Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
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Les auteurs n’ont reçu aucun financement pour ce travail.

1. Culture des HCECs et des iHCEC
<ol><li>Cultiver les CSECs et les CSEi dans un milieu épithélial oculaire humain (HOEM) avec les suppléments suivants : 6 mM de L-glutamine, 0,002 % de supplément de milieu cellulaire O (table des matières), 1,0 μM d’épinéphrine, 0,4 % de supplément de milieu cellulaire P (tableau des matériaux), 5 μg/mL d’insuline rh, 5 μg/mL d’apotransférrine et 100 ng/mL d’hémisuccinate d’hydrocortisone dans des flacons de culture enrobés de...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

Les différences potentielles dans l’utilisation de deux types de HCEC ont été évaluées. Les cellules ont été placées dans le même milieu (HOEM) à des concentrations identiques de cellules, puis exposées à de courtes et longues périodes de rayonnement UV et à trois toxines oculaires. Les doses de rayonnement UV et de produits chimiques ont été sélectionnées en fonction de leurs effets physiologiques, qui étaient suffisamment dommageables pour les cellules pour produire des réponses intermédiaires po...

Des études toxicologiques in vitro sont effectuées pour prédire les effets toxiques des produits chimiques et d’autres agents qui peuvent causer des dommages aux cellules. Dans l’évaluation de la toxicité pour la cornée, les cellules épithéliales cornéennes humaines (CSHC) ont été utilisées dans des modèles pour évaluer ces effets 1,2,3,4. Ces modèles évaluent généralement les effets physiologiques tels que les changements dans l’activité métabolique de la cellule, la prolifération cellulaire et d’autres fonctions cellulaires telles que la production et la libération de cytokines inflammatoires. Pour ces études toxicologiques, des cellules provenant de diverses sources ont été sélectionnées pour évaluer les effets nocifs des produits chimiques et du rayonnement UV sur les HCEC 2,3. Les lignées de CSHCp sont disponibles auprès des entreprises qui fournissent ces cellules à partir de tissus de donneurs d’adultes. Les cellules primaires peuvent être traitées avec de la dispase et grattées doucement de la cornée pour la culture5. Les cellules sont ensuite testées pour les virus et la contamination, puis expédiées cryoconservées dans 10% de diméthylsulfoxyde.
L’avantage des lignées cellulaires primaires est que les cellules sont génétiquement identiques aux cellules du donneur. C’est idéal, car un modèle in vitro devrait imiter le tissu in vivo autant que possible. L’inconvénient des lignées cellulaires primaires est qu’elles ont un nombre limité de divisions ou de passages cellulaires6. Le nombre limité de cellules disponibles limite le nombre d’expériences qui peuvent être menées avec une seule culture primaire, ce qui augmente le coût des expériences.
Des lignées cellulaires immortalisées ont également été utilisées dans des modèles de toxicité de culture cellulaire. Cependant, contrairement à la lignée cellulaire primaire obtenue à partir de tissus in vivo, la lignée cellulaire immortalisée a été génétiquement modifiée. Les cellules immortalisées sont créées en incorporant les gènes d’un virus dans l’ADN des cellules primaires 6,7,8. Les cellules avec une incorporation réussie de gènes viraux sont sélectionnées pour la lignée cellulaire immortalisée. L’avantage de l’immortalisation est qu’elle permet une prolifération rapide indéfinie, fournissant un nombre illimité de cellules pour effectuer plusieurs expériences en utilisant la même lignée cellulaire. Cela permet une cohérence entre les expériences et réduit les coûts.
En plus des changements dans les gènes qui limitaient la prolifération cellulaire, des changements dans l’expression des gènes de fonctionnalité critique pourraient également se produire9. Par conséquent, l’inconvénient de l’utilisation de cellules immortalisées est qu’elles peuvent ne plus représenter les cellules in vivo d’origine en termes de réponse à divers stimuli externes10. Les comparaisons ont consisté à observer les effets toxiques des produits chimiques sur les kératocytes cornéens humains primaires et immortalisés11, ainsi que sur les HCEC immortalisés et les cellules primaires épithéliales cornéennes de lapin12. La comparaison entre les effets des toxines sur les kératocytes humains primaires et les kératocytes immortalisés n’a montré aucune différence significative11. À l’aide des méthodes décrites dans cet article, l’efficacité de ces essais pour évaluer la toxicité du rayonnement UV et des toxines oculaires sur les HCECs et les CSCEi sera déterminée.
Trois toxines oculaires couramment utilisées dans les essais in vitro ont été sélectionnées : BAK,H2O2et SDS. BAK est un conservateur cationique couramment utilisé dans les solutions ophtalmiques 13,14,H2O2est couramment utilisé pour désinfecter les lentilles de contact 15, et SDS est un tensioactif anionique présent dans les détergents et shampooings 14. À l’instar des toxines oculaires, les rayons UV peuvent également causer des dommages importants aux HCEC3. De plus, une surexposition aux UV peut provoquer une affection oculaire connue sous le nom de photokératite caractérisée par des symptômes de larmoiement, une sensibilité à la lumière et une sensation de granularité16.
Il existe un nombre illimité de cultures cellulaires primaires qui peuvent être utilisées et diverses lignées cellulaires immortalisées qui ont été développées. Par conséquent, une étude a été entreprise pour comparer les HCEC primaires à une lignée de HCEC immortalisée afin de déterminer les similitudes et les différences entre les modèles qui incorporent ces types de cellules.
Cette étude a utilisé la microscopie pour évaluer les différences possibles entre les CSEp et les CSEi sur la réponse physiologique des cellules aux UV et aux toxines. Les effets du rayonnement UV et des produits chimiques sur l’activité métabolique cellulaire et la libération de cytokines inflammatoires pour les deux lignées cellulaires ont également été évalués. L’importance de déterminer les différences entre les deux lignées cellulaires est de comprendre l’utilisation optimale de ces lignées cellulaires pour évaluer: 1) l’effet du rayonnement UV sur les cellules, 2) les effets des toxines sur les cellules et 3) les changements qui en résultent sur le métabolisme, la viabilité cellulaire et la libération de cytokines cellulaires pour les études futures.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

Cet article décrit les méthodes de mesure de la toxicité du rayonnement ultraviolet (UV) et des toxines oculaires sur des cultures de cellules épithéliales cornéennes humaines primaires (CSHCp) et immortalisées (CSHCi). Les cellules ont été exposées au rayonnement UV et à des doses toxiques de chlorure de benzalkonium (BAK), de peroxyde d’hydrogène (H2O2) et de dodécylsulfate de sodium (SDS). L’activité métabolique a été mesurée à l’aide d’un test métabolique. La libération de cytokines inflammatoires a été mesurée à l’aide d’un test multiplex interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-8 et facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), et la viabilité des cellules a été évaluée à l’aide de colorants fluorescents.
Les effets néfastes des UV sur l’activité métabolique cellulaire et la libération de cytokines se sont produits à 5 minutes d’exposition aux UV pour l’HCi et à 20 minutes pour les HCECp. Des pourcentages similaires de baisse de l’activité métabolique de l’iHCEC et du pHCEC se sont produits après l’exposition au BAK, H2O2 ou SDS, et les changements les plus significatifs dans la libération de cytokines se sont produits pour l’IL-6 et l’IL-8. La microscopie des cellules exposées à des CSHCi et aux CSHCp Baka a montré la mort cellulaire à 0,005 % d’exposition au BAK, bien que le degré de coloration à l’éthidium soit plus élevé dans les CSEi que dans les CSHCp. En utilisant de multiples méthodes d’évaluation des effets toxiques à l’aide de la microscopie, des évaluations de l’activité métabolique et de la production de cytokines, la toxicité du rayonnement UV et des toxines chimiques a pu être déterminée pour les lignées cellulaires primaires et immortalisées.

Taille de la cellule Les HCEC primaires et immortalisés ont été visualisés avec trois colorants fluorescents, qui reflètent trois stades différents de viabilité cellulaire. Les cellules vivantes sont vertes (calcéine-AM), les cellules mortes sont rouges (homodimère-1 d’éthidium) et les cellules apoptotiques sont jaunes (couleur ajustée par ordinateur V-annexine pour une meilleure visualisation du signal de fluorescence). Les cellules vivantes contiennent des estérases dans le cytoplasme ...

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Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Cet article décrit les procédures utilisées pour évaluer la toxicité du rayonnement UV et des toxines chimiques sur une lignée cellulaire primaire et immortalisée.

Détermination de la toxicité du rayonnement UV et des produits chimiques sur les cellules épithéliales cornéennes humaines primaires et immortalisées

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Cette méthode peut être utilisée pour évaluer in vitro la toxicité de nouvelles formulations de produits ophtalmiques. En affinant les concentrations de produits chimiques et de formulations de produits à l’aide de cellules oculaires in vitro, l’utilisation d’animaux pour évaluer l’innocuité de nouveaux produits peut être minimisée. Les essais in vitro évaluent les paramètres de toxicité qui ne peuvent pas être évalués in vivo, comme la détermination de l’effet d’un produit chimique sur la fonction mitochondriale, l’intégrité de la membrane cellulaire et l’activité enzymatique.Évaluer la toxicité cellulaire in vitro est essentiel pour comprendre les mécanismes potentiels de toxicité. Ceci est essentiel pour établir une dose maximale tolérable de produits chimiques thérapeutiques dans l’œil. Nijani Nagaarudkumaran, un chercheur du Jones Laboratory, fera la démonstration de la procédure.Commencez par placer les HCECs et les iHCEC sur des boîtes de Petri recouvertes de collagène avec des couvercles inférieurs en verre à une concentration de 1 x 10 à la 5ème avec 1 millilitre de milieu épithélium oculaire humain, ou HOEM. Cultiver des pHCEC et des iHCEC 1 ensemble de cultures pendant 24 heures et un autre ensemble pendant 48 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après incubation, colorer les cellules avec 500 microlitres de solution tampon de coloration à l’annexine contenant 4 calcéines micromolaires, 8 micromolaires d’homodimère d’éthidium 1 et d’annexine 5 pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.Après avoir coloré les cellules, ajustez le microscope confocale à balayage laser pour capturer les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, comme décrit dans le manuscrit. Obtenez les images bidimensionnelles et tridimensionnelles en suivant les instructions du manuscrit. Ensemencer les cellules à 5 x 10 à 4 par millilitre de HOEM dans chaque puits d’une plaque de culture recouverte de collagène 1 à 24 puits et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 3 heures.Après l’incubation, réduisez le volume du milieu dans les puits à 300 microlitres. Ensuite, exposez les cellules au rayonnement UVA à 6,48 watts par mètre carré et au rayonnement UVB à 1,82 watt par mètre carré à 37 degrés Celsius pendant 5 et 20 minutes dans des expériences séparées. Après rayonnement UV, ajoutez 200 microlitres de HOEM frais à chaque puits et incuber pendant 20 heures à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone à 5%.Le lendemain, récupérez le surnageant cellulaire dans chaque puits et transférez-le dans des tubes stériles en polypropylène de 2 millilitres. Congeler le surnageant à moins 80 degrés Celsius. Pour déterminer les niveaux de cytokines libérés par les HCECs et les iHCEC après une exposition aux UV, utilisez un test de cytokines multiplex et suivez les instructions du kit pour quantifier l’interleukine 6, l’interleukine 8, l’interleukine-1 bêta et le TNF-alpha.Préparer le réactif de dosage métabolique à 10% dans DMEM et F12. Remplacer le milieu de culture dans chaque puits par 1 millilitre de la solution de dosage métabolique à 10% et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 4 heures. Mesurer la fluorescence de chaque solution à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes à 530 nanomètres d’excitation et 590 nanomètres d’émission longueurs d’onde.Cellules de semence à 5 x 10 à la quatrième par millilitre de HOEM dans chaque puits d’une plaque de culture enrobée de collagène 1 à 24 puits. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 3 heures. Après l’incubation, retirez le milieu et exposez les cellules à 1 millilitre de toxines chimiques, dont 0,001% de chlorure de benzalkonium, ou BAK, 0,01% de peroxyde d’hydrogène et 0,0025% de dodécylsulfate de sodium dans du PBS pendant 5 et 15 minutes.Après l’exposition aux toxines chimiques, retirez les toxines des puits, rincez avec 1 millilitre de PBS et ajoutez 1 millilitre de HOEM à chaque puits. Après 20 heures d’incubation, effectuer un essai métabolique en remplaçant le milieu par 1 millilitre d’une solution de dosage métabolique à 10 % et en incubant à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 4 heures. Mesurer la fluorescence de chaque solution à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes à une excitation de 530 nanomètres et à des longueurs d’onde d’émission de 590 nanomètres.Transférer les surnageants cellulaires des puits après l’incubation de 20 heures dans des tubes en polypropylène stériles séparés de 2 millilitres et les congeler à moins 80 degrés Celsius. Utilisez la même plateforme multiplex utilisée pour évaluer les cytokines des cellules traitées aux UV en suivant les instructions du kit pour quantifier l’interleukine 6, l’interleukine 8, l’interleukine-1 bêta et le TNF-alpha. Les cellules de graine à 1 x 10 à 5e par millilitre de HOEM dans chaque puits d’une plaque de culture recouverte de collagène 1 à 24 puits et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.Après l’incubation, retirez le milieu et exposez les cellules à 1 millilitre de toxines chimiques, dont 0,001% BAK, 0,005% BAK et 0,01% BAK dans PBS pendant 5 minutes. Après l’exposition, éliminez les toxines chimiques, rincez les puits avec 1 millilitre de PBS et ajoutez 1 millilitre de HOEM à chaque puits. Après 20 heures d’incubation, colorer les cellules avec 500 microlitres de solution tampon de coloration d’annexine contenant de la calcéine, de l’homodimère d’éthidium et de l’annexine 5 pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.Ajuster le microscope pour mesurer les intensités aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 630 et 675 nanomètres pour l’annexine 5, 495 et 515 nanomètres pour la calcéine AM, et 528 et 617 nanomètres pour la coloration à l’éthidium 1. Acquérir ensuite des images des cellules à l’aide du microscope à fluorescence. Les HCEC se sont avérés être de petites cellules allant de 10 à 20 micromètres et les HCEC étaient de l’ordre de 20 à 50 micromètres après 24 heures de croissance.Des différences similaires dans la gamme de taille ont été observées pour les CSEi et les CSEp après 48 heures de croissance. Par rapport aux cellules non exposées aux UV, l’activité métabolique des HCEC irradiés a été considérablement réduite après 20 minutes d’exposition. Pour les HCEC, l’activité métabolique a diminué pour les cellules irradiées à la fois à 5 et 20 minutes.Par conséquent, il a fallu un temps d’exposition plus long pour réduire l’activité métabolique des HCEC que des HCECi. La libération maximale de cytokines par les HCEC a été de 5 minutes d’exposition aux UV. La libération maximale de cytokines pour les HCECs s’est produite après 20 minutes d’exposition aux UV.En termes de quantités totales de cytokines inflammatoires libérées, les CSEp ont libéré beaucoup plus d’interleukine-1 bêta, d’interleukine 8 et de TNF-alpha que les HCECi, tandis que les HCECs ont libéré plus d’interleukine 6. Les CSEp et les HCECs ont montré un changement dans la libération d’interleukine 6 après exposition aux trois produits chimiques. BAK a entraîné une diminution de la libération d’interleukine 6 par rapport au contrôle pour les CSHC primaires et immortalisés.Le peroxyde d’hydrogène a entraîné une augmentation des rejets d’interleukine 6 par les CSHCi et une diminution des rejets de HCEC. Les HCECs et les CSEi ont été significativement endommagés à 0,005 % et 0,1 % des BAK. Après avoir effectué des évaluations in vitro de la toxicité des cellules oculaires, d’autres modèles animaux de toxicité oculaire pourraient être entrepris pour déterminer l’effet d’un produit oculaire sur les nerfs cornéens ou le système immunitaire oculaire.Ces techniques sont essentielles pour déterminer les mécanismes de toxicité des produits chimiques et de la formulation des produits sur l’œil et aideront à minimiser l’utilisation des animaux pour les essais de développement de produits.

Research

JoVE Journal

Biology

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