Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

De auteurs ontvingen geen financiering voor dit werk.

1. Kweek van pHCECs en iHCECs
<ol><li>Kweek de pHCECs en iHCECs in humaan oculair epitheelmedium (HOEM) met de volgende supplementen: 6 mM L-glutamine, 0,002% celmediasupplement O (materiaaltabel), 1,0 μM epinefrine, 0,4% celmediasupplement P (materiaaltabel), 5 μg/ml rh insuline, 5 μg/ml apo-transferrine en 100 ng/ml hydrocortisonhemisuccinaat in collageen-1 gecoate cultuurkolven (18 ml in een 75 cm2 kweekkolf).</li>
	<li>Verander het medium in de kolven om de 2-3 dagen ...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

Potentiële verschillen in het gebruik van twee soorten HCEC's werden beoordeeld. Cellen werden in hetzelfde medium (HOEM) geplaatst bij identieke concentraties cellen en vervolgens blootgesteld aan korte en lange perioden van UV-straling en drie oculaire toxines. Doses UV-straling en chemicaliën werden geselecteerd op basis van hun fysiologische effecten, die schadelijk genoeg waren voor de cellen om tussenliggende reacties te produceren die konden worden vergeleken. Blootstellingstijden van 5 en 20 min voor UV-stralin...

In vitro toxicologische studies worden uitgevoerd om de toxische effecten van chemicaliën en andere agentia te voorspellen die schade aan cellen kunnen veroorzaken. Bij de beoordeling van de toxiciteit voor het hoornvlies zijn menselijke cornea-epitheelcellen (HCEC's) gebruikt in modellen voor het evalueren van deze effecten 1,2,3,4. Deze modellen evalueren meestal fysiologische effecten zoals veranderingen in de metabole activiteit van de cel, celproliferatie en andere celfuncties zoals de productie en afgifte van inflammatoire cytokines. Voor deze toxicologische studies zijn cellen uit verschillende bronnen geselecteerd om de schadelijke effecten van chemicaliën en UV-straling op HCECs 2,3 te beoordelen. pHCEC-lijnen zijn verkrijgbaar bij bedrijven die deze cellen leveren uit donorweefsels van volwassenen. Primaire cellen kunnen worden behandeld met dispase en voorzichtig van het hoornvlies worden geschraapt voor kweek5. De cellen worden vervolgens getest op virussen en besmetting en vervolgens gecryopreserveerd in 10% dimethylsulfoxide.
Het voordeel van primaire cellijnen is dat de cellen genetisch identiek zijn aan de cellen van de donor. Dit is ideaal, omdat een in vitro model het in vivo weefsel zoveel mogelijk moet nabootsen. Het nadeel van primaire cellijnen is dat ze een beperkt aantal celdelingen of passages hebben6. Het beperkte aantal beschikbare cellen beperkt het aantal experimenten dat kan worden uitgevoerd met een enkele primaire cultuur, waardoor de kosten van de experimenten stijgen.
Vereeuwigde cellijnen zijn ook gebruikt in celkweektoxiciteitsmodellen. In tegenstelling tot de primaire cellijn verkregen uit in vivo weefsel, is de vereeuwigde cellijn echter genetisch veranderd. Vereeuwigde cellen worden gemaakt door de genen van een virus op te nemen in het DNA van primaire cellen 6,7,8. Cellen met succesvolle virale genintegratie worden geselecteerd voor de vereeuwigde cellijn. Het voordeel van onsterfelijkheid is dat het onbeperkte snelle proliferatie mogelijk maakt, waardoor een onbeperkt aantal cellen meerdere experimenten kan uitvoeren met dezelfde cellijn. Dit zorgt voor consistentie tussen experimenten en verlaagt de kosten.
Naast veranderingen in de genen die de celproliferatie beperkten, konden ook veranderingen in de expressie van genen met kritische functionaliteit optreden9. Daarom is het nadeel van het gebruik van onsterfelijke cellen dat ze mogelijk niet langer de oorspronkelijke in vivo cellen vertegenwoordigen in termen van hun reactie op verschillende externe stimuli10. Vergelijkingen hebben betrekking op het observeren van de toxische effecten van chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke corneale keratocyten11, evenals onsterfelijke HCECs en primaire cellen van konijnenhoornvliesepitheel12. De vergelijking tussen de effecten van toxines op primaire menselijke keratocyten en vereeuwigde keratocyten toonde geen significante verschillen11. Met behulp van de methoden die in dit artikel worden beschreven, zal de effectiviteit van deze testen om de toxiciteit van UV-straling en oculaire toxines op pHCECs en iHCECs te beoordelen, worden bepaald.
Drie oculaire toxines die vaak worden gebruikt in in vitro assays werden geselecteerd: BAK, H 2 O2en SDS. BAK is een kationisch conserveermiddel dat vaak wordt gebruikt in oogheelkundige oplossingen 13,14, H 2 O2wordt vaak gebruikt om contactlenzen te desinfecteren 15 en SDS is een anionogene oppervlakteactieve stof die wordt aangetroffen in detergentia en shampoos 14. Net als oculaire toxines kan UV-straling ook aanzienlijke schade aan HCECs3 veroorzaken. Bovendien kan overmatige blootstelling aan UV een oculaire aandoening veroorzaken die bekend staat als fotokeratitis en wordt gekenmerkt door symptomen van scheuren, lichtgevoeligheid en een gevoel van korreligheid16.
Er is een onbeperkt aantal primaire celculturen die kunnen worden gebruikt en verschillende vereeuwigde cellijnen die zijn ontwikkeld. Daarom werd een onderzoek uitgevoerd om primaire HCEC's te vergelijken met een vereeuwigde HCEC-lijn om overeenkomsten en verschillen te bepalen tussen modellen die dit soort cellen bevatten.
Dit onderzoek gebruikte microscopie om mogelijke verschillen tussen pHCECs en iHCECs op celfysiologische respons op UV en toxines te beoordelen. De effecten van UV-straling en chemicaliën op de metabole activiteit van cellen en de inflammatoire cytokine-afgifte voor de twee cellijnen werden ook geëvalueerd. Het belang van het bepalen van de verschillen tussen de twee cellijnen is om het optimale gebruik van deze cellijnen te begrijpen voor het evalueren van: 1) het effect van UV-straling op cellen, 2) de effecten van toxines op cellen en 3) de resulterende veranderingen in metabolisme, levensvatbaarheid van cellen en celcytokine-afgifte voor toekomstige studies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

Dit artikel beschrijft de methoden voor het meten van de toxiciteit van ultraviolette (UV) straling en oculaire toxines op primaire (pHCEC) en vereeuwigde (iHCEC) menselijke cornea-epitheelcelculturen. Cellen werden blootgesteld aan UV-straling en toxische doses benzalkoniumchloride (BAK), waterstofperoxide (H 2 O2) en natriumdodecylsulfaat (SDS). De metabole activiteit werd gemeten met behulp van een metabole test. De afgifte van inflammatoire cytokines werd gemeten met behulp van een multi-plex interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-8 en tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) assay, en cellen werden geëvalueerd op levensvatbaarheid met behulp van fluorescerende kleurstoffen.
De schadelijke effecten van UV op de metabole activiteit van cellen en de afgifte van cytokines traden op bij 5 minuten UV-blootstelling voor iHCEC en 20 minuten voor pHCEC. Vergelijkbare procentuele dalingen in metabole activiteit van de iHCEC en pHCEC traden op na blootstelling aan BAK, H 2 O2of SDS, en de meest significante veranderingen in cytokineafgifte traden op voor IL-6 en IL-8. Microscopie van fluorescerend gekleurde iHCEC- en pHCEC BAK-blootgestelde cellen toonde celdood bij 0,005% BAK-blootstelling, hoewel de mate van ethidiumkleuring groter was in de iHCECs dan pHCECs. Met behulp van meerdere methoden voor het beoordelen van toxische effecten met behulp van microscopie, beoordelingen van metabole activiteit en cytokineproductie, kon de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines worden bepaald voor zowel primaire als onsterfelijke cellijnen.

Celgrootte De primaire en vereeuwigde HCEC's werden gevisualiseerd met drie fluorescerende kleurstoffen, die drie verschillende stadia van levensvatbaarheid van cellen weerspiegelen. Levende cellen zijn groen (calceïne-AM), dode cellen zijn rood (ethidium homodimeer-1) en apoptotische cellen zijn geel (annexine V-computer-aangepaste kleur voor een betere visualisatie van het fluorescentiesignaal). Levende cellen bevatten esterasen in het celcytoplasma en zetten calceïne-AM om in calceïne. Dode cell...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Dit artikel beschrijft de procedures die worden gebruikt om de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines op een primaire en onsterfelijke cellijn te evalueren.

Het bepalen van de toxiciteit van UV-straling en chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Deze methode kan worden gebruikt om in vitro de toxiciteit van nieuwe oogheelkundige productformuleringen te evalueren. Door de concentraties van chemicaliën en productformuleringen te verfijnen met behulp van oculaire cellen in vitro, kan het gebruik van dieren voor het beoordelen van nieuwe productveiligheid worden geminimaliseerd. In vitro assays evalueren toxiciteitseindpunten die niet in vivo kunnen worden beoordeeld, zoals het bepalen van het effect van een chemische stof op de mitochondriale functie, celmembraanintegriteit en enzymactiviteit.Het evalueren van celtoxiciteit in vitro is de sleutel tot het begrijpen van potentiële mechanismen van toxiciteit. Dit is essentieel voor het vaststellen van een maximaal aanvaardbare dosis therapeutische chemicaliën in het oog. De procedure wordt gedemonstreerd door Nijani Nagaarudkumaran, een onderzoeker van het Jones Laboratory.Begin met het plaatsen van zowel pHCECs als iHCECs op met collageen gecoate petrischalen met glazen bodembedekking in een concentratie van 1 x 10 tot de 5e met 1 milliliter menselijk oculair epitheelmedium, of HOEM. Kweek pHCECs en iHCECs 1 set culturen gedurende 24 uur en een andere set gedurende 48 uur in een 37-graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxide. Na incubatie kleurt u de cellen met 500 microliter annexinekleuringsbufferoplossing met 4 micromolaire calceïne, 8 micromolaire ethidiumhomodimeer 1 en annexine 5 gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.Nadat u de cellen hebt gekleurd, past u de confocale laserscanmicroscoop aan om de excitatie- en emissiegolflengten vast te leggen, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Verkrijg de tweedimensionale en driedimensionale afbeeldingen volgens de instructies in het manuscript. Zaai de cellen op 5 x 10 tot de 4e per milliliter HOEM in elk putje van een 24-well collageen 1 gecoate kweekplaat en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 3 uur.Verminder na incubatie het volume van het medium in de putten tot 300 microliter. Stel de cellen vervolgens bloot aan UVA-straling met 6,48 watt per vierkante meter en UVB-straling met 1,82 watt per vierkante meter bij 37 graden Celsius gedurende 5 en 20 minuten in afzonderlijke experimenten. Voeg na UV-straling 200 microliter verse HOEM toe aan elke put en incuber gedurende 20 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Verzamel de volgende dag het celsupernatant in elk putje en breng het over in steriele polypropyleenbuizen van 2 milliliter. Vries het supernatant in bij min 80 graden Celsius. Om de cytokineniveaus te bepalen die vrijkomen door de pHCECs en iHCECs na UV-blootstelling, gebruikt u een multiplex cytokine-assay en volgt u de instructies van de kit om interleukine 6, interleukine 8, interleukine-1 bèta en TNF-alfa te kwantificeren.Bereid 10% metabolisch assay-reagens in DMEM en F12. Vervang het kweekmedium in elke put door 1 milliliter van de 10% metabole testoplossing en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 4 uur. Meet de fluorescentie van elke oplossing met behulp van een fluorescerende plaatlezer op 530 nanometer excitatie en 590 nanometer emissiegolflengten.Zaadcellen op 5 x 10 tot de vierde per milliliter HOEM in elk putje van een 24-well collageen 1 gecoate kweekplaat. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 3 uur. Verwijder na incubatie het medium en stel de cellen bloot aan 1 milliliter chemische toxines, waaronder 0,001% benzalkoniumchloride of BAK, 0,01% waterstofperoxide en 0,0025% natriumdodecylsulfaat in PBS gedurende 5 en 15 minuten.Verwijder na blootstelling aan de chemische toxines de gifstoffen uit de putten, spoel af met 1 milliliter PBS en voeg 1 milliliter HOEM toe aan elke put. Voer na 20 uur incubatie een metabole test uit door het medium te vervangen door 1 milliliter van een 10% metabole testoplossing en gedurende 4 uur bij 37 graden Celsius te broeden met 5% koolstofdioxide. Meet de fluorescentie van elke oplossing met behulp van een fluorescerende plaatlezer bij 530 nanometer excitatie en 590 nanometer emissiegolflengten.Breng de celsupernatanten uit de putten na de 20 uur durende incubatie over in afzonderlijke steriele polypropyleenbuizen van 2 milliliter en vries ze in bij min 80 graden Celsius. Gebruik hetzelfde multiplexplatform dat wordt gebruikt om de cytokines van de UV-behandelde cellen te beoordelen volgens de instructies van de kit om interleukine 6, interleukine 8, interleukine-1 bèta en TNF-alfa te kwantificeren. Zaadcellen op 1 x 10 tot de 5e per milliliter HOEM in elke put van een 24-well collageen 1 gecoate kweekplaat en incuberen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.Verwijder na incubatie het medium en stel de cellen gedurende 5 minuten bloot aan 1 milliliter chemische toxines, waaronder 0,001% BAK, 0,005% BAK en 0,01% BAK in PBS. Verwijder na blootstelling de chemische toxines, spoel de putten af met 1 milliliter PBS en voeg 1 milliliter HOEM toe aan elke put. Na 20 uur incubatie, kleurt u de cellen met 500 microliter annexine kleuringsbufferoplossing met calceïne, ethidiumhomodimeer en annexine 5 gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.Stel de microscoop in om intensiteiten te meten bij excitatie- en emissiegolflengten van 630 en 675 nanometer voor annexine 5, 495 en 515 nanometer voor calceïne AM en 528 en 617 nanometer voor ethidium 1-kleuring. Verkrijg vervolgens beelden van de cellen met behulp van de fluorescentiemicroscoop. De iHCECs bleken kleine cellen te zijn die variëren van 10 tot 20 micrometer en de pHCECs lagen in het bereik van 20 tot 50 micrometer na 24 uur groei.Vergelijkbare verschillen in groottebereik werden waargenomen voor iHCECs en pHCECs na 48 uur groei. Vergeleken met de niet-UV-blootgestelde cellen was de metabole activiteit van bestraalde pHCECs significant verminderd na 20 minuten blootstelling. Voor iHCECs nam de metabole activiteit af voor cellen die na zowel 5 als 20 minuten werden bestraald.Daarom duurde het langer voordat de blootstelling de metabole activiteit van de pHCECs verminderde dan de iHCECs. De maximale cytokineafgifte door de iHCECs was bij 5 minuten UV-blootstelling. De maximale cytokineafgifte voor pHCECs vond plaats na 20 minuten UV-blootstelling.In termen van totale hoeveelheden inflammatoire cytokines die vrijkwamen, gaven de pHCECs aanzienlijk meer interleukine-1 bèta, interleukine 8 en TNF-alfa vrij dan de iHCECs, terwijl de iHCECs meer interleukine 6 vrijgaven. Zowel pHCECs als iHCECs vertoonden een verandering in de afgifte van interleukine 6 na blootstelling aan alle drie de chemicaliën. BAK veroorzaakte een afname van de afgifte van interleukine 6 in vergelijking met de controle voor zowel primaire als onsterfelijke HCEC's.Waterstofperoxide veroorzaakte een toename van de afgifte van interleukine 6 uit iHCECs en een afname van de afgifte van pHCECs. Zowel pHCECs als iHCECs waren significant beschadigd bij 0,005% en 0,1% van BAK. Na het uitvoeren van in vitro beoordelingen van oculaire celtoxiciteit, konden verdere diermodellen van oculaire toxiciteit worden uitgevoerd om het effect van een oculair product op de hoornvlieszenuwen of het oculaire immuunsysteem te bepalen.Deze technieken zijn essentieel voor het bepalen van de mechanismen van chemische en productformuleringstoxiciteit op het oog en zullen helpen het gebruik van dieren voor productontwikkelingstests te minimaliseren.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analyse van de SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation En handel in menselijke cellen

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Meercellige human alveolaire model samengesteld uit epitheelcellen en primaire immuuncellen voor hazard assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...