og lange perioder med UV-stråling og tre okulære toksiner. Doser af UV-stråling og kemikalier blev valgt ud fra deres fysiologiske virkninger, som var skadelige nok for cellerne til at producere mellemliggende reaktioner, der kunne sammenlignes. Eksponeringstider på 5 og 20 minutter for UV-stråling og 5 og 15 minutter for de udvalgte doser...

In vitro toksikologiundersøgelser udføres for at forudsige de toksiske virkninger af kemikalier og andre stoffer, der kan forårsage skade på celler. Ved vurderingen af toksicitet for hornhinden er humane hornhindeepitelceller (HCEC) blevet anvendt i modeller til evaluering af disse virkninger 1,2,3,4. Disse modeller evaluerer typisk fysiologiske effekter såsom ændringer i cellens metaboliske aktivitet, celleproliferation og andre cellefunktioner såsom produktion og frigivelse af inflammatoriske cytokiner. Til disse toksikologiundersøgelser er celler fra forskellige kilder blevet udvalgt til at vurdere kemikaliers og UV-strålings skadelige virkninger på HCECs 2,3. pHCEC-linjer er tilgængelige fra virksomheder, der leverer disse celler fra donorvæv hos voksne. Primære celler kan behandles med dispase og forsigtigt skrabes af hornhinden til dyrkning5. Cellerne testes derefter for virus og kontaminering og sendes derefter kryopræserveret i 10% dimethylsulfoxid.
Fordelen ved primære cellelinjer er, at cellerne er genetisk identiske med donorens celler. Dette er ideelt, da en in vitro-model skal efterligne in vivo-vævet så meget som muligt. Ulempen ved primære cellelinjer er, at de har et begrænset antal celledelinger eller passager6. Det begrænsede antal celler, der er til rådighed, begrænser antallet af eksperimenter, der kan udføres med en enkelt primærkultur, hvilket øger omkostningerne ved eksperimenterne.
Udødeliggjorte cellelinjer er også blevet anvendt i cellekultur toksicitetsmodeller. I modsætning til den primære cellelinje opnået fra in vivo-væv er den udødeliggjorte cellelinje imidlertid blevet genetisk ændret. Udødeliggjorte celler skabes ved at inkorporere generne fra en virus i DNA'et i primære celler 6,7,8. Celler med vellykket viral geninkorporering vælges til den udødeliggjorte cellelinje. Fordelen ved udødeliggørelse er, at det giver mulighed for ubestemt hurtig spredning, hvilket giver et ubegrænset antal celler til at udføre flere eksperimenter ved hjælp af den samme cellelinje. Dette giver mulighed for konsistens mellem eksperimenter og reducerer omkostningerne.
Ud over ændringer i generne, der begrænsede celleproliferationen, kunne der også forekomme ændringer i ekspressionen af gener med kritisk funktionalitet9. Derfor er ulempen ved at bruge udødeliggjorte celler, at de muligvis ikke længere repræsenterer de originale in vivo-celler med hensyn til deres reaktion på forskellige eksterne stimuli10. Sammenligninger har involveret observation af kemikaliers toksiske virkninger på primære og udødeliggjorte humane hornhindekeratocytter11 samt udødeliggjorte HCEC'er og kaninhornhindepitelprimærceller12. Sammenligningen mellem toksiners virkninger på primære humane keratocytter og udødeliggjorte keratocytter viste ingen signifikante forskelle11. Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne artikel, bestemmes effektiviteten af disse assays til vurdering af toksiciteten af UV-stråling og okulære toksiner på pHCEC'er og iHCEC'er.
Tre okulære toksiner, der almindeligvis anvendes i in vitro-assays, blev udvalgt: BAK,H2O2og SDS. BAK er et kationisk konserveringsmiddel, der almindeligvis anvendes i oftalmiske opløsninger 13,14,H2O2bruges almindeligvis til at desinficere kontaktlinser 15, og SDS er et anionisk overfladeaktivt middel, der findes i vaskemidler og shampoo 14. I lighed med okulære toksiner kan UV-stråling også forårsage betydelig skade på HCEC'er3. Derudover kan overeksponering for UV forårsage en okulær tilstand kendt som fotokeratitis karakteriseret ved symptomer på rive, lysfølsomhed og en følelse af grynhed16.
Der er et ubegrænset antal primære cellekulturer, der kan bruges, og forskellige udødeliggjorte cellelinjer, der er blevet udviklet. Derfor blev der foretaget en undersøgelse for at sammenligne primære HCEC'er med en udødeliggjort HCEC-linje for at bestemme ligheder og forskelle mellem modeller, der inkorporerer disse typer celler.
Denne undersøgelse brugte mikroskopi til at vurdere mulige forskelle mellem pHCEC'er og iHCEC'er på cellefysiologisk respons på UV og toksiner. Virkningerne af UV-stråling og kemikalier på cellemetabolisk aktivitet og inflammatorisk cytokinfrigivelse for de to cellelinjer blev også evalueret. Vigtigheden af at bestemme forskellene mellem de to cellelinjer er at forstå den optimale anvendelse af disse cellelinjer til evaluering: 1) effekten af UV-stråling på celler, 2) virkningerne af toksiner på celler og 3) de resulterende ændringer i metabolisme, cellelevedygtighed og cellecytokinfrigivelse til fremtidige undersøgelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

Denne artikel beskriver metoderne til måling af toksiciteten af ultraviolet (UV) stråling og okulære toksiner på primære (pHCEC) og udødeliggjorte (iHCEC) humane hornhindeepitelcellekulturer. Celler blev udsat for UV-stråling og toksiske doser af benzalkoniumchlorid (BAK), hydrogenperoxid (H2O2) og natriumdodecylsulfat (SDS). Metabolisk aktivitet blev målt ved hjælp af et metabolisk assay. Frigivelsen af inflammatoriske cytokiner blev målt ved anvendelse af et multi-plex interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 og tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) assay, og celler blev evalueret for levedygtighed ved anvendelse af fluorescerende farvestoffer.
De skadelige virkninger af UV på cellemetabolisk aktivitet og cytokinfrigivelse forekom ved 5 minutters UV-eksponering for iHCEC og 20 minutter for pHCEC. Lignende procentvise fald i metabolisk aktivitet af iHCEC og pHCEC opstod efter eksponering for BAK,H2O2eller SDS, og de mest signifikante ændringer i cytokinfrigivelse forekom for IL-6 og IL-8. Mikroskopi af fluorescerende farvede iHCEC- og pHCEC BAK-eksponerede celler viste celledød ved 0,005% BAK-eksponering, selvom graden af ethidiumfarvning var større i iHCEC'erne end pHCEC'erne. Ved hjælp af flere metoder til vurdering af toksiske virkninger ved hjælp af mikroskopi, vurderinger af metabolisk aktivitet og cytokinproduktion kunne toksiciteten af UV-stråling og kemiske toksiner bestemmes for både primære og udødeliggjorte cellelinjer.

Cellestørrelse De primære og udødeliggjorte HCEC'er blev visualiseret med tre fluorescerende farvestoffer, som afspejler tre forskellige stadier af cellelevedygtighed. Levende celler er grønne (calcein-AM), døde celler er røde (ethidium homodimer-1), og apoptotiske celler er gule (annexin V-computerjusteret farve for bedre visualisering af fluorescenssignalet). Levende celler indeholder esteraser i cellecytoplasmaet og konverterer calcein-AM til calcein. Døde celler har cellemembraner, der er g...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Denne artikel beskriver de procedurer, der anvendes til at evaluere toksiciteten af UV-stråling og kemiske toksiner på en primær og udødeliggjort cellelinje.

Bestemmelse af toksiciteten af UV-stråling og kemikalier på primære og udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Denne metode kan anvendes til in vitro at evaluere toksiciteten af nye oftalmologiske produktformuleringer. Ved at forfine koncentrationerne af kemikalier og produktformuleringer ved hjælp af øjenceller in vitro kan brugen af dyr til vurdering af ny produktsikkerhed minimeres. In vitro-assays evaluerer toksicitetsendepunkter, der ikke kan vurderes in vivo, såsom bestemmelse af et kemikalies virkning på mitokondriefunktion, cellemembranintegritet og enzymaktivitet.Evaluer celletoksicitet in vitro er nøglen til at forstå potentielle toksicitetsmekanismer. Dette er afgørende for at etablere en maksimal tolerabel dosis af terapeutiske kemikalier i øjet. Demonstration af proceduren vil være Nijani Nagaarudkumaran, en forsker fra Jones Laboratory.Begynd med at placere både pHCEC'er og iHCEC'er på kollagenbelagte petriskåle med glasbunddæksler i en koncentration på 1 x 10 til 5. med 1 ml humant okulært epitelmedium eller HOEM. Dyrk pHCEC'er og iHCEC'er 1 sæt kulturer i 24 timer og et andet sæt i 48 timer i en 37-graders Celsius-inkubator med 5% kuldioxid. Efter inkubation plettes cellerne med 500 mikroliter annexinfarvningsbufferopløsning indeholdende 4 mikromolær calcein, 8 mikromolær ethidiumhomodimer 1 og annexin 5 i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Efter farvning af cellerne skal du justere det konfokale laserscanningsmikroskop for at fange excitations- og emissionsbølgelængderne som beskrevet i tekstmanuskriptet. Få de todimensionelle og tredimensionelle billeder ved at følge instruktionerne i manuskriptet. Frø cellerne ved 5 x 10 til 4. pr. milliliter HOEM i hver brønd i en 24-brønds kollagen 1-belagt kulturplade og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 3 timer.Efter inkubation reduceres volumenet af mediet i brøndene til 300 mikroliter. Udsæt derefter cellerne for UVA-stråling ved 6,48 watt pr. Kvadratmeter og UVB-stråling ved 1,82 watt pr. Kvadratmeter ved 37 grader Celsius i 5 og 20 minutter i separate eksperimenter. Efter UV-stråling tilsættes 200 mikroliter frisk HOEM til hver brønd og inkuberes i 20 timer ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Den næste dag samles cellesupernatanten i hvert hul og overføres til sterile 2 ml polypropylenrør. Supernatanten fryses ved minus 80 grader Celsius. For at bestemme cytokinniveauerne frigivet af pHCEC'erne og iHCEC'erne efter UV-eksponering skal du bruge et multiplexcytokinassay og følge sættets instruktioner for at kvantificere interleukin 6, interleukin 8, interleukin-1 beta og TNF-alfa.Forbered 10% metabolisk assayreagens i DMEM og F12. Udskift dyrkningsmediet i hvert hul med 1 ml af 10% metabolisk assayopløsning og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 4 timer. Mål fluorescensen af hver opløsning ved hjælp af en fluorescerende pladelæser ved 530 nanometer excitation og 590 nanometer emissionsbølgelængder.Frøceller ved 5 x 10 til den fjerde pr. milliliter HOEM i hver brønd i en 24-brønds kollagen 1-belagt kulturplade. Inkuber ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 3 timer. Efter inkubation fjernes mediet og udsættes cellerne for 1 milliliter kemiske toksiner, som omfatter 0,001% benzalkoniumchlorid eller BAK, 0,01% hydrogenperoxid og 0,0025% natriumdodecylsulfat i PBS i 5 og 15 minutter.Efter eksponering for de kemiske toksiner fjernes toksinerne fra brøndene, skylles med 1 ml PBS, og der tilsættes 1 ml HOEM til hvert hul. Efter 20 timers inkubation udføres et metabolisk assay ved at erstatte mediet med 1 ml af en 10% metabolisk analyseopløsning og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 4 timer. Mål fluorescensen af hver opløsning ved hjælp af en fluorescerende pladelæser ved 530 nanometer excitation og 590 nanometer emissionsbølgelængder.Cellesupernatanterne overføres fra hullerne efter 20 timers inkubation til separate sterile 2 ml polypropylenrør og fryses ved minus 80 grader Celsius. Brug den samme multiplexplatform, der bruges til at vurdere cytokinerne fra de UV-behandlede celler efter sættets instruktioner til kvantificering af interleukin 6, interleukin 8, interleukin-1 beta og TNF-alfa. Frøceller ved 1 x 10 til 5. pr. milliliter HOEM i hver brønd i en 24-brønds kollagen 1-belagt kulturplade og inkuberes ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 24 timer.Efter inkubation fjernes mediet og udsætter cellerne for 1 milliliter kemiske toksiner, herunder 0,001% BAK, 0,005% BAK og 0,01% BAK i PBS i 5 minutter. Efter eksponering fjernes de kemiske toksiner, skylles brøndene med 1 ml PBS og tilsættes 1 ml HOEM til hver brønd. Efter 20 timers inkubation plettes cellerne med 500 mikroliter annexinfarvningsbufferopløsning indeholdende calcein, ethidiumhomodimer og annexin 5 i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Juster mikroskopet for at måle intensiteter ved excitations- og emissionsbølgelængder på 630 og 675 nanometer for annexin 5, 495 og 515 nanometer for calcein AM og 528 og 617 nanometer for ethidium 1-farvning. Derefter erhverver billeder af cellerne ved hjælp af fluorescensmikroskopet. iHCEC'erne viste sig at være små celler, der spænder fra 10 til 20 mikrometer, og pHCEC'erne lå i området 20 til 50 mikrometer efter 24 timers vækst.Lignende forskelle i størrelsesinterval blev observeret for iHCEC'er og pHCEC'er efter 48 timers vækst. Sammenlignet med de ikke-UV-eksponerede celler blev den metaboliske aktivitet af bestrålede pHCEC'er signifikant reduceret efter 20 minutters eksponering. For iHCEC'er faldt metabolisk aktivitet for celler, der blev bestrålet efter både 5 og 20 minutter.Derfor tog det længere eksponeringstid at reducere pHCEC'ernes metaboliske aktivitet end iHCEC'erne. Den maksimale cytokinfrigivelse af iHCEC'erne var ved 5 minutters UV-eksponering. Den maksimale cytokinfrigivelse for pHCEC'er forekom ved 20 minutters UV-eksponering.Med hensyn til samlede mængder af frigivne inflammatoriske cytokiner frigav pHCEC'erne væsentligt mere interleukin-1 beta, interleukin 8 og TNF-alfa end iHCEC'erne, mens iHCEC'erne frigav mere interleukin 6. Både pHCEC'er og iHCEC'er viste en ændring i frigivelsen af interleukin 6 efter eksponering for alle tre kemikalier. BAK forårsagede et fald i frigivelsen af interleukin 6 sammenlignet med kontrollen for både primære og udødeliggjorte HCEC'er.Hydrogenperoxid forårsagede en stigning i frigivelsen af interleukin 6 fra iHCEC'er og et fald i frigivelsen fra pHCEC'er. Både pHCEC'er og iHCEC'er blev signifikant beskadiget med 0,005% og 0,1% af BAK. Efter at have udført in vitro-vurderinger af okulær celletoksicitet kan der foretages yderligere dyremodeller for okulær toksicitet for at bestemme virkningen af et okulært produkt på hornhindenerverne eller det okulære immunsystem.Disse teknikker er afgørende for at bestemme mekanismerne for kemisk og produktformuleringstoksicitet på øjet og vil hjælpe med at minimere brugen af dyr til produktudviklingstest.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrkning af human Nasal epithelialceller på Air Liquid grænseflade

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantificering af endotelcelle Klæbeevne<em&gt; In vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analyse af SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Og handel med humane celler

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Multicellulær human alveolær model sammensat af epitelceller og primære immunceller til farevurdering

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...